Sažetak

Pozadina: Zabilježeno je da bi matična mliječ smanjila sintezu melanina i inhibirala ekspresiju proteina i gena povezanih s melanogenezom. U ovoj studiji procjenjujemo antimelanogenu i depigmentirajuću aktivnost 10-hidroksi-2-dekanske kiseline (10-HDA) iz matične mliječi Apis mellifera.

Neka su istraživanja to sugeriralacistanchemože spriječiti starenje kožesmanjenje oksidativnog stresaiupala, a oboje mogu doprinijetibore, tamne mrljei druge znakove starenja. Međutim, nejasno je hoće licistanchelimenkaposvijetliti kožuilismanjiti pigmentaciju. Ukratko, dok cistanche može imati neke blagotvorne učinke na kožu, nije jasno može li se koristiti kao pouzdanizbjeljivanje kožeagent. Uvijek je najbolje konzultirati dermatologa za savjet o sigurnim i učinkovitim načinima njege vaše kože.

Kliknite na Cistanche Tubulosa za izbjeljivanje

Za više informacija:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Metode:U ovoj studiji procjenjujemo aktivnost izbjeljivanja {{0}}HDA u usporedbi s promjenama u aktivnosti intracelularne tirozinaze, sadržaju melanina i razinama proteina povezanih s proizvodnjom melanina u stanicama melanoma B16F1 nakon tretmana s {{4 }}HDA. Nadalje, učinak izbjeljivanja kože procijenjen je primjenom kremastog proizvoda koji sadrži 0,5 posto, 1 posto i 2 posto 10-HDA na kožu miševa (C57BL/6 J) tijekom 3 tjedna kako bi se promatrao učinak DL-a. *-vrijednosti.

Rezultati:Rezultati su pokazali da 10-HDA inhibira ekspresiju MITF proteina (IC50 0.86 mM) u stanicama melanoma B16F1. Western blot analiza otkrila je da 10-HDA inhibira aktivnost tirozinaze i ekspresiju proteina 1 povezanog s tirozinazom (TRP-1), TRP-2 i transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom (MITF) u stanicama melanoma B16F1. Osim toga, 10-HDA primijenjen na kožu miševa pokazuje značajno povećan prosječni indeks izbjeljivanja kože (L vrijednost).

Zaključci:Podaci o validaciji ukazali su na potencijal 10-HDA za upotrebu u suzbijanju pigmentacije kože. 10-HDA se predlaže kao kandidat za inhibiciju melanogeneze, stoga bi se mogao razviti kao kozmetički proizvod za njegu kože.

Ključne riječi:Matična mliječ, 10-hidroksi-2-dekanska kiselina, melanogeneza, izbjeljivanje kože, inhibitor melanogeneze

Pozadina

Matična mliječ (RJ) je izlučevina mlade pčele radilice (Apis mellifera) koju proizvode hipofaringealne i mandibularne žlijezde, pčelinja matica se isključivo njime hranila tijekom svog života [1]. RJ osigurava visoke nutritivne vrijednosti zahvaljujući obilnim količinama proteina, slobodnih aminokiselina, lipida, vitamina i šećera [2, 3]. Bioaktivni proteini RJ su glavni proteini matične mliječi (MRJP), apisimin i rojalizing, koji su pokazali imunoregulacijske i antibakterijske učinke u nekoliko studija [4-6]. 10-hidroksi-2- dekanoična kiselina (10-HDA) bila je glavna masna kiselina u RJ koja ima nekoliko zdravstvenih učinaka za ljude, koja je pokazala antitumorsko, antibakterijsko i imunomodulatorno djelovanje [7 –9]. 10-HDA se nalazi samo u RJ pa se koristi kao pokazatelj kvalitete proizvoda matične mliječi [10, 11]. Nekoliko farmakoloških aktivnosti RJ već je potvrđeno pokusima na životinjama, a farmakološke aktivnosti uključujući antioksidaciju [12, 13], protuupalno [14], antitumorsko [15, 16], antiagenezu [17], antibakterijski [18–20], vazodilatacijski [21, 22], hipertenzivni [21, 22], antihiperkolesterolemijski [23], nefroprotektivni [24] i učinak izbjeljivanja kože [25]. Na temelju njegove hranjive vrijednosti i dobrobiti za ljudsko zdravlje, na tržištu je dostupno sve više komercijalnih RJ proizvoda.

Boja kože životinja i ljudi povezana je sa sadržajem pigmenta melanina u koži. Uloga melanina je zaštititi kožu od oštećenja UV svjetlom, ali prekomjerno nakupljanje melanina uzrokuje ozbiljne kožne poremećaje kao što su promjena boje te pigmentirana i ubrzano starenje kože [26]. Melanin je sintetiziran u melanocitima koji se nalaze u najdubljem sloju epidermisa putem mehanizama melanogeneze [27]. Melanogeneza je složen biosintetski put kojim upravljaju tirozinaza, proteini 1 i 2 povezani s tirozinazom (TRP-1 i TRP-2) i transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom (MITF) [28, 29]. Tirozinaza je enzim koji ograničava brzinu sinteze melanina. Prvi korak u proizvodnji melanina je hidroksilacija L-tirozina u L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) i pretvorba L-DOPA u dopakinon [30]. TRP-2 katalizira proizvodnju 5,6- dihidroksi indol-karboksilne kiseline pretvorene iz dopakroma, a produkt TRP-2, 5,6- dihidroksi indol karboksilne kiseline kao supstrat za TRP-1 pretvoren u indol-5,6-kinon karboksilnu kiselinu, što u konačnici rezultira sintezom melanina [31, 32]. Inhibicija sinteze melanina putem poremećaja melanogeneze bila bi glavni način za sprječavanje ili poboljšanje hiperpigmentiranih poremećaja, poput melazme i staračkih pjega. Stoga bi potraga za potencijalnim, sigurnim i učinkovitim spojem za regulaciju tih čimbenika u melanogenezi bila vrijedna pažnje u medicinskoj i kozmetičkoj industriji [25, 33, 34].

Dokazano je da bi matična mliječ mogla smanjiti sintezu melanina [22], ali glavni aktivni spoj ili mehanizam na kojem se temelji ova aktivnost RJ ostaje nepoznat. U našem prethodnom istraživanju otkrili smo da 10-HDA može inhibirati aktivnost tirozinaze (neobjavljeni podaci). U ovoj studiji dodatno je procijenjen inhibicijski učinak 10-HDA na tirozinazu. In vitro modeli biosinteze melanina korištenjem kulture stanica melanoma B16F10 i životinjskog modela miša s kožnom aplikacijom izvedeni su kako bi se istražio učinak 10-HDA na inhibiranje melanogeneze.

Metode

Priprema 10-HDA iz matične mliječi

Matičnu mliječ pripremila je pčelarska tvrtka Fu-Chang u Hualienu, Tajvan. Ličinke u dobi od 3- dana prebačene su u matičnjake na okvirima, a svaki je okvir sadržavao 30 matičnjaka. Okviri su preneseni u pčelinje saće, a RJ je sakupljen 72 sata nakon prijenosa ličinki. Svaka košnica sadrži otprilike 25000 pčela [35]. Prikupljeni RJ uzorci držani su na -20 stupnjeva do daljnje analize. Matična mliječ (40 g) je refluksirana s metanolom (400 mL × 4 × 30 min), a supernatant je sakupljen centrifugiranjem na 4500 x g tijekom 30 minuta. Supernatant je koncentriran pod sniženim tlakom da se dobije sirovi ekstrakt (10,76 g) nazvan RJM. RJM suspendiran u metanolu pročišćen je kromatografijom na stupcu silikagela (Si02 CC) i zatim eluiran s gradijentima kloroforma i metanola (300:1 do 1:1) kako bi se dobilo deset frakcija analiziranih pomoću TLC. Frakcije 4 i 5 pokazale su značajne mrlje, te su stoga podvrgnute daljnjem pročišćavanju i analizi. Frakcije 4 i 5 opetovano su pročišćene sa SiO2 CC (eluirano s kloroform/metanol, 300:1 do 1:1) i dalje kristalizirane s acetonom kako bi se dobila 10-hidroksi-2-dekanska kiselina ({{32} } HDA). Kemijska struktura pročišćenog produkta potvrđena je analizom NMR i GC-masenog spektra. Kvantitativna analiza 10-HDA određena je tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) s pumpnim sustavom Waters 1525 opremljenim detektorom Water 2489, kolonom RP-8 GP250 (4,6 mm) i Waters 717plus automatski uzorkivač. Mobilna faza bila je otopina metanola (60:40 v/v s ultračistom i deioniziranom vodom) podešena fosfornom kiselinom na pH 2,5, filtrirana kroz membranu (0,45 μm) i degazirana 5 minuta. Brzina protoka mobilne faze je podešena na 1,0 mL/min, a detekcija je izvedena na 225 nm. Sadržaj 10HDA u konačnom pročišćenom uzorku je 90 posto, koji se koristi za daljnju analizu.

Kultura stanica i 10-HDA tretmani

B16F10 stanice melanoma (BCRC broj: 60,031) uzgajane su u Dulbecco modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) dopunjenom s 10 posto (v/v) fetalnog goveđeg seruma na 37 stupnjeva u vlažnom, CO2-kontroliranom (5 posto) inkubatoru . Stanice su nasađene pri odgovarajućoj gustoći stanica u 24-jažicu ili 6-ploču s jažicom. Nakon 1 d inkubacije, stanice su tretirane različitim koncentracijama 10-HDA. Medij je korišten u kontrolnoj skupini umjesto 10-HDA. Nakon toga, stanice su sakupljene i korištene za različite testove.

Mjerenje vitalnosti stanica

Viabilnost stanica mjerena je {{0}}(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5 -difeniltetrazolij bromidom (MTT) testom prema metoda koju su objavili Carmichael i sur. [36]. B16F10 stanice melanoma uzgajane su u DMEM-u koji je sadržavao 10 posto FBS i 1 posto L-glutamina (4 mM) u 5 postotnom CO2 inkubatoru na 37 stupnjeva. Uzgajane stanice (1 × 104 stanica/jažici) nasađene su u 96-ploču s jažicama, 10-HDA (otopljen u dimetil sulfoksidu (DMSO)) razrijeđen s medijem u koncentraciji od 1, 0,5, 0,1 mM i kojična kiselina 1 mM dodani su u jažice. Medij je korišten kao slijepa proba. Nakon 24- h inkubacije na 37 stupnjeva pod 5 posto CO2, medij je uklonjen iz svake jažice, zatim su jažice isprane s PBS (1 M fosfat-pufer fiziološka otopina) dva puta. 200 ul MTT otopine (2 mg/ml) je dodano u svaku jažicu. Reakcija je prekinuta dodavanjem 100 µL DMSO nakon 4- h inkubacije. Apsorbancija svake jažice izmjerena je na 540 nm pomoću čitača imunološkog testa (BIO-TEK, Winooski, VT) [20-23]. Vijabilnost stanica određena je sljedećom jednadžbom: Vijabilnost stanica ( postoci )=[(AB)/ C] × 100 posto, A: volumen apsorbancije uzorka, B: volumen apsorpcije slijepe probe, C: volumen kontrolne apsorpcije.

Mjerenje sadržaja melanina u stanici

Intracelularni sadržaj melanina u stanicama melanoma B16F10 mjeren je modificiranom metodom koju su opisali Bilodeau i sur., [37]. Na kraju uzgoja stanica melanoma B16F10, stanice su sakupljene i isprane PBS-om. Sakupljene stanice su lizirane u hladnom puferu za lizu (20 mM natrijevog fosfata (pH 6,8), 1 posto Tritona X-100, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF), 1 mM etilendiamintetraoctene kiseline (EDTA)). Nakon centrifugiranja na 15,000×g tijekom 30 minuta, peleti su otopljeni u 1 N NaOH koji je sadržavao 20 posto DMSO tijekom 1 sata na 60 stupnjeva. Sadržaj proteina u supernatantu određen je Bradfordovim testom. Izmjerena je apsorbancija na 405 nm, a sadržaj melanina izračunat je u odnosu na poznati standard sintetskog melanina. Razina melanina ( postoci )=[(AB)/ C] × 100 posto; A: volumen apsorbancije uzorka; B: volumen apsorbancije slijepe probe; C: kontrolni volumen apsorbancije.

Mjerenje aktivnosti stanične tirozinaze

Određivanje aktivnosti tirozinaze provedeno je prema metodi koju su prethodno opisali Martinez-Esparza i sur., [38], uz male modifikacije. Stanice melanoma B16F10 lizirane su u 20 mM natrijevog fosfata (pH 6,8), 1 posto Tritona X-100 i 1 mM fenilmetan sulfonil fluorida ili PMSF-a i centrifugirane na 14,000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta. Sadržaj proteina u svakom supernatantu određen je korištenjem Bradfordovog testa s goveđim serumskim albuminom (BSA) kao proteinskim standardom. Aktivnost tirozinaze određena je u reakcijskoj smjesi (1 mL) koja sadrži 50 mM fosfatnog pufera (pH 6,8), 2 mM L DOPA i 300 ug supernatanta proteina. Nakon inkubacije na 37 stupnjeva tijekom 15 minuta, apsorbancija na 475 nm izmjerena je pomoću čitača mikropločica. Aktivnost tirozinaze (postotak)=[(AB)/ C] × 100 posto; A: volumen apsorbancije uzorka; B: volumen apsorbancije slijepe probe; C: kontrolni volumen apsorbancije.

Western blot analiza

Stanice su isprane 3 puta u ledeno hladnom PBS-u i lizirane u RIPA puferu (pH 7,4, 50 mM tris, 0,1 posto SDS, 50 mM NaCl, 1 posto NP-40, 1 mM PMSF, 10 ug/mL aprotinina i 10 ug/mL leupeptina). Alikvot lizata korišten je za određivanje sadržaja proteina metodom Bradfordovog testa uz korištenje goveđeg serumskog albumina kao standarda. Proteini (40 ug) su odvojeni elektroforezom na 10 postotnom SDS poliakrilamidnom gelu i naneseni na Hybond-C Extra nitroceluloznu membranu (Amersham Bioscience, UK). Membrane su blokirane s 5 posto nemasnog mlijeka u tris-puferskoj fiziološkoj otopini (TBS) koja sadrži 10 mM tris-HCl, pH 7,5 i 150 mM NaCl tijekom 30 minuta. MITF, tirozinaza, dopakrom tautomeraza 2 (TRP-2), TRP-1 i -aktin (kao unutarnja kontrola) detektirani su korištenjem zečjih poliklonskih protutijela, redom. Membrane su dalje inkubirane s kozjim poliklonskim sekundarnim protutijelom na zečji IgG-H&L (HRP). Sva vezana antitijela su zatim detektirana pomoću Super Signal® West Pico kemiluminiscentnog supstrata (ECL) (Thermo Scientific). Intenzitet signala svake trake kvantificiran je denzitometarskim sustavom Gel Doc TM / Chemi Doc TM Universal hood II (Bio-Rad) opremljenim integratorom i normaliziran s onim interne kontrole.

Određivanje aktivnosti depigmentacije u miševa

Depigmentirajuća aktivnost ispitana je putem sustava mišjih modela modificiranim protokolom Tai et al. [39]. Studiju je odobrilo Etičko povjerenstvo Nacionalnog sveučilišta Formosa (broj odobrenja: 10,401). Pet tjedana stare ženke crnog miša (C57BL/6 J), težine 20 do 25 g, kupljene su od National Animal Laboratory Center, Taipei. Tijekom svih pokusa, životinje su bile smještene u klimatiziranoj prostoriji s konstantnom temperaturom (25 stupnjeva ± 2 stupnja) i držane u ciklusu svjetlo:tama od 12 sati. Životinje su bile aklimatizirane 7 dana prije pokusa. Nakon brijanja dlake, životinje su dobile 1-dnevni odmor. Uzorci gela koji sadrže 10-HDA pripremljeni su dispergiranjem lijekova u vazelinu. Ukupno četrdeset miševa jednako je podijeljeno u pet skupina i svaka je skupina dvaput dnevno namazana s 0,1 g vazelina (kontrola), 1 posto kojične kiseline u vazelinu, 0,5 posto, 1 posto ili 2 posto 10-HDA u vazelinu . Primjene su trajale 3 tjedna, a indeks izbjeljivanja kože (L vrijednost) mjeren je na istoj površini kože svaki dan s DermaLab® Combo (Cotex Technology, Danska), koji je kolorimetrijski instrument koji koristi bijelu boju visokog intenziteta LED kao izvor svjetlosti. Kolorimetrijski instrument povezan je s računalom [40]. Uzeli smo u obzir samo L parametar, a L-vrijednost bila je relativna svjetlina, u rasponu od potpuno crne (L=0) do potpuno bijele (L=100). Početna L-vrijednost indeksa izbjeljivanja kože ispitana je na koži svakog miša prije nanošenja testiranih tvari.

Statistička analiza

Svi rezultati u ovoj studiji analizirani su korištenjem postupka općeg linearnog modela dostupnog iz softverskog paketa Statistical Analysis System verzija 9.1 (Statistical Analysis System Institute, 2002). Duncanov test višestrukog raspona [41] korišten je za otkrivanje razlika između srednjih vrijednosti tretmana. Svaki eksperiment je proveden u tri primjerka.

Rezultati

Učinak 10-HDA na vitalnost stanica melanoma B16F1

Optimalna doza iz analize stanične viabilnosti pomoću MTT u stanicama melanoma B16F1 prikazana je na slici 1. Jasno je pokazalo da 10-HDA nije bio citotoksičan za stanice melanoma B16F1 pri koncentracijama od 0.1, { {8}}.5 i 1 mM, a kojična kiselina nije bila citotoksična za stanice melanoma u koncentraciji od 1 mM. Preživljavanje stanica značajno se smanjilo (smanjenje od 20 posto) u stanicama melanoma izloženim 1,5 mM 10-HDA (P < 0.05) (podaci nisu prikazani) i 5 mM kojične kiseline. Stoga su u sljedećim pokusima primijenjene koncentracije od 0,1, 0,5, 1 mM 10-HDA i 1 mM kojične kiseline.

Inhibicija aktivnosti tirozinaze i sinteze melanina u stanicama melanoma B16F10 pomoću 10-HDA

Kojična kiselina je učinkovito i dobro poznato sredstvo protiv melanogeneze i korištena je kao pozitivna kontrola u ovoj studiji. 10-HDA je značajno (p < 0.05) potisnuo sintezu melanina i aktivnost tirozinaze u usporedbi s kontrolom netretiranih stanica melanoma B16F1. U dozi od 1 mM, 10- HDA je izazvao 28 ± 2,4 posto smanjenja aktivnosti stanične tirozinaze (P < 0.01) i 40.4 ± 3 0 postotno smanjenje stanične sinteze melanina (P < 0,001), dok je kojična kiselina (1 mM) također značajno smanjila aktivnost tirozinaze i sintezu melanina za 14,4 ± 3,7 posto (P < 0,05) i 19,3 ± 1,5 posto (P < 0,001), odnosno (Slike 2 i 3).

Supresija ekspresije proteina tirozinaze, TRP-1 i TRP-2 u stanicama melanoma B16F10 pomoću 10-HDA

Kako bi se istražilo može li 10-HDA utjecati na ekspresiju melanogenog proteina, provedena je Western blotting analiza upotrebom lizata stanica melanoma B16F10 tretiranih 10-HDA (Slika 4). 10-HDA dramatično je inhibirao ekspresiju tirozinaze, TRP-1 i TRP-2 u stanicama melanoma B16F1 u usporedbi s onima u netretiranim stanicama (Slika 4b–d). -aktin, kućni protein koji je korišten kao interna kontrola, nije pokazao nikakve promjene. 10-HDA inhibira razine ekspresije proteina melanogenih enzima sličnih kojičnoj kiselini.

Inhibicijski učinak 10-HDA na razinu proteina povezanu s melanogenim čimbenicima u stanicama B16F10

Tijekom procesa melanogeneze u stanicama sisavaca, MITF igra glavnu ulogu regulatora u sintezi puta TRP-a, uključujući TYR, TRP{{0}} i TRP-2 [25, 26]. Učinak 10-HDA na ekspresiju MITF procijenjen je pomoću Western blottinga. B16F1{{10}} stanice melanoma bile su izložene različitim koncentracijama 10- HDA (0,1, 0,5 i 1 mM), što je rezultiralo smanjenom regulacijom ekspresije MITF pomoću 10-HAD ( Slika 4e). Vrijednost IC50 za 10-HDA supresiju ekspresije MITF procijenjena je na 0.86 mM. Sadašnji rezultati sugeriraju da su razine MITF proteina smanjene 10-HDA. Učinak hipopigmentacije 10-HDA može biti rezultat smanjene ekspresije gena MITF, koja bi potom potisnula ekspresiju proteina i gena tirozinaze, TRP-1 i TRP-2.

Procjena aktivnosti depigmentacije 10-HDA in vivo putem miševa

Kako bismo spekulirali o dozi za ljude, upotrijebili smo miševe kao životinjski model za istraživanje aktivnosti depigmentacije {{0}}HDA. Nakon brijanja, miševi su tretirani s 1 posto kojične kiseline u vazelinu, 0.5 posto, 1 posto ili 2 posto 10-HDA u vazelinu, te je izmjeren i zabilježen indeks posvjetljivanja kože. Za ovu in vivo studiju koristili smo kojičnu kiselinu kao pozitivnu kontrolu. Kojična kiselina naširoko se koristi kao sredstvo za terapiju depigmentacije kože diljem svijeta. Nakon prvog tjedna tretmana, stupanj izbjeljivanja kože značajno je povećan kod miševa tretiranih s 10- HDA, u usporedbi s kontrolom, i taj se porast nastavio do kraja eksperimenta. Aktivnost depigmentacije 0.5, 1 i 2 posto 10-HDA bila je usporediva s onom 1 posto kojične kiseline. Naši su rezultati otkrili da je 10-HDA bio u mogućnosti značajno pospješiti izbjeljivanje kože na koži miševa pri samo niskoj koncentraciji od 0,5 posto (slika 5). Stoga se 10-HDA čini dobrim kandidatom kao sredstvo za izbjeljivanje kože za liječenje hiperpigmentacije kože.

Rasprava

Sintezu melanina kontrolira složena enzimska kaskada tirozinaze, TRP1 i TRP2. Stupanj inhibicije gena i proteina povezanih s melanogenezom igra važnu ulogu u učinkovitosti sredstva za depigmentaciju, koje se obično koristi u liječenju hiperpigmentacije ili u kozmetičkim proizvodima [28]. Kako bi se razjasnio pravi inhibitorni učinak 10-HDA na melanogenezu, sadržaj melanina i unutarstanična aktivnost tirozinaze stanica B16F10 ispitani su u istom rasponu koncentracija. Rezultati na sl. 2 i 3 pokazuju da je 10-HDA pokazao veću inhibicijsku aktivnost na sintezu melanina u stanicama B16F10 nego kojična kiselina. Podaci su otkrili da 10- HDA blokira melanogenezu u stanicama melanoma B16F10.

Melanogenezom dominiraju najmanje tri regulatorna proteina, tirozinaza, TRP1 i TRP2 u melanocitima sisavaca [29]. Ekspresija TRP-1, TRP-2 i MITF bila je inhibirana u stanicama melanoma B16F10, koje su tretirane 10-HDA. MITF je glavni faktor transkripcije za regulaciju ekspresije melanogenih enzima, kao što su tirozinaza, TRP-1 i TRP-2 [42, 43]. Prema našim podacima Western blottinga (slika 4), stanice sisavaca tretirane s 10-HDA smanjile bi ekspresiju svih enzima koji ograničavaju brzinu, uključujući tirozinazu, TRP-1 i TRP-2 , i spriječi abnormalno nakupljanje melanina tijekom procesa melanogeneze. Ovi podaci sugeriraju da 10- HDA može inhibirati proces melanogeneze inhibiranjem ekspresije MITF-a. U ovoj smo studiji pokazali da 10-HDA inhibira melanogenezu smanjenjem proizvodnje MITF proteina, tirozinaze i melanina. Inhibicijski put 10-HDA na ekspresiju MITF-a bio je drugačiji od ostalih inhibitora melanogeneze, kao što su kojična kiselina, arbutin i askorbinska kiselina, koji nisu utjecali na ekspresiju MITF-a [44, 45]. To sugerira da 10-HDA ima izvrstan potencijal da se koristi kao sigurno i prirodno sredstvo za izbjeljivanje kože u funkcionalnoj kozmetici [46].

Melanom, rak kože nastaje malignom transformacijom melanocita. Melanomi koji nastaju na koži kronično oštećenoj suncem, površinama sluznice i akralnoj koži uzrokovani su prekomjernom aktivacijom BRAF i NRAS [47], gubitkom lokusa CDKN2A [48], prekomjernom ekspresijom MITF [49], prekomjernom aktivacijom Kita [50]. ], prekomjerno aktivirati mGluR1 [51, 52]…et al. U ovoj studiji, 10-HDA može inhibirati ekspresiju MITF-a u stanicama melanoma B16F10. To je pokazalo da 10-HDA ima potencijal biti sastojak za dermalni lijek ili lijek protiv raka protiv melanoma.

RJ se koristi za mnoge dermatološke pripravke uključujući osvježenje kože, regeneraciju kože, pomlađivanje, zacjeljivanje opeklina ili zacjeljivanje rana [53, 54]. Štoviše, objavljeno je da neke nezasićene masne kiseline u RJ mogu inhibirati sintezu melanina i aktivnost tirozinaze, dovodeći do smanjene regulacije melanogeneze [55], a mi smo pokazali da učinak depigmentacije RJ može biti rezultat prisutnosti {{3 }}HDA. Budući da je koža miševa slična ljudskoj, koristili smo miševe kao životinjski model in vivo za ispitivanje depigmentacijske aktivnosti 10-HAD. Kao što je prikazano na slici 5, indeks izbjeljivanja kože za boju kože bio je značajno povećan kod miševa tretiranih s 10-HAD, u usporedbi s kontrolom. Osim toga, Koya-Miyata et al. procijenili su aktivnost promicanja proizvodnje kolagena 10-HDA u linijama stanica fibroblasta koje proizvode transformirajući faktor rasta- 1 (TGF- 1), koji je važan čimbenik za proizvodnju kolagena [55] . Stoga se 10-HDA čini prirodnim spojem koji vrlo obećava za regeneraciju kože i liječenje hiperpigmentacije.

Zaključak

10-HDA inhibira ne samo aktivnost tirozinaze nego i ekspresiju melanogenih enzima, uključujući tirozinazu, TRP-1 i TRP-2, potiskivanjem MITF-a u stanicama melanoma B16F10. Posljedično, pigment melanina je smanjen u stanicama melanoma B16F10. Nadalje, životinjski model in vivo pokazao je depigmentirajuću aktivnost 10-HDA pri lokalnoj primjeni. Ovi rezultati sugeriraju da 10-HDA ima kandidata koji bi mogao biti siguran i prirodan inhibitor melanogeneze za kozmetičku industriju, u kojoj je potraga za prirodnim i učinkovitim spojem jedan od vrlo važnih ciljeva za razvoj boljeg proizvoda za njegu kože .

Kratice

10-HDA: 10-hidroksi-2-dekanska kiselina; BSA: albumin goveđeg seruma; DMEM: Dulbeccov modificirani Eagleov medij; DMSO: dimetil sulfoksid; EDTA: etilendiamintetraoctena kiselina; L-DOPA: L-3,4- dihidroksifenilalanin; MITF: transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom; MRJP: glavni proteini matične mliječi; MTT: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolijev bromid; PBS: fiziološka otopina fosfatnog pufera; PMSF: fenilmetan sulfonil fluorid ili fenilmetilsulfonil fluorid; TLC: tankoslojna kromatografija; TRP-1: protein 1 povezan s tirozinazom; TRP- 2: protein 2 povezan s tirozinazom

Priznanja

Zahvaljujemo gospođi Li-Yu Lee iz pčelarstva Fu-Chang na pripremi matične mliječi

Financiranje

Ovaj rad je podržan grantom Ministarstva znanosti i tehnologije, Tajvan, ROC (MOST102–2622-B-150-002-CC2 & MOST 103–2313-B-150 -001 -MY2 do CC Peng).

Dostupnost podataka i materijala

Svi podaci generirani ili analizirani tijekom ove studije uključeni su u ovaj objavljeni članak i njegove datoteke s dodatnim informacijama.

Prilozi autora

CCP je osmislio i dizajnirao eksperimente. HZS i IPL izveli su pokuse. CCP i PCK analizirali su podatke. CCP, PCK i JCL doprinijeli su reagensima/materijalima/alatima za analizu. CCP i IPL napisali su i revidirali rad. Svi su autori odobrili konačnu verziju rukopisa.

Podaci o autorima

CCP, doktor biotehnologije, izvanredni profesor na Odjelu za biotehnologiju Nacionalnog sveučilišta Formosa. HZS, magistar biotehnologije, diplomirao na Odsjeku za biotehnologiju Nacionalnog sveučilišta Formosa. IPL, doktor biotehnologije, voditelj Odjela za istraživanje i razvoj, Challenge Bioproducts Co., Ltd. PCK, doktor kemije, izvanredni profesor na Odjelu za biotehnologiju Nacionalnog sveučilišta Formosa. JCL, generalni direktor Honey Bee Town Co., Ltd.

Etičko odobrenje

Sve pokuse na životinjama odobrio je Etički odbor Nacionalnog sveučilišta Formosa (broj odobrenja: 10 401) i bili su u skladu sa Smjernicama za njegu i korištenje laboratorijskih životinja.

Suglasnost za objavu

Nije primjenjivo u ovom odjeljku. Ovaj članak nije klinička studija koja uključuje ljude i ovaj rukopis ne sadrži nikakve pojedinačne kliničke podatke.

Suprotstavljeni interesi

Autori izjavljuju da nemaju suprotstavljenih interesa

Napomena izdavača

Springer Nature ostaje neutralan u pogledu tvrdnji o nadležnosti u objavljenim kartama i institucionalnim vezama.

Podaci o autoru

1 Odjel za biotehnologiju, Nacionalno sveučilište Formosa, Huwei, Yunlin, Tajvan. 2 Odjel za istraživanje i razvoj, Challenge Bioproducts Co., Ltd., Douliou, Yunlin, Tajvan. 3 Honey Bee Town Co., Ltd., br.77-2 Huaxi, 970 Hualien City, Tajvan.

Primljeno: 9. ožujka 2017. Prihvaćeno: 21. srpnja 2017

Objavljeno online: 09. kolovoza 2017

Reference

1. Chen C, Chen S. Promjene proteinskih komponenti i stabilnost skladištenja matične mliječi pod različitim uvjetima. Food Chem. 1995;54:195-200.

2. Takenaka T. Kemijski sastav matične mliječi. Honeybee Sci. 1982;3:69-74.

3. Schmitzova J, Klaudiny J, Albert S, Schroder W, Schreckengost W, Hanes J, Judova J, Simuth J. Porodica glavnih proteina matične mliječi medonosne pčele Apis Mellifera L. Cell Mol Life Sci. 1998;54:1020-30.

4. Okamoto I, Taniguchi Y, Kunikita T, Kohno K, Iwaki K, Ikeda M. Glavni protein matične mliječi 3 modulira imunološke odgovore in vitro i in vivo. Life Sci. 2003;1:2029-45.

5. Fujiwara S, Imai J, Fujiwara M, Yaeshima T, Kawashima T, Kobayashi K. Snažan antibakterijski protein u matičnoj mliječi. J Biol Chem. 1990;265:11333-7.

6. Bilikova J, Hanes J, Nordhoff E, Saenger W, Klaudiny J, Simuth J. Apisimin, novi peptid bogat serinom-valinom iz matične mliječi medonosne pčele (Apis Mellifera L.): pročišćavanje i molekularna karakterizacija. FEBS Lett. 2002;528:125-9.

7. Townsend GF, Brown WH, Felauer EE, Hazlett B. Studije in vitro antitumorske aktivnosti masnih kiselina. IV. Esteri kiselina blisko povezani s 10- hidroksi-2-dekanoinskim kiselinama iz matične mliječi protiv transplantabilne mišje leukemije. Can J Biochem Physiol. 1961;39:1765-70.

8. Blum MS, Novak AF, Taber S. 10-Hidroksi-2Δ-dekanska kiselina, antibiotik koji se nalazi u matičnoj mliječi. Sci. 1959;130:452-3.

9. Vučević D, Melliou E, Vasilijić S, Gašić S, Ivanovski P, Chinou I, Čolić M. Masne kiseline izolirane iz matične mliječi moduliraju imunološki odgovor posredovan dendritskim stanicama in vitro. Int. Immunopharmacol. 2007;7:1211-20.

10. Weaver N, Law JH. Heterogenost masnih kiselina iz matične mliječi. Priroda. 1960;188:938-9.

11. Antinelli JF, Zeggane S, Davico R, Rognone C, Faucon JP, Lizzani L. Procjena (E)-10-hidroksida-enoične kiseline kao parametra svježine za matičnu mliječ. Food Chem. 2003;80:85–9.

12. Takeshi N, Reiji I. Priprema i funkcionalna svojstva vodenog ekstrakta i alkalnog ekstrakta matične mliječi. Food Chem. 2004;84:181-6.

13. Takeshi N, Mizuho S, Rriji I, Hachiro I, Nobutaka S. Antioksidativne aktivnosti nekih komercijalnih meda, matične mliječi i propolisa. Food Chem. 2001; 75: 237–40.

14. Martos MV, Navajas YR, López JF. Funkcionalna svojstva meda, propolisa i matične mliječi. J Food Sci. 2008;73:117–24.

15. Hiroshi I, Masamitsu S, Kazuhiro T, Yoko A, Satoshi M, Hideaki H. Pčelinji proizvodi sprječavaju VEGF-induciranu angiogenezu u ljudskim endotelnim stanicama umbilikalne vene. BMC komplement Altern Med. 2009;9:1-10.

16. Tamura T, Fujii A, Kuboyama N. Antitumorski učinci matične mliječi (RJ). Nippon Yakurigaku Zasshi. 1987;89:73-80.

17. Park HM, Cho MH, Cho Y, Kim SY. Matična mliječ povećava proizvodnju kolagena u koži štakora nakon ovariektomije. J Med Food. 2012;15:568–75. doi:10.1089/jmf. 2011.1888.

18. Izuta H, Shimazawa M, Tsuruma K, Araki Y, Mishima S, Hara H. Pčelinji proizvodi sprječavaju VEGF-induciranu angiogenezu u ljudskim endotelnim stanicama umbilikalne vene. BMC komplement Altern Med. 2009;6:489–94.

19. Tseng JM, Huang JR, Huang HC, Tzen JTC, Chou WM, Peng CC. Olakšana proizvodnja antimikrobnog peptida - royalisina i njegovih antitijela putem sustava umjetnog uljnog tijela. Biotechnol Prog. 2011;27:153-61.

20. Bílikova K, Huang SC, Lin IP, Šimuth J, Peng CC. Odnos strukture i antimikrobnog djelovanja royalizinga, antimikrobnog peptida iz matične mliječi Apis Mellifera. Peptidi. 2015;68:190–6.

21. Okuda H, Kameda K, Morimoto C, Matsuura Y, Chikaki M, Jiang M. Studije o tvarima sličnim inzulinu i inhibitornim tvarima prema angiotenzin-konvertirajućem enzimu u matičnoj mliječi. Mitsubachi Kagaku. 1998;19:9-14.

22. Shinoda M, Nakajin S, Oikawa T, Sato K, Kamogawa A, Akiyama Y. Biokemijska istraživanja vazodilatacijskog faktora u matičnoj mliječi. Yakugaku Zasshi. 1978;98:139-45. 23. Vittek J. Učinak matične mliječi na serumske lipide kod pokusnih životinja i ljudi s aterosklerozom. Experientia. 1995;51:927-35.

24. Ibrahim A, Eldaim MA, Abdel-Daim MM. Nefroprotektivni učinak pčelinjeg meda i matične mliječi protiv subkronične toksičnosti cisplatina u štakora. Citotehnologija. 2016;68:1039-48.

25. Han SM, Yeo JH, Cho YH, Pak SC. Matična mliječ smanjuje sintezu melanina putem smanjene regulacije ekspresije tirozinaze. Am J Chin Med. 2011.; 39:1253-60.

26. Gilchrest BA, Eller MS. Fotooštećenje DNK stimulira melanogenezu i druge fotoprotektivne reakcije. J Istražite Dermatol Symp Proc. 1999;4:35-40.

27. D'Mello SAN, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Signalni putovi u melanogenezi. Int J Mol Sci. 2016;17:1144. doi:10.3390/ijms17071144.

28. Kobayashi T, Vieira WD, Potter B, Sakai C, Imokawa G, Sluh VJ. Modulacija ekspresije melanogenih proteina tijekom prijelaza s EU na feomelanogenezu. J Cell Sci. 1995;108:2301-9.

29. Kim SS, Kim MJ, Choi YH, Kim BK, Kim KS, Park KJ, Park SM, Lee NH, Hyun G. Niža regulacija tirozinaze, TRP-1, TRP-2 i MITF ekspresije citrusnih preša u mišjem melanomu B16 F10. Azijski Pac J Trop Biomed. 2013;3: 617–22.

30. Land EJ, Ito S, Wakamatsu K, Riley PA. Konstante brzine za prva dva kemijska koraka eumelanogeneze. Pigment Cell Res. 2003;16:487–93.

31. Yen FL, Wang MC, Liang CJ, Ko HH, Lee CW. Inhibitori melanogeneze iz ekstrakta Phyla nodiflora. Evid Based Complement Alternat Med 2012; ID: 867494. doi 10.1155/2012/867494.

32. Tachibana M. MITF: potok koji teče za pigmentne stanice. Pigment Cell Res. 2000;3:230-40.

33. Jung SO, Kim DH, Son JH, Nam KC, Ahn DU, Jo CR. Funkcionalno svojstvo fosvitina žumanjka jajeta kao inhibitora melanogeneze. Food Chem. 2012; 135: 993–8.

34. Yeon HK, Youn OJ, Cho CW, Son DW, Park SJ, Rho JH, Sang YC. Inhibicijski učinci cimetne kiseline na biosintezu melanina u koži. Biol Pharm Bull. 2008;31:946-8.

35. Liu JR, Yang YC, Shi LS, Peng CC. Antioksidativna svojstva matične mliječi povezana su sa starošću ličinki i vremenom berbe. J Agri Food Chem. 2007; 56: 11447–52.

36. Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB. Procjena poluautomatiziranog kolorimetrijskog testa temeljenog na tetrazoliju: procjena ispitivanja kemosenzitivnosti. Cancer Res. 1987;47:936-42.

37. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani O. MP-2 stimulira ekspresiju gena tirozinaze i melanogenezu u diferenciranim melanocitima. Pigment Cell Res. 2001;14:328-36.

38. Martinez-Esparza M, Jimenez-Cervantes D, Solano F, Lonzano JA, JC CB. Mehanizam inhibicije melanogeneze faktorom nekroze tumora-alfa u B16/F10 mišjim melanomskim stanicama. Eur J Biochem. 1998;255:139-46.

39. Ding HY, Chang TS, Shen HC, Tai SK. Inhibitori mišje tirozinaze iz Cynanchum Bungei i procjena in vitro i in vivo aktivnosti depigmentacije. Exp Dermatology. 2011;20:720-4.

40. Takiwaki H, Serup J. Mjerenje parametara boje psorijatičnih plakova uskopojasnom spektrofotometrijom refleksije i tristimulus kolorimetrijom. Skin Pharmacol. 1994;7:145-50.

41. Montgomery DC. Eksperimenti s jednim faktorom: Analiza varijance. U dizajnu i analizi eksperimenata. Montgomery, DC, ur., John Wiley i sinovi, New York, 1991.; 75–77 (prikaz, ostalo).

42. Park HY, Wu C, Yonemoto L, Murphy-Smith M, Wu H, Stachur CM. MITF posreduje cAMP-induciranu ekspresiju protein kinaze Cb u ljudskim melanocitima. Biochem J. 2006;395:571-8.

43. Goding CR. Mitf od neuralnog grebena do melanoma: transdukcija signala i transkripcija u lozi melanocita. Genes Dev. 2000;14:1712-28.

44. Kim DS, Park SH, Kwon SB, Li K, Youn SW, Park KC. (−)-Epigalokatehin-3- galat i hinokitiol smanjuju sintezu melanina putem smanjene proizvodnje MITF-a. Arch Pharm Res. 2004;27:334–9.

45. Choi YK, RhoYK, Yoo KH, Lim YY, Li K, Kim BJ. Učinci vitamina C u odnosu na multivitamine na melanogenezu: komparativna studija in vitro i in vivo. Intern J Dermatol. 2011;49:218-26.

46. ​​Dynek JN, Chan SM, Liu J, Zha J, Fairbrother WJ, Vučić D. Transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom je kritični transkripcijski regulator melanomskog inhibitora apoptoze u melanomima. Cancer Res. 2008;68:3124-32.

47. Curtin JA, Fridlyand J, Kageshita T, Patel HN, Busam KJ, Kutzner H, Cho KH, Aiba S, Bröcker EB, LeBoit PE, Pinkel D, Bastian BC. Različiti skupovi genetskih promjena u melanomu. N Engl J Med. 2005;353(20):2135–47.

48. Chan SH, Lim WK, Scott T Michalski ST, Lim JQ, NDB, Met-Domestici M, Young CNC, Vikstrom K, Esplin ED, Fulbright J, Ang MK, Wee J, Sittampalam K, Farid M, Lincoln SE, Itahana K, Abdullah S, The BT, Ngeow J. Hemizigotna delecija germline lokusa CDKN2A–CDKN2B u pacijenta s Li–Fraumeni sindromom. npj Genomska medicina. 2016.; doi:10.1038/ npjgenmed.15.2016

49. Hartman ML, Czyz M. MITF kod melanoma: mehanizmi iza njegove ekspresije i aktivnosti. Cell Mol Life Sci. 2015;72:1249-60. doi:10.1007/s00018-014- 1791-0.

50. Antonescu CR, Busam KJ, Francone TD, Wong GC, Guo T, Agaram NP, Besmer P, Jungbluth A, Gimbel M, Chen CT, Veach D, Clarkson BD, Paty PB, Weiser MR. L576P KIT mutacija u analnim melanomima korelira s ekspresijom KIT proteina i osjetljiva je na specifičnu inhibiciju kinaze. Int J Rak. 2007;121:257-64.

51. Abdel-Daim M, Funasaka Y, Komoto M, Nakagawa Y, Yanagita E, et al. Farmakogenomika metabotropnog glutamatnog receptora podtipa 1 i in vivo stvaranje malignog melanoma. J Dermatol. 2010;37:635-46.

52. Ohtani Y, Harada T, Funasaka Y, Nakao K, Takahara C, et al. Metabotropni podtip glutamatnog receptora -1 bitan je za in vivo rast melanoma. Onkogen. 2008;27:7162-70.

53. Kim J, Kim Y, Yun H, Park H, Kim SY, Lee KG, Han SM, Cho Y. Matična mliječ pojačava migraciju ljudskih dermalnih fibroblasta i mijenja razine kolesterola i sfinganina u in vitro modelu zacjeljivanja rana. Nutr Res Pract. 2010;4:362-8.

54. Fujii A, Kobayashi S, Kuboyama N, Furukawa Y, Kaneko Y, Ishihama S, Yamamoto H, Tamura T. Povećanje zacjeljivanja rana matičnom mliječi (RJ) u streptozotocin-dijabetičkih štakora. Jpn J Pharmacol. 1990;53:331-7.

55. Koya-Miyata S, Okamoto I, Ushio S, Iwaki K, Ikeda M, Kurimoto M. Identifikacija faktora koji potiče proizvodnju kolagena iz ekstrakta matične mliječi i njegov mogući mehanizam. Biosci Biotechnol Biochem. 2004;68:767-73.

Za više informacija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501