Uzrok policistične bolesti bubrega

za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Prekomjerna ekspresija PKD1 uzrokuje policističnu bolest bubrega

Caroline Thivierge, Almira Kurbegović, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté i Marie Trude

Patogenetski mehanizmi u osnoviautosomno dominantanpolicistična bolest bubrega(ADPKD) tek treba razjasniti. Iako postoje dokazi da Pkd1(policistična bolest bubrega 1)haploinsuficijencija gena i gubitak heterozigotnosti mogu uzrokovati stvaranje cista kod miševa, paradoksalno visoke razine Pkd1(policistična bolest bubrega 1) ekspresija je otkrivena u bubrezima ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega) pacijenata. Kako bi se utvrdilo je li Pkd1(policistična bolest bubrega 1)povećanje funkcije može biti patogenetski proces, bakterijski umjetni kromosom Pkd1 (Pkd1-BAC) modificiran je homolognom rekombinacijom kako bi isključivo usmjerio održivu ekspresiju Pkd1 prvenstveno na odrasli bubreg. Generirano je nekoliko transgenih linija koje su posebno prekomjerno eksprimirale Transgen Pkdl u bubrezima 2- do 15-preklopi se preko endogenih razina Pkd1. Svi transgeni miševi reproducibilno su razvili tubularne i glomerularne troškove i bubrežnu insuficijenciju i umrli su od bubrežne insuficijencije. Ovaj model pokazuje da je prekomjerna ekspresija samo divljeg tipa Pkd1 dovoljna da pokrene cistogenezu koja nalikuje ljudskom ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega). Naši rezultati također su otkrili izrazito povećanu bubrežnu ekspresiju c-myc u miševa iz svih transgenih linija, što ukazuje da je c-myc kritičan in vivo nizvodni efektor Pkd1(policistična bolest bubrega 1)molekularni Dathwavs, Ova studija ne samo da je proizvela neprocjenjiv i prvi PKD(policistična bolest bubrega)model za procjenu molekularne patogeneze i terapija, ali također pruža dokaze da bi povećanje funkcije moglo biti patogenetski mehanizam kod ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega).

Kliknite na Cistanche za bolest bubrega

Autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega(ADPKD) jedna je od najčešćih genetskih bolesti u ljudi. Karakterizira ga progresivni razvoj višestrukih bubrežnih cista koje zahvaćaju sve segmente nefrona. Druge manifestacije uključuju stvaranje cista u jetri i gušterači, kao i intrakranijalnih aneurizme i kardiovaskularnih defekata. ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)tipično dovodi do bubrežne insuficijencije s progresijom u završni stadij bubrežne bolesti do kasne srednje dobi.

Otprilike 85 posto ADPKD-a (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)slučajevi su povezani s mutacijama u PKD1(policistična bolest bubrega 1)gen. Ovaj PKD1(policistična bolest bubrega 1)gen je velik, obuhvaća 54 kb i sastoji se od 46 egzona. Generira prijepis od 14.2-kb i kodira 4., 302-aminokiselinski protein koji se zove policistin-1(4, 9-11). Ekspresija ljudskog PKD1 i policistina-1 analizirana je u normalnom i ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)bubrega. Tijekom razvoja bubrega, policistin-1 se lako otkriva u glomerularnim i tubularnim epitelnim stanicama (pregledano u referenci 37 i referencama u njoj). U normalnih odraslih osoba, mi i drugi smo pokazali da PKD1(policistična bolest bubrega 1)RNK i protein eksprimiraju se u umjerenim do niskim razinama u sabirnim i distalnim tubulima, dok su razine povećane (~2- puta) kod ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)bubrezi (22, 39). Zanimljivo je da je perzistentna ili pojačana ekspresija policistina-1 otkrivena u većini bubrežnih epitelnih cista, iako je bojenje izostalo u značajnoj manjini cista (29). Osim bubrega, PKD1(policistična bolest bubrega 1)ekspresija je normalno raširena u drugim tkivima odraslih, uključujući tipove epitelnih i neepitelnih stanica (6,14,18,29,30, 39).

Više od 200 različitih PKD1(policistična bolest bubrega 1)opisane su mutacije, od kojih su većina mutacije brisanja-umetanja, pomaka okvira ili besmislice. Predviđa se da će rezultirati skraćenim oblicima proteina, u skladu s inaktivacijom jednog alela.

Međutim, značajan udio su missense ili mutacije unutar okvira koje se nalaze u cijelom genu i često su jedinstvene za određenu obitelj (33, 34). Kao što naziv implicira, ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)je dominantan i prenosi mutirani PKD1(policistična bolest bubrega 1)alel je dovoljan da izazove bolest. Međutim, žarišna priroda bubrežnih cista kod ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)sugerira da mutacijski mehanizam za PKD1(policistična bolest bubrega 1)može biti dvostruki pogodak ili gubitak heterozigotnosti. Potpora za ovaj mehanizam dobivena je detekcijom PKD1(policistična bolest bubrega 1)klonske somatske mutacije u stanicama iz značajnog udjela cista (3, 21, 32). Mehanizam gubitka heterozigotnosti mogao bi objasniti široko varirajući fenotip koji se obično opaža u pojedinim obiteljima.

Studije na mišu Pkd1(policistična bolest bubrega 1)Gen može dati vrijedan uvid u funkciju(e) PKD1 zbog velike sličnosti između ljudskog i mišjeg gena i genskog produkta. U normalnom razvoju, mišji Pkd1 eksprimira se na visokim razinama od stadija morule i otkriva se u svim derivatima stanica neuralnog grebena. uključujući mozak odrasle osobe, luk aorte, hrskavicu i mezenhimalnu kondenzaciju (16, 17). Prijavljeno je da homozigotni mutirani miševi ciljani na deleciju Pkd1 umiru in utero i razvijaju ciste bubrega i gušterače (2,19,24-26, 40). Ovi prethodni pokušaji stvaranja mišjih modela nažalost nisu dali postnatalno održive životinje. Ipak, pojava bubrežnih cista u ovih homozigotnih Pkd1 mutantnih miševa bila bi u skladu s hipotezom o dvostrukom mutacijskom mehanizmu kod ljudi koji uključuje mutaciju germinativne linije i somatsku inaktivaciju normalnog alela. Međutim, miševi heterozigotni za ciljanu deleciju Pkd1 također su pokazali PKD s povremenim cistama jetre i gušterače usprkos kasnoj pojavi u odrasloj dobi, podupirući mehanizam haploinsuficijencije ili smanjenja doze gena. Štoviše, gubitak heterozigotnosti ili haploinsuficijencija ne mora biti jedini mehanizam za ADPKB (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)patogeneza. Doista, ovi mehanizmi su u suprotnosti s perzistentnom ili pojačanom ekspresijom PKD1(policistična bolest bubrega 1)vidljiva u većini humanih bubrežnih cista osim ako se ne proizvode nefunkcionalni proteini. Ovaj nalaz održive ili povećane ekspresije PKD1 postavlja pitanje može li povećanje funkcije ili prekomjerna ekspresija biti operant. Kako bismo istražili patogenetski mehanizam povećanja funkcije Pkd1, izolirali smo i karakterizirali mišji bakterijski umjetni kromosom Pkd1 (Pkd1-BAC) koji je naknadno modificiran homolognom rekombinacijom u Escherichia coli za ciljanu ekspresiju Pkd1(policistična bolest bubrega 1)konkretno na bubrege. Izvještavamo o proizvodnji tri transgene linije koje su eksprimirale Pkd1 transgen na različitim razinama. Svi miševi reproducibilno su pokazali brojne sličnosti s ljudskim ADPKD-om i dosljedno su razvijali rani početak s brzim napredovanjem bubrežnih morfoloških i funkcionalnih promjena i umrli su od zatajenja bubrega do srednje dobi. Osim toga, trenutna studija opisuje in vivo mehanizam kojim Pkd1 može posredovati u ovom fenotipu PKD. Ovi miševi predstavljaju prvi model PKD-a proizveden jedinom bubrežnom prekomjernom ekspresijom ortolognog PKD1(policistična bolest bubrega 1)gen.

MATERIJALI I METODE

Izolacija BAC klonova koji sadrže Pkd1(policistična bolest bubrega 1)mjesto. Pkd1-BAC klonovi iz bakterijskog soja domaćina E. coli DH10B (RecA; RecBC) izolirani su iz pBelo11BAC biblioteke 129Sv miša (Research Genetics). Probir BAC super pulova proveden je PCR-om sa sljedećim početnicama: 5 regija, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (naprijed Pkd1 egzon 1) i 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC-3 (obrnut Pkd1 egzon 1); i 3 regije, 5-TCG GCCCTAGCGTCTGCAGCC-3 (prednji Pkd1 egzon 39) i 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (obrnuti Pkd1 egzon 40). Jedan pozitivan klon za obje amplifikacije identificiran je i analiziran na standardnom gelu i gel elektroforezi s pulsirajućim poljem (PFGE) nakon čega je uslijedio Southern blotting. Za Southern blot analizu dizajnirano je sedam mišjih Pkd1 sondi: genomski egzon 1 (516 bp; nukleotidi [nt] 1 do 516; NCBI pristupni broj U70209), genomski egzon 2-3 (220 bp), genomski egzon {{ 31}} (8479 bp), cDNA egzon 15-20 (1724 bp; nt 6455 do 8179), cDNA egzon 25-34 (1315 bp; nt 9415 do 10730), cDNA egzon 36-45 ( 1655 bp; nt 10963 do 12618) i genomski egzon 45-46 (1640 bp) (16). Nekoliko regija uključujući BAC umetnute ekstremitete ovog mišjeg Pkd1-BAC također je sekvencionirano i potvrđeno je da su ortologne ljudskom PKD1 genu i susjednim regijama.

REZULTATI

Proizvodnja SBPkdl(policistična bolest bubrega 1) rAc-BAC homolognom rekombinacijom. Da bi se utvrdilo je li samo povećanje funkcije Pkd1 dovoljno za proizvodnju ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)fenotipa, prvo smo izolirali genomski klon koji sadrži cijeli Pkdl gen u biblioteci BAC vektora 129/Sv. Ova je biblioteka pretražena pomoću PCR-a s dva seta početnica za gen Pkd1 koji su obuhvaćali ekson 1 na 5' kraju i egzone 39 do 40 prema 3' kraju (slika 1). Identificiran je pozitivan BAC klon za gen Pkd1 koji uključuje cijelo susjedno tijelo Tsc2 gena. Umetak Pkd1 detaljno je okarakteriziran kako bi se osiguralo da genomska struktura odgovara onom endogenog Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gen mišjeg soja 129/Sv iz kojeg je izveden umetak i iz inbred soja C57BL/6J. Genomske karte lokusa Pkd1 u BACand u ovim inbred sojevima Southern blot analizom, s četiri probave restrikcijskim enzimima i sedam sondi koje pokrivaju cijeli gen Pkdl, činile su se identičnima bez dokaza o preraspodjeli (slika 1). Ovaj BAC je sadržavao ~121-kb umetak uključujući-37 kb uzvodnog i -39 kb nizvodnog niza Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gena kako je određeno elektroforezom i sekvenciranjem.

Ovaj Pkd1-BAC klon modificiran je s dva uzastopna događaja homologne rekombinacije u E.coli. Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gen je označen u eksonu 10 zamjenom nukleotida (G u A) kako bi se stvorilo novo EcoRI mjesto na poziciji 2355 na cDNA mapi. Ova tiha točkasta mutacija proizvedena je za razlikovanje Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gen i transkript BAC-a iz onog endogenog porijekla. Osim toga, zamijenili smo 5' regulatorne elemente Pkd1-BACgena iskorištavanjem prednosti prethodno identificiranih "SB" elemenata specifičnih za bubrežni epitel iz SBM (povezan s c-Myc) ili SBF povezan s c- fos) konstrukt-trans-gen za ograničavanje ekspresije na bubrege (36,38) (Sl. 2a).

Ovaj novi SBPkd1TAc-BAC probavljen je s Notl, jedinstvenim mjestom koje se nalazi odmah uzvodno od SB elemenata, i ClaI unutar tijela gena Tsc2, skraćujući regulatorne elemente Tsc2 i 5'polovicu tijela gena kako bi se osigurao nedostatak egzogene ekspresije Tsc2 u svim tkivima i za uklanjanje prokariotskih sekvenci BACvektora (Slika 1 i 2). Ovaj 70-kb Notl-Clal linearizirani fragment izoliran je, pročišćen i kvantificiran za mikroinjektiranje oocita (36).

Proizvodnja i analiza SBPkd1rAc transgenih miševa. Četiri transgena osnivača koji nose nekoliko kopija transgena SBPkd1rAc dosljedno razvijaju PKD(policistična bolest bubrega). Od četiri miša osnivača SBPkdlrAc utvrđenih Southern analizom, ustanovljene su tri transgene linije SBPkd1rAG s dvije do devet kopija transgena (slika 2b). Karakterizacija integriteta transgena u ovim linijama praćena je s 5', internim i 3' probama kao što je prikazano reprezentativnim primjerima na slici 2b. Transgene linije otkrile su s 5'"SB" probom pojas od 10,9 kb u skladu s transgenom SBPkd1rAc koji je integriran u orijentaciju od glave do repa i otkriven s 3'probom s pojasom od 7.1-kb (Slika 2b). Osim toga, interna sonda otkrila je 9.4-kb endogeni Pkd1 pojas kao i 69-kb i 2.5-kb pojas transgena zbog mjesta umetanja EcoRI u eksonu 10 (slika 2b). Ovi miševi sadržavali su potpune kopije transgena na temelju analize genomske preklapajuće strukture.

Pkd1(policistična bolest bubrega 1)povećanje funkcije kod odraslih SBPkdlrAc transgenih miševa. Ekspresija transgena SBPkdlrAG i gena Pkd1 istražena je u različitim organima. Kvantifikacija razina transkripta iz transgenskog i/ili endogenog gena provedena je Northern blot analizom (slika 3a). Kao što se očekivalo, transgeni i endogeni genski transkripti bili su slične duljine (14,2 kb). Na temelju kontrolne ekspresije GAPDH, bubrezi svih SBPkd1TAG mišjih linija imali su dosljedno povećanu ekspresiju transkripta u usporedbi s normalnim razinama Pkdl u odraslim bubrezima (n=3) slične dobi. Bubrežna transgena i endogena ekspresija za različite transgene linije pokazala je raspon od 2- do 15-puta iznad kontrolnih bubrežnih endogenih razina Pkd1 (Slika 3a). Osobito, transgena linija 39 (n {{11} }) je pokazao viši Pkd1(policistična bolest bubrega 1)razine od redaka 3(n=3) i 41 (n =4). Nadalje, razine ekspresije Pkd1 izmjerene Northern blot analizom korelirale su s onima dobivenim PCR-om u stvarnom vremenu korištenjem početnica u egzonima 1 i 2 (slika 3b).

Konkretno, kvantifikacija razina ekspresije transgena provedena je PCR-om u stvarnom vremenu i semikvantitativnom RT-PCR-om u tri transgene linije u odrasloj dobi korištenjem početnica u 5'netranslatiranoj regiji (B, -globin promotor) i u eksonu 2 Pkd1(policistična bolest bubrega 1)(Sl.3b). Ekspresija SBPkdlrAc u transgenim miševima uspoređena je s genskim produktom ribosomskog proteina S16 kao internim standardom. Uvjeti korišteni za semikvantitativno RT-PCR pojačanje bili su unutar linearnog raspona. Ekspresija transgena PCR-om u stvarnom vremenu i semikvantitativnom RT-PCR-om dosljedno je i specifično pokazala najveću ekspresiju u bubregu od svih transgenih linija u odnosu na druge organe (Slika 3b i c). Razine bubrežne ekspresije za pojedinačni uzorak bile su ponovljive bilo kojom od korištenih tehnika detekcije. Najviše razine Pkd1(policistična bolest bubrega 1)transgena bubrežna ekspresija je mjerena za linije 39 i 41. Da bi se pratilo je li povećana Pkd1(policistična bolest bubrega 1)ekspresija nastala iz transgena ili endogenog gena, ista skupina miševa iz tri transgene linije uspoređena je za ekspresiju transgena bubrežnog Pkd1 i za ukupnu (transgensku i endogenu) ekspresiju bubrežnog Pkd1 pomoću PCR-a u stvarnom vremenu. Zanimljivo, linije 39 i 41 u odnosu na liniju 3 pokazuju da je povećana bubrežna ekspresija transgena Pkdl bila slična ili veća od ukupne bubrežne ekspresije Pkd1, ukazujući na transgen kao specifično odgovornog za ovu induciranu ekspresiju. U raznim organima (uključujući srce, pluća, mozak, jetru, gušteraču i slezenu), transgen SBPkd1rAg pokazao je vrlo slabu ekspresiju povremeno otkrivenu u slezeni i plućima, s malom do nemjerljivom ekspresijom u drugim organima (Slika 3b). Kvantifikacija PCR-om u stvarnom vremenu pokazala je 10- do 1,000-puta nižu razinu ekspresije transgena u ekstrarenalnim tkivima u odnosu na ekspresiju bubrega (Slika 3c). "SB" regulacijski elementi transgena SBPkdlrA dodijelili su preferencijalnu bubrežnu ekspresiju; ova posebna raspodjela organa također je određena kada se koristi u transgenima povezanim s c-myc (SBM) i c-fos(SBF) (36, 38).

C-myc, nizvodni efektor od Pkd1(policistična bolest bubrega 1)signalnih puteva kod SBPkdlrAc miševa. Kako bismo stekli uvid u intracelularni patogenetski mehanizam SBPkdlrAg transgenih miševa, zatim smo nastojali pratiti razinu bubrežne ekspresije c-myc na temelju našeg prethodnog opažanja deregulacije c-myc kod ADPKD kod ljudi (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)bubrega(22). Analiza bubrega provedena je iz sve tri transgene linije 3(n =4),39(n =7), i 41 (n=4) kao i kontrole (n=4). Kao što je prikazano na slici 3d, postoji značajna ekspresija endogenog c-myc induciranog u SBPkd1TAG miševa u odnosu na kontrolne miševe slične dobi. Zanimljivo, razina ekspresije c-myc u nekim bubrezima SBPkd1-c. posebno linija 39, dosegla je razine usporedive s onima uočenim u PKD SBM transgenom mišjem modelu proizvedenom bubrežnom ekspresijom c-myc.

Bubrežne anomalije u SBPkd1raG miševa slične PKD(policistična bolest bubrega). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>6 za svaku liniju) razvile su višestruke tubularne (T) i glomerularne ciste (G) (Sl. 4d, f i g). Ciste su uočene u tubulima iz kortikalne i medularne regije, kao i sabirnim tubulima iz papile (Sl. 4d i e). Transgeni miševi pokazali su tubularnu epitelnu hiperplaziju (vrh strelice) koja uključuje i cistične i ne-cistične tubule i čestu hipertrofiju (Slika 4g i h), ali je ozbiljnost varirala između pojedinačnih miševa. Često su uočeni intersticijska fibroza (F), perivaskularni limfoidni infiltrati i proteinski odljevci (P) (Slika 4d i e).

Za preciznije definiranje mjesta lokalizacije povećanog Pkd1(policistična bolest bubrega 1)ekspresije u bubrezima, proveli smo in situ hibridizaciju pomoću sonde egzona 36-45 koja je prethodno korištena (16). Hibridizacijski signal je specifično lokaliziran na epitelne stanice koje oblažu ciste i hiperplastične tubule, kao i glomerularne ciste. Osim toga, određeni signal je viđen preko epitela necističnih ili blago dilatiranih tubula, vjerojatno identificirajući tubule predodređene za buduće cistične promjene (Slika 4i i j).

Histološka analiza bubrega također je provedena na transgenim miševima pri rođenju (n =8), 10. postnatalnog dana (P10) (n =3), P20 (n =5), P35 (n { {7}}) i P45(n=3) u usporedbi s negativnim kolegama iz legla iste dobne skupine (n 2 do 4). Zanimljivo je da su svi novorođeni transgeni miševi pokazali tubularnu i glomerularnu dilataciju u odnosu na kontrolne negativne prijatelje iz legla (Slika 4k i l), što ukazuje da su bubrežne anomalije nastale in utero kao što je uočeno u SBM miševa i ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)pacijenata. Tubularna i glomerularna dilatacija povećavala se u veličini i broju s progresivnom starošću. Do P35, transgeni miševi su pokazali težu hiperplaziju i dokaze glomeruloskleroze. Promijenjene fiziološke funkcije bubrega u SBPkd1TAG miševa. Bubrežne fiziološke funkcije svih transgenih miševa pokazale su značajke slične PKD-u(policistična bolest bubrega), dok netransgenični legla nikada nisu razvila bolest. Nekoliko mjeseci nakon rođenja oboljele životinje razvile su kroničnu bubrežnu insuficijenciju. Kod ovih su životinja praćeni bubrežni funkcionalni parametri mjerenjem razine u serumu i urinu, dušika iz uree u krvi (BUN) i kreatinina, osmolalnosti urina, proteina u urinu i izlučivanja iona (tablica 1). Svi miševi iz tri linije u usporedbi s kontrolama pokazali su nedostatke koncentracije, čest nalaz kod ADPKD-a, i posljedično smanjene koncentracije BUN-a u mokraći, kreatinina, proteina i željeza. Transgeni SBPkd1TAG osnivači i potomci (n 6) iz svake linije kvalitativno su praćeni na proteinuriju na uzorcima urina pomoću SDS-PAGE (Slika 5). Miševi stariji od 2 mjeseca pokazali su neselektivnu proteinuriju koja je napredovala s godinama. Uz to, razine serumskog BUN-a i serumskog kreatinina bile su povećane, otkrivajući bubrežnu insuficijenciju (Tablica 2). Budući da kronična bubrežna insuficijencija obično dovodi do promjena u hematološkim parametrima, oni su ispitani na SBPkd1TAG transgenim miševima u dobi od 3 do 14 mjeseci (Tablica 2). Ovi transgenični miševi bili su anemični što je dokazano značajno smanjenim brojem crvenih krvnih zrnaca, s hemoglobinom i hematokritom koji su dosegli polovicu normalnih razina. Ostali parametri crvenih krvnih zrnaca, poput postotka retikulocita, ostali su nepromijenjeni, kao što se očekivalo kada su izazvani oštećenjem bubrega. Te su životinje stalno umirale od zatajenja bubrega u dobi od 5.9  2.8 mjeseci (n 42) za transgensku liniju 39 i u kasnijoj dobi, 14.6 3.1 mjeseci (n 20) i 11 .7 6.5 mjeseci (n 7), za retke 3, odnosno 41.

SLIKA 1. Shematski prikaz i detaljna analiza restrikcijske karte mišjeg Pkd1-BAC.

Obrasci probave genomske DNA Pkd1(policistična bolest bubrega 1)-BAC su uspoređeni s onima iz Pkd1(policistična bolest bubrega 1)lokus u 129Sv i C57Bl/6J inbred sojevima miševa. Proizvedeno je sedam sondi koje obuhvaćaju većinu mišjeg Pkd1 gena:

(a) egzon 1, (b) egzon 2-3, (c) egzon 7-15, (d) egzon 15-20, (e) egzon 25-34, (f ) egzon 36-45 i (g) egzon 45-46, označen od a do g na genomskom Pkd1(policistična bolest bubrega 1)reprezentacije i preko pojedinačnih mrlja.

Southern blot analiza nakon restrikcijskih digestija (BamHI, EcoRI, HindIII i KpnI) genomske DNA iz Pkd1-BAC i mišjeg Pkd1(policistična bolest bubrega 1)lokusi su pokazali identične uzorke sa svih sedam sondi. M, HindIII biljeg; 129, 129/Sv; C57, C57Bl/6J.

RASPRAVA

Ovdje izvještavamo o izolaciji i karakterizaciji mišjeg Pkd1-BAC. Ovaj Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gen je označen i regulatorni elementi su zamijenjeni kako bi usmjerili ekspresiju specifično na bubrege pomoću dva uzastopna događaja homologne rekombinacije. Transgeni miševi proizvedeni ovim novim genom SBPkd1TAG pokazali su 2- do 15-struko povećanje ekspresije Pkd1 i reproducibilno razvili rane morfološke promjene bubrega tipične za PKD. Insuficijencija bubrega očita je u srednjoj dobi, a miševi prerano umiru od zatajenja bubrega. Naši rezultati također pokazuju da je mehanizam prekomjerne ekspresije Pkd1 odgovoran za ovaj fenotip posredovan signaliziranjem aktivacije c-myc in vivo. Ova studija pokazuje da je mišji Pkd1 dobitak funkcije u bubrezima dovoljan za proizvodnju PKD bubrežnog fenotipa. Budući da mišji gen Pkd1 nije dupliciran kao što je to slučaj kod ljudi (27), izravno smo identificirali i izolirali BAC klon koji je sadržavao cijeli gen Pkd1. Potpuna karakterizacija 129/Sv mišjeg Pkd1-BAC, neizravna usporedba s dva druga inbred soja miša, potvrdila je integritet Pkd1 lokusa. Umetak Pkd1-BAC sadržavao je 37 do 39 kb uzvodnih i nizvodnih sekvenci gena Pkd1. Naša je analiza pokazala da je gen Pkd1 u ovom BAC-u vjerodostojan lokus divljeg tipa miša koji bi mogao poslužiti za daljnja istraživanja. Iako postoje čvrsti dokazi da stvaranje ciste kod ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)može biti rezultat gubitka heterozigotnosti nakon somatske inaktivacije normalnog PKD1(policistična bolest bubrega 1)alela (3, 21, 32), također postoje sugestivni dokazi za stalnu ili čak povećanu ekspresiju policistina-1 u cističnom tubularnom epitelu (22, 29). Potonje opažanje postavlja pitanje je li prekomjerna ekspresija Pkd1 per se dovoljan proksimativni uzrok cistogeneze. Kod transgenih miševa koji nose ljudski PKD1(policistična bolest bubrega 1), TSC2, RAB 26, NTHL1 i SLC9A3R2 gena, samo je manjina miševa razvila ciste i nijedan nije imao mjerljivu ekspresiju transgena u odrasloj dobi unatoč 30 kopija transgena (31). Kod tih transgenih miševa bilo je teško utvrditi jasnu ulogu prekomjerne ekspresije Pkd1 u cistogenezi. Naš model se razlikuje, budući da su dvije do devet kopija divljeg tipa samo Pkd1, bez susjednih gena, integrirane u transgene miševe. Budući da gen Pkd1 ima bitne funkcije u raznim organima ili tkivima, kao što je opisano za brojne miševe s ablacijom gena Pkd1, sustavna prekomjerna ekspresija Pkd1 mogla bi dovesti do dodatnih zbunjujućih učinaka. Posljedično, obratili smo se na ulogu Pkd1 povećanja funkcije koristeći pristup koji cilja Pkd1 specifično na bubrege. Homolognom rekombinacijom prvo smo zamijenili Pkd1 uzvodno regulatorno područje s "SB" bubrežno ograničenim regulatornim elementima, čime smo spriječili smanjenu ekspresiju gena koja se normalno vidi za Pkd1 u odrasloj dobi, kao i potencijalnu regulaciju sekundarne povratne petlje (36, 38). Drugo, označili smo mišji Pkd1 transgen (Pkd1TAG) tihom točkastom mutacijom u egzonu 10, ali nismo umetnuli oznaku epitopa kako bismo osigurali proizvodnju potpuno funkcionalnog proteina "divljeg tipa" s očuvanom strukturom i integritetom. Iz ovog modificiranog BAC-a, fragment SBPkd1TAG je pročišćen od gena Tsc2 i vektora BAC kako bi se spriječila interferencija gena Tsc2, koji također može inducirati cistični fenotip (8, 20, 28), kao i kako bi se izbjegao inhibitorni učinak prokariotske sekvence (5).

Četiri različita transgena SBPkd1TAG miša začetnika i tri neovisne linije proizvedene su sa specifičnim bubrežnim Pkd1(policistična bolest bubrega 1)- pojačan izraz. Posebno je zapanjujuća potpuna penetracija fenotipa kod ovih transgenih miševa. Osnivač SBPkd1TAG i mišje linije dijelile su nekoliko fiziopatoloških značajki zajedničkih s ADPKD-om (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega). To uključuje razvoj cista u korteksu, meduli i glomerulima zajedno s epitelnom hiperplazijom, intersticijalnom fibrozom i žarišnom intersticijalnom upalom.

Jer PKD(policistična bolest bubrega)fenotip je dosljedno uočen kod svih različitih transgenih miševa osnivača, a integracija transgena u mišji genom slučajna je pojava, fenotip ne može proizaći iz učinka kromosomskog položaja, već samo iz povećane ekspresije Pkd1. Doista, pokazalo se da je ekspresija Pkd1 transgena u svim linijama renalno ograničena, kao što je prethodno uočeno za druge transgene regulirane "SB" elementima (36, 38). Štoviše, ovu povećanu ekspresiju Pkd1 uzrokovao je transgen, a ne neizravna endogena aktivacija Pkd1. Stoga naši rezultati daju jasne dokaze da povećanje funkcije divljeg tipa funkcionalnog Pkd1 može proizvesti višestruke bubrežne ciste. Važno je da ovi SBPkd1TAG miševi sačinjavaju prvi mišji model generiran isključivo prekomjernom ekspresijom mišjeg ortologa ljudskog PKD1 gena.

SBPkd1TAG miševi pokazuju da Pkd1(policistična bolest bubrega 1)prekomjerna ekspresija je primarni patogenetski mehanizam bubrežne cistogeneze. Važno je da se čini da najviše razine ekspresije transgena u bubrezima koreliraju s progresijom i težinom fenotipa. Također smo otkrili da prekomjerna ekspresija Pkd1 u razvoju fenotipa SBPkd1TAG vjerojatno signalizira aktivaciju c-myc in vivo. Zamislivo, ova aktivacija bi čak mogla biti izravna preko C-terminalnog repa policistina-1 koji prolazi kroz proteolitičko cijepanje i translokaciju jezgre (7). Budući da se pokazalo da pojačana bubrežna ekspresija c-myc u odraslih miševa inducira PKD, bilo bi vrlo dosljedno podržavati c-myc kao glavni nizvodni efektor Pkd1 signalnih putova. Ovaj je rezultat također u korelaciji s našim prethodnim nalazima povećane ekspresije c-myc u bubrezima svih ljudi s ADPKD-om (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)analizirani (22). Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da je c-myc glavni posrednik Pkd1(policistična bolest bubrega 1)cistogeneza. Naši rezultati iz modela povećanja funkcije Pkd1, zajedno s haploinsuficijencijom mišjeg Pkd1 i gubitkom funkcije, pokazuju da bi bilo kakva disregulacija Pkd1 mogla dovesti do cistogeneze (2, 19, 23-26, 31, 40).

Teški Pkd1(policistična bolest bubrega 1)neravnoteža kod miševa izazvana Pkd1(policistična bolest bubrega 1)ablacija ili transgena prekomjerna ekspresija uzrokovala je rani početak i brzu progresiju bubrežnih cista i zahvatila veliki udio tubula. Nasuprot tome, blaža neravnoteža Pkd1 kao što je haploinsuficijencija dovela je do sporijeg napredovanja PKD-a s više žarišnih cista. Očigledni paradoksalan razvoj sličnog fenotipa putem suprotne disregulacije policistina-1 mogao bi se objasniti zajedničkim rezultatom, naime relativnom neravnotežom koncentracije proteina koja bi mogla promijeniti formiranje ili funkciju aktivnog policistinskog multiproteinskog kompleksa. Uzeti zajedno, naši rezultati i rezultati drugih istraživača tvrde da je mehanizam formiranja ciste kod ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega)vjerojatno nastaje iz tri patogenetska mehanizma: povećanja funkcije, gubitka funkcije i učinaka doziranja gena. Novi SBPkd1TAG miševi predstavljaju moćan model bubrežne cistogeneze koji može pružiti veliki uvid u patofiziologiju PKD-a(policistična bolest bubrega), Pkd1(policistična bolest bubrega 1)putevi prijenosa signala i partneri u interakciji. Studija ovog modela također može dovesti do razvoja novih terapijskih strategija za vraćanje normalne ravnoteže proteina unutar Pkd1 multimernog kompleksa.

REFERENCE

1. Blouin, MJ, H. Beauchemin, A. Wright, MEDe Paepe, M. Sorette, A.-M. Bleau.B. Nakamoto. C.-N, Ou, G. Stamatovannopoulos i M. Trudel 2000. Genetska korekcija anemije srpastih stanica: uvidi korištenjem modela transgenih miševa. Nat. Med. 6:177-182.

2. Boulter, C., S. Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle i R. Sandford. 2001. Kardiovaskularni, skeletni i bubrežni defekti u miševa s ciljanim poremećajem Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gen.Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 98:12174-12179.

3. Brasier, JL, i EPHenske.1997. Gubitakpolicistična bolest bubrega(PKD1) regija kromosoma 16p13 u stanicama bubrežne ciste podupire model gubitka funkcije za patogenezu ciste. J. Clin. Istražite.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connors, WRDackowski, LRPetry, TJVan Raay, JM Millholland, M. Venet, G.Miller, RM Hakim, GMLandes, KW Klinger, F. Qian, LF Onuchic, T. Watnick, GG Germino i NA Doggett.1995.Analiza genomske sekvence zaautosomno dominantan policistična bolest bubrega(PKD1) gen predviđa prisutnost ponavljanja bogatog leucinom. Pjevušiti. Mol. Genet.4:575-582.

5.Chada,K, J.Magram, K. Raphael,G.Radice, E.Lacy i F.Costantini.1985. Specifična ekspresija stranog -globin gena u eritroidnim stanicama transgenih miševa. Nature 314:377-380.

6. Chauvet, V, F. Qian, N. Boute, Y. Cai, B. Phakdeekitacharoen, LF Onuchic, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O. Devuyst, GG Germino i M.-C. Gubler.2002. Ekspresija PKD1(policistična bolest bubrega 1)i PKD2(policistična bolest bubrega 2)transkripti i proteini u ljudskom embriju i tijekom normalnog razvoja bubrega. Am. J. Pathol 160:973-983.

7. Chauvet, V., X. Tian, ​​H. Husson, DHGrimm, T. Wang, T. Hiesberger, P. Igarashi, AM Bennett, O. Ibraghimov-Beskrovnava, S. Somlo i MJ Caplan.2004. Mehanički podražaji induciraju cijepanje i nuklearnu translokaciju policistinskog-1 C završetka. J. Clin. Istražite. 114:1433-1443.

8. Cheadle, JPMP Reeve, JR Sampson i DJ Kwiatkowski.2000. Molekularni genetski napredak u tuberoznoj sklerozi. Pjevušiti. Genet.107:97-114. 9. Konzorcij, EPKD1993. Identifikacija i karakterizacija gena tuberozne skleroze na kromosomu 16. Stanica 75:1305-1315.

10. Consortium, EPKD1994. Gen policistične bolesti bubrega 1 kodira transkript od 14 kb i nalazi se unutar duplicirane regije na kromosomu 16. Stanica 77:881-894.

11. Konzorcij, IPKD1995. Policistična bolest bubrega: kompletna struktura PKD1(policistična bolest bubrega 1)gen i njegov protein. Ćelija 81:289-298.

12. Couillard, M., R. Guillaume, N. Tanji, V. DAgati i M. Trudel.2002. c-myc-inducirana apoptoza u policističnoj bolesti bubrega neovisna je o FasL Fas interakciji. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, ME i M. Trudel.1994. Transgenični SAD miš: model ljudske glomerulopatije srpastih stanica. Kidney Int. 46:1337-1345.

14. Geng, L., Y. Segal, B. Peissel, N. Deng, Y. Pei, F. Carone, HGRennke, AM Glücksmann-Kuis, MC Schneider, M. Ericsson, STReeders i J.Zhou. 1996. Identifikacija i lokalizacija policistina, PKD1(policistična bolest bubrega 1)genski proizvod. J. Clin. Istražite. 98:2674-2682.

15. Gong, S., XWYang, C. Li i N.Heintz. 2002. Visoko učinkovita modifikacija bakterijskih umjetnih kromosoma (BACs) korištenjem novih shuttle vektora koji sadrže R6Ky ishodište replikacije. Genome Res. 12;1992-1998.