Bolest bubrega: Kako nikal izaziva autofagiju u bubrezima?

Za više informacija:Ali.ma@wecistanche.com

Dio Ⅰ: Nikal inducira autofagiju putem puteva PI3K/AKT/mTOR i AMPK u bubregu miša

Heng Yin, Zhicai Zuo i dr.

1. Uvod

nikal(Ni), prirodni element, široko je rasprostranjen u dijelovima okoliša uključujući tlo, vodu i zrak (Schrenk et al, 2020). Ni (nikal)spojevi i metalni Ni (nikal)imaju mnoge industrijske i komercijalne primjene, kao što su proizvodnja legura, galvanizacija, nikal-kadmijeve baterije i katalizator u kemijskoj i prehrambenoj industriji (Genchi et al., 2020.). Međutim, velika industrijska uporaba Ni (nikal)dovodi do široko rasprostranjenog onečišćenja okoliša, što povećava rizik od ljudske izloženosti Ni putem hrane i vode za piće (Das et al, 2018). Iako Ni (nikal) esencijalni mikronutrijent za ljude i životinje, prekomjerna izloženost Niju izuzetno je opasna za ljudsko zdravlje (Das et al., 2018).

S povećanjem učestalosti Ni (nikal)kontaminacije posljednjih godina, toksikologija Ni, uključujući imunotoksičnost, hepatotoksičnost, nefrotoksičnost i plućnu toksičnost, privukla je sve veću pozornost (Gathwan i sur., 2013; Deng i sur., 2016; Hasanein i Felegari, 2017; Guo i sur., 2020a 2020b). Thebubreg, kao važan ciljni organ u Ni (nikal)toksikologije, s nakupljanjem Ni (nikal)i Ni (nikal)njegovi spojevi kroz kroničnu izloženost mogu uzrokovati značajno oštećenje bubrega (Elangovan et al, 2018). Postojeća istraživanja našeg istraživačkog tima pokazala su indukciju oksidativnog stresa, apoptoze, upale i zaustavljanja staničnog ciklusa ububregbrojlera NiCl2 (nikalklorid 2) u hrani u količini većoj od 300 mg/kg (Guo et al, 2014, 2016a, 2016b). Nekoliko je studija sugeriralo da mehanizam renalne toksikologije Ni uključuje oksidativno oštećenje, lomljenje lanaca DNA i apoptozu (Lee i sur., 2001.; Chen i sur., 2010.).

Igra ključnu ulogu u staničnoj homeostazi,autofagijaUtvrđeno je da je povezan s incidencijom i patogenezom različitih bolesti (Martin et al, 2019). Nedavne studije pokazale su da smrt stanica može biti uzrokovana nekontroliranim ili pretjeranim stimuliranjemautofagija(Denton i Kumar, 2019.). Kao složen i visoko uređen unutarstanični proces,autofagijapočinje formiranjem dvomembranskih vezikula poznatih kao autofagosomi koji zahvaćaju dio citosola i organela (Martin et al, 2019). Nakon toga, autofagosomi sudjeluju u proteolizi progutanih tvari nakon prelaska na lizosome.

Autofagijaje osjetljiv na različite vrste staničnog stresa, kao što je deprivacija čimbenika rasta ili hranjivih tvari, hipoksija, oštećenje DNA, reaktivne kisikove vrste (ROS), agregacija proteina, unutarstanični patogeni ili oštećenje organela (Dodson et al, 2013). To je iznimno složen proces za reguliranjeautofagija, uključujući puno signalnih putova, uključujući adenozin monofosfat-aktiviranu protein kinazu (AMPK), fosfatidilinozitol 3-kinazu-I (PI3K) i ciljne puteve rapamicina (mTOR) kod sisavaca (Cao et al2021). A mTOR put ima ključni učinak uautofagijainicijacija. Aktivnost mTOR-a ključna je kontrolna točkaautofagija, čiji inhibitorni učinak dovodi do defosforilacije ULK1autofagijainhibicija (Parzvch i Klionsky, 2014). Nadalje, PI3K/Akt i AMPK glavni su uzvodni regulatori mTOR-a (Gong et al, 2020; Xu et al, 2020). Prijašnja istraživanja pokazala su da teški metali (kao što su Cd, Hg, Cu i Pb) mogu izazvati pojavuautofagija(Su et al, 2017). Iako Huang et al. (2016) i Son et al. (2017) utvrdili su da Ni (nikal)izloženost mogla učinkovito izazvatiautofagijau epitelnim stanicama bronha, točan mehanizam je još uvijek nejasan,

Učinak Ni (nikal)naautofagijaje rijetko prijavljena, a dostupno je samo nekoliko studija o učincima Ni na bubregeautofagijamiševa in vivo. Stoga, trenutni rad ima za cilj potvrditi je li NiCl2 (nikalklorid 2)liječenje može izazvatiautofagijate procijeniti potencijalni mehanizam NiCl (nikalklorid)- izazvanaautofagija, uključujući AMPK i PI3K/AKT/mTOR puteve.

Nikal utječe na bubrege i uzrokuje bubrežne bolesti

Kliknite na Cistanche za bolest bubrega

2. Materijali i metode

2.1. Kemikalije i antitijela

nikalklorid(NiCl) osigurao je Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd (Chengdu, Kina). U imunoblot analizi, sva su antitijela nabavljena od Cell Signaling Technology (CST, SAD), uključujući anti-zečji mikrotubule povezani s proteinom1 lakog lanca 3B(LC3B) (kat. br. 43566T), anti-zečji p62 (SQSTM1) (kat. br. 5114D), anti-zečji Beclin1 (kat br. 3495T), anti-zečjiautofagijasrodni protein12 (Atg12) (kat. br. 4180T), anti-zečji Atg5 (kat. br. 12994T), anti-zečji Atg16L1 (kat. br. 8089T), anti-zečji Atg7 (kat. br. 8558T), anti-zečji Atg3 ( Kat. br. 3415T), anti-zečja meta sisavaca rapamicina (mTOR) (Kat. br. 2983T), anti-zečja p-mTOR (Kat. br. 5536T), anti-zečja unc-51 poput kinaze 1 (ULK1) )(Br. kat. 8054D), anti-zečji p-UIK1 (br. kat. 5869T), anti-zečji PI3K (br. kat. 4292S), anti-zečji p PI3K (br. kat. 4228T, anti-zečji Akt (br. kat. .9272S), anti-zečji p-Akt (kat. br. 4060T), anti-zečji mTOR (kat. br. 2972S), anti-zečji p-mTOR (kat. br. 5536S), anti-zečji AMPK (kat. br. 5831S) ), anti-zečji p-AMPK (kat. br. 2535S) i -aktin (kat. br. 4970T).

2.2. Životinje i tretmani

Ukupno 160 zdravih muških ICR miševa starih osam tjedana osigurala je Dashuo Biological Technology Company (Chengdu, Kina). Sve su životinje držane u stalnim uvjetima (temperatura 25±2C; 12-h ciklus svjetlo-tama) u aseptičnim okruženjima i hranjene standardnom peletiranom hranom i vodom ad libitum. Miševi su nasumično razvrstani u četiri skupine, od kojih je svaka sadržavala četrdeset mikroba nakon sedmodnevne aklimatizacije. Kontroli je intragastrično davana destilirana voda, dok je Ni (nikal)(NiCl2 (nikalklorid 2).6H2O) s dozama od 7,5, 15 i 30 mg/kg davane su intragastrično za životinje u eksperimentalnim skupinama. Ovdje usvojeni Ni određen je prema vrijednosti srednje letalne doze (LD50, 306,11 mg/kg) postignutoj u istraživanju akutne oralne toksičnosti muških miševa. NiCl (nikalklorid).6HZO je razrijeđen destiliranom vodom prije izvođenja pokusa. Četiri skupine su dobile dozu od 1 mL na 100 g tjelesne težine jednom dnevno tijekom 28 dana. Nakon tretmana od 14 i 28 dana, sve životinje su žrtvovane na human način da se pokupe njihovebubreguzorke za analizu u odjeljcima u nastavku. Sve pokusne životinje i postupci provedeni su nakon dogovora koji je dobio odobrenje od strane Zbrinjavanja životinja i Etičkog odbora Poljoprivrednog sveučilišta Sichuan (br. odobrenja: 2012-024, Chengdu, Kina).

2.3. Određivanje indeksa i funkcija bubrega

Svi miševi su vagani svaki tjedan i humano žrtvovani po završetku tretmana, a zatimbubregaizrezani su i izvagani. Thebubregkorišteni indeks bio je omjer izmeđububregtežinu i tjelesnu težinu.

Istraživači su mjerili dušik uree u krvi (BUN) i razine kreatinina u serumu (CRE) slijedeći upute komercijalnih kompleta koje je proizveo Naniing Jiancheng Bioengineering Institute of China (Nanjing, Kina),

2.4. Određivanje nakupljanja Ni u bubrezima (nikal)

Bubreguzorci su uzeti 28. dana tijekom eksperimenta. Zatim, 1 mL HClO i 9 mL HNO. (Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd., Kina) korišteni su za mokru probavu 0.5 g uzoraka tijekom 24 sata u epruvetama otpornim na visoke temperature. Zatim su ove epruvete stavljene na vruću ploču da ispari sva tekućina, nakon čega je uslijedila suspenzija ostatka upotrebom 10 mL 0,1 M/L HNO. Nakon toga, istraživači su analizirali uzorke u smislu Ni (nikal)uz pomoć plamenog atomskog apsorpcijskog spektrofotometra (AAS700, PerkinElmer, SAD).

2.5. Histopatološko i ultrastrukturno promatranje

Nakon što se sakupi i zatim fiksira u 4 posto paraformaldehida,bubreguzorci su dehidrirani alkoholom, uklopljeni u parafin, izrezani na 5 um, i obrađeni da se boje hematoksilinom i eozinom. Digitalni fotoaparat (Nikon DS-Ri1, Japan) korišten je za promatranje rezova i snimanje fotografija za histopatološke promjene. Deset mikroskopskih polja svakogbubregsu pregledani. Slike prikazane u radu bile su reprezentativne.

Za ultrastrukturnu procjenu, za fiksiranje je primijenjen 2,5 postotni glutaraldehidbubregtkiva (oko 1 mm5) na sobnoj temperaturi. Nakon toga je uslijedilo naknadno fiksiranje ovih tkiva u 1 posto osmij tetroksida, dehidriranih u acetonu i uklopljenih u epoksidnu smolu. Pripremljene ultra-tanke kriške stavljene su na bakrene rešetke i zatim obojene uranil acetatom i olovnim acetatom. Slike ultrastrukture snimljene su pomoću JEM-1400Flash prijenosnog elektronskog mikroskopa (JEOL, Japan).

obnoviti i poboljšati rad bubrega: cistanhe

2.6. Imunohistokemijski

Nakon deparafinacije pomoću ksilena, parafinske su kriške rehidrirane korištenjem stupnjevane otopine etanola. Nakon toga je slijedilo ispiranje destiliranom vodom i PBS-om, te 15-minutno blokiranje aktivnosti endogene peroksidaze (EPA) kroz inkubaciju korištenjem 3 posto H,O u metanolu za gašenje EPA. Kako bismo olakšali pronalaženje antigena, tretirali smo rezove mikrovalnim zagrijavanjem 15 minuta u 0.01 M puferu natrijevog citrata s pH od 6,0. Nakon zasićenja normalnim 10 postotnim kozjim serumom 30 minuta, kriške su zatim podvrgnute inkubaciji korištenjem primarnih antitijela preko noći na 4 stupnja. 1-postotno biotinilirano kozje anti-zečje/mišje IgG sekundarno protutijelo (Boster, Wuhan, Kina) korišteno je za inkubaciju rezova ispranih s PBS-om na 37 stupnjeva tijekom 1 sata, a zatim na 37 stupnjeva streptavidin-biotin kompleks (SABC;Boster , Wuhan, Kina) korišten je 30 minuta. Nakon toga uslijedilo je uranjanje kriški u diaminobenzidin hidroklorid (DAB; Boster, Wuhan, Kina) za vizualizaciju imunološke reakcije. Konačno, nakon laganog kontrastnog bojenja pomoću hematoksilina, rezovi su dehidrirani etanolom, pročišćeni ksilenom i postavljeni sukcesivno.

Integrirana optička gustoća (IOD) korištena je za kvantifikaciju razina proteina LC3B i p62. Analitička metoda za IOD vrijednost odnosi se na Fanget al. (2018). Za snimanje slika usvojen je Nikon DS-Ril digitalni mikroskopski sustav kamere (Japan). Istraživači su zatim odabrali pet polja（0.064 mm²）u svakom području slike svakog presjeka za analizu uz pomoć softvera Image-Pro Plus v6.0 (Media Cy-bernetics Inc, Bethesda, MD, SAD ).

2.7. Western blotting

Ekstrakcija proteina izbubreguzoraka provedeno je korištenjem pufera za lizu RIPA, a za mjerenje koncentracije korišten je reagens za analizu BCA proteina (P0010S, Beyotime Technology, Kina). Zatim je provedena SDS-PAGE za uzorke proteina, koji su nakon toga prebačeni na nitrocelulozne membrane. Blokirane korištenjem 5 posto obranog mlijeka tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi, membrane su inkubirane s primarnim protutijelima na 4 stupnja preko noći. Nakon korištenja sekundarnog protutijela konjugiranog s peroksidazom hrena za inkubaciju tijekom 1 sata, Chemidoc XRS je korišten za otkrivanje proteinskih traka na membranama pomoću ECL kompleta (P0018A, Beyotime Technology, Kina).

2.8. Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu (qRT-PCR)

Bubreziuzete su i samljevene s tekućim dušikom u mužaru pomoću tučka, a zatim očuvane na niskoj temperaturi (-80 stupnjeva), ukupna bubrežna RNA ekstrahirana je pomoću RNAiso Plus (9108/9109, Takara, Otsu, Japan) prema preporukama iz proizvođač. Nakon toga je uslijedila sinteza komplementarne DNA (cDNA) s kompletom reagensa RR047A Prim-ScriptTM RT koji proizvodi Takara u Japanu prema uputama. Nakon toga, qRT-PCR je proveden korištenjem LightCycler ⑩ 480 Real-Time PCR System (Bio-Rad, SAD) i SYBR Premix Ex TaqTMII kompleta (DRR820A, Takara, Japan). Primeri korišteni za PCR navedeni su u tablici 1. -aktin je korišten za normalizaciju ekspresije gena, a relativna ekspresija mRNA izračunata je 2-4ac metodom (Livak i Schmittgen, 2001.).

2.9. Statistička analiza

Podaci su izraženi u obliku srednje vrijednosti ± standardne devijacije i analizirani pomoću LSD ili Dunnettove T3 analize varijance. Softver SPSS (verzija 22.0, IBM Corp, Armonk, NY, SAD) korišten je za sve statističke analize za Windows. P<0.05 represents="" a="" significant="">

Tablica 1: Redoslijed početnica korištenih u studiji,

3. Rezultati

3.1.NiClz (nikalklorid)otežava rad bubrega

Kao što je prikazano na slici 1A, tjelesna težina se smanjila u tri skupine tretirane NiCl2 (nikalklorid 2). Također je utvrđeno značajno smanjenje u relativnoj težinibubreg(P<0.05) in="" the="" 30="" mg/kg="" group="" at="" 28="" days="" (fig.="">

Serumski CRE i BUN korišteni su kao standardni biomarkeri za bubrežnu funkciju. Rezultati bubrežne funkcije prikazani su na sl. 1C i D, a koncentracije CRE i BUN bile su značajno povećane (P<0.05)in the=""> (nikalklorid 2)- skupine za liječenje 14. i 28. dana u odnosu na kontrolu.

Slika 1E pokazuje da tri Ni (nikal)terapijske skupine imaju znatno veće koncentracije Ni u bubrezima (P<0.05)compared to="" the="">

3.2. NiCl (nikalklorid)- izaziva histopatološke varijacije bubrega

Slika 2 pokazuje da NiClz (nikalklorid)liječenje je uzrokovalo histopatološke varijacijebubregs dozama i vremenom, uključujući natečeni glomerul zajedno sa suženim prostorom kapsule, vakuolarnu i granularnu degeneraciju u epitelu bubrežnih tubula.

Slika 2. NiCl2 (nikalklorid 2)izaziva histopatološke promjene u bubrezima.

Histopatološke lezije uključivale su natečeni glomerul zajedno sa suženim prostorom kapsule (*), vakuolarnu degeneraciju (crne strelice) i granularnu degeneraciju (bijele strelice) u epitelima bubrežnih tubula. HE bojenje, skala=50 µm.

3.3.NiCl (nikalklorid)inducira autofagiju i povećava gene i proteine ​​povezane s autofagijom u bubrezima

LC3 i p62 ključni su biomarkeriautofagija(Gomez-San-chez et al..2016). U usporedbi s kontrolom, tri NiCl2 (nikalklorid 2) liječene skupine svjedočile su značajnom povećanju razine proteina LC3-I/I (P< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28,="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" protein="" level="" of="">< 0.05)(fig.3a-c).="" inconsistent="" with="" the="" protein="" experiment="" results,="" relative="" to="" the="" control="" group(fig.="" 3d="" and="" e),="" the="" treatment="" groups="" showed="" significantly="" increased="" mrna="" expression="" level="" of="" lc3=""><0.05)and significantly="" decreased="" mrna="" expression="" level="" of=""><0.05). otherwise,="">autofagijatakođer je određivanje TEM-om u ovoj studiji. Kao što je prikazano na slici 3F, TEM promatranja su pokazala da je broj autolizosoma povećan u bubrežnom tkivu nakon NiCl2 (nikalklorid 2)izlaganje.

Slika 3. NiCl2 (nikalklorid 2)povećava autofagiju u bubrezima miševa.

(A) Rezultati Western blota LC3 i p62. (B, C) Kvantifikacija LC3-II/I i p62. (DE) Ekspresija mRNA LC3 i p62. (F)

Ultrastrukturna struktura epitelne stanice proksimalnog zavojitog tubula (desne slike pokazuju djelomično povećanje lijevih slika; crne strelice označavaju strukture autolizosoma).

Vrijednosti su prikazane sa sredinom ± standardna devijacija (n {{0}}). Stupci označeni različitim slovima značajne su razlike (P <>

Nadalje, imunohistokemija je korištena za mjerenje razine proteina LC3B i p62 ububregtkiva u ovoj studiji. Kao što je prikazano na slici 4, pozitivne stanice obojene su smeđe, a LC3B i p62 su uglavnom eksprimirani u citoplazmi epitelnih stanica bubrežnih tubula. U usporedbi s kontrolom, IOD vrijednosti LC3B pokazale su značajan porast (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (nikalklorid) 14. i 28. dana. Osim toga, IOD vrijednosti p62 značajno su smanjene (P< 0.05)in="" these="" three="" treatment="" groups="" on="" days="" 14="" and="" 28="" when="" in="" comparison="" with="" the="">

Slika 4. Imunohistokemijski rezultati LC3B i p62 u bubrezima miševa.

(A) Imunohistokemijske slike LC3B. (ljestvica =50 µm) (B) Imunohistokemijske slike p62 (ljestvica =50 µm)

(C) Integrirana optička gustoća (IOD) LC3B. (D) Integrirana optička gustoća (IOD) p62.

Vrijednosti su prikazane sa sredinom ± standardna devijacija (n {{0}}). Stupci označeni različitim slovima značajne su razlike (P <>

Geni i proteini povezani sautofagijai uključeni uautofagijafluksa su izmjereni kako bi se dodatno potvrdili učinci NiCl (nikalklorid) naautofagija. To uključuje Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 i Atg3 (Li i Zhang. 2019; Nishimura i Tooze, 2020). Kao što je prikazano na sl. 5A-C, u usporedbi s kontrolom, tretirane skupine Ni (nikal)pokazuju značajno više razine proteina Beclinl, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 i Atg3(P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" additionally,="" the="" treatment="" groups="" of="" ni="" also="" exhibited="" significantly="" elevated="" mrna="" expressions="" of="" beclin1,="" atg5,="" atg12,="" atg16l1,="" atg7,="" and=""><0.05)on days="" 14="" and="" 28="" of="" the="" experiment="" (fig.6d-e)relative="" to="" the="">

Slika 5. NiCl2 (nikalklorid 2)povećava gene i proteine ​​povezane s autofagijom u bubrezima miševa.

(A) Rezultati Western blota za Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 i Atg3. (B&G) Kvantifikacija ekspresije proteina Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 i Atg3.

(HM) Ekspresija mRNA Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 i Atg3. Vrijednosti su prikazane sa sredinom ± standardna devijacija (n=8). Stupci označeni različitim slovima značajne su razlike (P <>

3.4.NiCl2 (nikalklorid 2)inducira puteve PI3K/Akt/mTOR i AMPK u bubrezima

mTOR je bitan regulatorautofagija(Wang et al., 2017). A dobro uspostavljeni uzvodni regulatorni putovi mTOR-a uključuju PI3K/Akt i AMPK (Gong et al..2020:Xu et al..2020). Stoga je ova studija mjerila proteine ​​puteva AMPK i PI3K/Akt.

Kao što slike 6A i B pokazuju da su razine proteina p-PI3K, p-AKT i p-mTOR značajno smanjene (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (nikalklorid 2)14. i 28. dana pokusa u odnosu na kontrolu. Terapijske skupine pokazale su značajno više razine proteina p-AMPK i p-ULK1 (P<0.05)than those="" of="" the="" control="" on="" days="" 14="" and="" 28.="" it="" can="" be="" seen="" from="" fig.6="" chat,="" compared="" to="" the="" control.="" the=""> (nikalklorid 2)- otkriveno je da su skupine za liječenje imale značajno smanjenje ekspresije mRNA PI3K, AKT i mTOR (P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" ampk="" and="" ulk1="" of="" the="" treatment="" groups="" showed="" significant="" increases="" in="" mrna="">< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28="" in="" comparison="" with="" the="" control.="">Ovi rezultati to otkrivajuautofagijaizazvan NiCl2 (nikalklorid 2)u bubregu miša uključeni putevi AMPK i PI3K/Akt/mTOR.

Slika 6. NiCl2 (nikalklorid 2)inducira PI3K/Akt/mTOR i AMPK signalne puteve u bubrezima miševa.

(A) Rezultati Western blota p-PI3K, PI3K, p-AKT, AKT, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR, p-ULK1 i ULK1.

(BF) Kvantifikacija ekspresije proteina p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, p-AMPK/AMPK, p-mTOR/mTOR i p-ULK1/ULK1. (G, K)

Ekspresija mRNA PI3K, AKT, AMPK, mTOR i ULK1. Vrijednosti su prikazane sa sredinom ± standardna devijacija (n=8). Stupci označeni različitim slovima značajne su razlike (P <>

KLIKNITE OVDJE ZA RAZDJELⅡ