Kontakt:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui‐ying Shi|Ya‐jun Yang|Wei Chen|Lian-feng Zhang|Chuan Qin

Cistanche djeluje protiv starenja

Sažetak

Pozadina: Pad regenerativne sposobnosti i homeostaze organa povezan s vremenom glavna je značajkastarenje. Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus korišteni su kao tradicionalni kineski biljni lijekovi za jačanje imuniteta i produljenje života. Međutim, nepoznat je mehanizam kojim ovaj biljni lijek usporava starenje. U ovoj studiji istraživali smo mehanizam biljnogučinak protiv starenja.

Metode: Miševi su hranjeni hranom s dodatkom R. glutinosa ili A. membranaceus tijekom 10 mjeseci; kontrolna skupina je hranjena standardnom prehranom. Fenotipovi su procijenjeni korištenjem sustava ocjenjivanja i analize preživljavanja. Postoci fenotipova starenja hematopoetskih matičnih stanica (HSC) određeni su analizom razvrstavanja stanica aktiviranih fluorescencijom. Funkcija i mehanizam HSC-a analizirani su klonogenim testom i lančanom reakcijom polimeraze u stvarnom vremenu.

Rezultati: Theučinak protiv starenjaR. glutinosa je zbog pojačane funkcije HSC. Miševi hranjeni R. glutinosa pokazali su karakteristike usporenogstarenjeprocesa, uključujući smanjeno starenje i povećanu stopu preživljavanja. Analiza protočne citometrije pokazala je smanjen broj stanica Lin–Sca1 plus c‐kit– (LSK), dugotrajnih HSC (LT‐HSC) i kratkoročnih HSC (ST‐HSC) u skupini R. glutinosa. In vitro, klonogene analize pokazale su povećanu sposobnost samoobnavljanja LT‐HSC iz skupine R. glutinosa kao i održavanje mirovanja LSK putem pojačane ekspresije p18. Grupa R. glutinosa također je pokazala smanjene razine reaktivnih kisikovih vrsta i postotak ‐gal plus stanica kroz nižu regulaciju proteina p53 i p16 povezanog sa staničnim starenjem.

Zaključak: Rehmannia glutinosa djelujeprotiv starenjaučinke održavanjem mirovanja i smanjenjem starenja HSC-a.

KLJUČNE RIJEČI: anti-aging, hematopoetske matične stanice, mirovanje, Rehmannia glutinosa

1|UVOD

Starenje se definira kao funkcionalno opadanje ovisno o vremenu koje pogađa većinu živih organizama.1 Dugovječnost organizama uglavnom održavaju matične stanice.2 Matične stanice specifične za tkivo imaju sposobnost samoobnavljanja i diferenciraju se u različite efektorske stanice. 3 Međutim, tijekom procesa starenja, ovaj kapacitet samoobnavljanja opada, što na kraju dovodi do nakupljanja nepopravljenih, oštećenih tkiva u ostarjelim organizmima.4 Gubitak sposobnosti održavanja ravnoteže između mirovanja i diferencijacije u matičnim/progenitorskim stanicama odjeljak može dovesti do smrti ili bolesti povezanih sa starenjem.2 Nadalje, nedavne studije sugeriraju da pomlađivanje matičnih stanica može preokrenuti fenotip starenja.5,6 U hematopoetskom sustavu, hematopoetske matične stanice (HSC) odgovorne su za proizvodnju krvnih stanica. U starih miševa, hematopoetski sustav pokazuje oštećenje T- i B-limfoidnih stanica i broj mijeloidnih stanica je povećan. Stariji HSC-i pokazali su smanjenu aktivnost samoobnavljanja i smanjenu rekonstruktivnu sposobnost hematopoeze. Značajno, promjene vezane uz dob u odjeljku HSC-a očituju se kod domaćina koji stari kao anemija, povećana sklonost mijeloproliferativnim neoplazmama, smanjena imunološka funkcija i povećana učestalost raka.7-9 Međutim, mehanizam starenja HSC-a i učinci biljnih lijekova na starenje HSC-a su nepoznati.10

Ljudi su se od davnina bavili odgađanjem procesa starenja i očuvanjem mladostiprotiv starenjatrenutno je fokus istraživanja. Tradicionalna kineska medicina dobiva sve veću pozornost za liječenje raznih bolesti povezanih sa starenjem. Poznato je da mnoge biljke koje se koriste u tradicionalnoj kineskoj medicini imaju pozitivne učinke protiv starenja kroz različite mehanizme. Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus naširoko se koriste na ovaj način već tisućama godina.

Rehmannia glutinosa koristi se za liječenje raznih dijabetičkih poremećaja, pospješuje metabolizam kostiju kod osteoporoze i sprječava upalu jetre i fibrozu. Osim toga, ova biljka ima i druge učinke, uključujućiprotiv umora, antidepresivna i neuroprotektivna svojstva. U proteklih nekoliko godina, farmakološke studije o bakteriji R. glutinosa i njenim aktivnim komponentama uglavnom su se usredotočile na njezino opsežno djelovanje na krvni, endokrini, kardiovaskularni i živčani sustav.11-14 Tako se pokazalo da R. glutinosa posjeduje snažan imunološki ‐aktivnost poboljšanja, koja je dala teorijsku osnovu za daljnja istraživanja.

Astragalus membranaceus posjeduje tonična, hepatoprotektivna, diuretička i iskašljavajuća svojstva15 i pokazalo se da pokazuje imunomodulatorna,16protuupalno,iantioksidansučinci.17 Razjašnjavanje molekularnih mehanizama koji leže u pozadini učinaka tradicionalnih kineskih lijekova u kliničkoj praksi ključni je korak prema njihovoj svjetskoj primjeni, a ova je tema trenutno predmet intenzivnog istraživačkog interesa.

Stoga smo u ovoj studiji hranili miševe hranom s dodatkom R. glutinosa i A. membranaceus tijekom 10 mjeseci kako bismo istražili mehanizam na kojem se temelji sposobnost R. glutinosa da produži životni vijek.

2|MATERIJALI I METODE

2.1|Grupiranje i tretman životinja

Ženke miševa C57BL/6J držane su u okruženju bez patogena i hranjene standardnom prehranom. Korištenje životinja u ovoj studiji odobrili su Odbori za brigu i korištenje životinja Instituta za laboratorijske životinjske znanosti Medicinskog fakulteta Peking Union. Miševi (u dobi od 10 mjeseci) nasumično su podijeljeni u tri skupine (n=20/skupina). Kontrolna skupina hranjena je standardnom prehranom (Beijing HFK Biosicence, Peking, Kina). Prehrana druge dvije skupine nadopunjena je mljevenom R. glutinosa i A. membranaceus (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Peking, Kina) u dozi od 200 mg/dan tijekom 10 mjeseci. Ova je doza odabrana metodom normalizacije tjelesne površine kako bi se potvrdile doze lijeka iz studija na ljudima do studija na miševima. Tjelesna težina određivana je svaka 2 mjeseca, a preživljenje je bilježeno svakodnevno.

2.2|Procjena stupnja starenja

Sustav ocjenjivanja usvojen je za procjenu stupnja starenja prema kriterijima koje su definirali Takeda et al.18 Svaka kategorija navedena u protokolu odabrana je među kliničkim znakovima povezanim s procesom starenja. Svaki miš je ocjenjivan u dobi od 18 mjeseci i rezultati u svakoj kategoriji su zbrojeni kako bi se odredio ukupni rezultat ocjenjivanja.

2.3|Protočna citometrija

Stanice su sakupljene iz timusa, slezene, periferne krvi (PB) i koštane srži (BM). Slezena i timus su odmah izrezani, isprani fiziološkom otopinom i izvagani. Slezene i timusi su nježno homogenizirani u staklenom homogenizatoru, a stanice su suspendirane u sterilnoj fiziološkoj otopini puferiranoj fosfatom (PBS). Stanice iz PB primijenjene su na lizu crvenih krvnih stanica (BD Biosciences, San Jose, CA, SAD). Stanice iz BM izolirane su ispiranjem obje tibije i femura sterilnim PBS-om. Sve su stanice izolirane filtracijom preko sterilne najlonske mrežice i bojene 30 minuta na 4 stupnja sljedećim antitijelima konjugiranim s fluoroforom: anti-CD3 konjugiranim s fikoeritrinom (PE) (G4.18), anti-CD3 konjugiranim s alofikocijaninom (APC) ‐ CD4 (OX35) i PE-Cy7-konjugirani anti-CD8a (OX8). Za BM stanice, markeri loze su obojeni biotinom konjugiranim anti-mišjim CD4 (RM4-5), CD5 (53-7,3), CD8a (53-6,7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), TER119 (TER‐ 119) i Gr1 (RB6‐8C5), nakon čega je uslijedilo bojenje s antitijelom APC‐eFluor 780-konjugirani streptavidin također je dobiven od eBioscience (San Diego, CA, SAD). Za površinsko bojenje korištena su sljedeća protutijela: APC imunoglobulin (Ig)M (II/41), fluorescein izotiocijanat (FITC) IgD (11‐26), PE‐Cy7 Sca‐1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3-6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP-Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) i PerCP-Cy5.5 CD3e (145-2C11). Sva antitijela su dobivena od eBiosciences (San Diego, CA, SAD). Podatke je prikupio FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, SAD) i analiziran pomoću softvera FlowJo (Three Star, Ashland, OR, SAD).

2.4|Analiza staničnog ciklusa

Za analizu staničnog ciklusa, ukupne BM stanice obojene su na markere površine matičnih stanica (Lin–Sca‐1 plus c‐KitHigh; LSTKs), zatim fiksirane i permeabilizirane (00‐5123‐43; Becton Dickinson ) prije bojanja FITC Ki‐

67 antitijelo i 7-aminoaktinomicin D (7-AAD). Prikupljanje podataka provedeno je na FACS Aria II (Becton Dickinson). Podaci su analizirani pomoću softvera FlowJo.

2.5|Gal bojenje povezano sa starenjem

Aktivnost povezana sa starenjem (SA)-gal također je ispitana protočnom citometrijom pomoću C12FDG kako je opisao proizvođač (Molecular Probes, Eugene, OR, SAD). Ukratko, matične stanice prvo su obojene na površinske markere stanica, a zatim inkubirane sa 100 nmol L−1 bafilomicina A1 tijekom 1 sata na 37 stupnjeva kako bi se inducirala alkalinizacija lizosoma. Nakon ispiranja s PBS-om, stanice su inkubirane s 2 mmol L-1 C12FDG 1-2 sata na 37 stupnjeva i zatim analizirane pomoću FACS Aria I (Becton Dickinson).

2.6|Određivanje proizvodnje reaktivnih kisikovih spojeva (ROS).

Stanice su inkubirane s diklor-dihidro-fluorescein diacetatom (DCFH-DA; Beyotime, Shanghai, Kina) na 37 stupnjeva tijekom 20 minuta. DCFH-DA pasivno difundira u stanice, gdje ga deacetiliraju esteraze da nastane nefluorescentni 2',7'-diklorofluorescein (DCFH). Količina emitirane fluorescencije u korelaciji je s količinom ROS u stanici. Podaci su prikupljeni na FACS Aria I (Becton Dickinson) i analizirani pomoću softvera FlowJo.

2.7|Analiza lančane reakcije polimerazom (PCR) u stvarnom vremenu

Ukupna RNA ekstrahirana je iz stanica pomoću TRIzol reagensa (Invitrogen, San Diego, CA, SAD) prema uputama proizvođača. Geni od interesa umnoženi su iz ukupnih RNA tretiranih DNazom I korištenjem M-MLV reverzne transkriptaze (Promega, Madison, WI, SAD)

i poli-dT početnice. Prajmeri korišteni za PCR bili su sljedeći: p21 (5′‐TCCAGACATTCAGAGCCACA‐3’ i 5’‐CGAAGAGACAACGG-CACACT‐3’, Tm=60 stupanj, 30 ciklusa), p53 (5’‐CATGAACCGCCGACC- TATC‐ 3′ i 5′‐TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 stupanj , 35 ciklusa), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3’ i 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC‐3′, Tm=62 stupanj , 35 ciklusa), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3’ i 5’‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3’, Tm=61 stupanj , 30 ciklusa), p19 (5’‐ATGGGTCGCAGGTTCTTGGT‐ 3’ i 5’‐GTAGTGGGGTCCTCGCAGTT‐3 ′, Tm=61 stupanj , 35 ciklusa), p18 (5′‐GGGACCTAGAGCAACTTACT‐3′ i 5′‐TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA‐3′, Tm=61 stupanj , 30 ciklusa), gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (5′‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3′ i 5′‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3′, Tm=60 stupanj, 25 ciklusa). Real-time (RT)‐ PCR je proveden pomoću SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Japan) na ABI StepOne™ sustavu detekcije (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD).

2.8|Klonogeni testovi

Dugotrajne (LT) HSC sortirane su fluorescentno aktiviranim sortiranjem stanica (FACS) i zatim uzgajane u pločama s 96 jažica koristeći medij na bazi metilceluloze (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD) . Za svaki uzorak pripremljeno je deset ponovljenih jažica. Koristili smo ploču za kulturu stanica s 96 jažica, tri stanice po jažici. Dva tjedna nakon nasađivanja, broj i veličina kolonija izbrojani su pod mikroskopom.

2.9|Statistička analiza

Podaci su analizirani jednosmjernom ANOVA-om pomoću softvera Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, SAD) i GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, SAD). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. Smatra se da P < 0.05="" ukazuje="" na="" statističku="">

3|REZULTATI

3.1|R. glutinosa i A. membranaceus imale su učinak protiv starenja

Za potvrduefekti protiv starenjaR. glutinosa i A. membranaceus istraživali smo učinke primjene kao dodatka prehrani (200 mg/d). Nakon toga smo zabilježili tjelesnu težinu, stupanj starenja i stopu preživljavanja miševa. Tjelesna težina miševa hranjenih R. glutinosa ili A. membranaceus bila je normalna u usporedbi s onima u kontrolnoj skupini, iako je došlo do smanjenja tjelesne težine skupine R. glutinosa i A. membranaceus nakon 20 mjeseci (Slika 1A). Analiza stupnja starenja otkrila je stalan i nepovratan porast u ocjeni s godinama u skupinama R. glutinosa i A. membranaceus u usporedbi s onom u kontrolnoj skupini, iako je povećanje bilo izraženije u A. membranaceus skupina (Slika 1B). Visoki rezultat ocjenjivanja bio je posljedica ranijeg početka gubitka pasivnosti i reaktivnosti, gubitka sjaja kože i povećane grubosti, gubitka kose, perioftalmičnih lezija, povećane lordokifoze kralježnice i izraženijeg povećanja njihove ozbiljnosti.18 Miševi u A membranaceus skupina miševa pokazala je izraženije karakteristike fenotipa starenja, uključujući gubitak sjaja kože i gubitak kose. Krivulje preživljavanja pokazale su da je životni vijek miševa u skupinama R. glutinosa i A. membranaceus bio nešto duži od onog u kontrolnoj skupini (Slika 1C). Ovi podaci potvrdili suefekti protiv starenjai R. glutinosa i A. membranaceus, iako se pokazalo da je R. glutinosa učinkovitija u usporavanju procesa starenja.

SLIKA 1 Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus imale suefekti protiv starenja. Miševi su hranjeni hranom s dodatkom mljevene R. glutinosa ili A. membranaceus (200 mg/d); kontrolna skupina je hranjena standardnom prehranom. A, Promjene u tjelesnoj težini miševa mjerene svaka 2 mjeseca. B, Promjene u ocjeni starenja kod miševa s dobi. C, Krivulje preživljavanja. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD; n=20 miševa/skupini. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD; n=5 miševa/skupina.*P < 0,05,="" ***p=""><>

3.2|R. glutinosa smanjila je broj hematopoetskih matičnih stanica

Smatra se da je iscrpljenost matičnih stanica integrativna posljedica više vrsta oštećenja povezanih sa starenjem i jedan od glavnih uzroka starenja tkiva i organizma.1 Nedavne studije sugeriraju da pomlađivanje matičnih stanica može preokrenuti fenotip starenja na razini organizma.5 Mi pretpostavio da jeefekti protiv starenjabakterije R. glutinosa posredovane su poboljšanjem funkcije matičnih stanica. Stoga smo proveli protočnu citometrijsku analizu broja hematopoetskih matičnih/progenitorskih stanica izoliranih iz miševa (starih 20 mjeseci) hranjenih dijetama s dodatkom R. glutinosa ili A. membranaceus (200 mg/dan) tijekom 10 mjeseci (Slika 2A). . Postotak LSK-a bio je smanjen u skupinama R. glutinosa i A. membranaceus (Slika 2B). Broj LT- i kratkotrajnih (ST)- HSC-a smanjen je približno dvostruko u skupini R. glutinosa u usporedbi s brojem u kontrolnoj skupini (Slika 2C-D). Veći broj uobičajenih limfoidnih progenitora (CLP) otkriven je u skupini R. glutinosa u usporedbi s brojem u kontrolnoj skupini (Slika 2I). Nije bilo razlika u broju multipotentnih progenitora (MPP), uobičajenih mijeloidnih progenitora (CMP), granulocitno-makrofagnih progenitora (GMP) i megakariocitno-eritroidnih progenitora (MEP) u skupini R. glutinosa u usporedbi s brojem u kontrolna skupina. U skupini A. membranaceus nije bilo značajne razlike u broju LT- i ST-HSC u usporedbi s brojevima u kontrolnoj skupini (Slika 2C-D). Nadalje, nije bilo razlike u broju MPP, CMP, MEP i CLP stanica u usporedbi s brojevima u kontrolnoj skupini (Slika 2E, 2F, 2H i 2I); međutim, broj GMP je smanjen u skupini A. membranaceus. Stoga su miševi hranjeni hranom s dodatkom R. glutinosa pokazali smanjeni broj hematopoetskih matičnih i progenitorskih stanica.

3.3|R. glutinosa pojačala je funkciju i održala mirovanje HSC-a

Kako bi se procijenila funkcija HSC-a, klonogenski potencijal LT-HSC-a ispitan je in vitro. Razvrstali smo LT-HSCs stanice u medij na bazi metilceluloze koristeći FACS i izbrojali broj i veličinu kolonija nakon 14 dana. U usporedbi s brojem i veličinom kolonija koje su proizvele stanice miševa u kontrolnoj skupini, stanice miševa u skupini R. glutinosa pokazale su povećanje broja kolonija, posebno za malu veličinu (P=0.0241 ) i veliki klon (P=0.0418), dok nije bilo razlike u broju od miševa u skupini A. membranaceus (Slika 3). Povećana veličina i broj kolonija u skupini R. glutinosa sugerira da ova biljka povećava potencijal samoobnavljanja LT-HSC.

Većina HSC-a u odraslih miševa ostaje u stanju mirovanja;19 stoga je održavanje staničnog mirovanja bitan mehanizam za samoobnavljanje matičnih stanica.20,21 Uočeno smanjenje HSC-a ukazuje na smanjenu proliferaciju stanica u R. glutinosa i A. membranaceus skupine; stoga smo ispitali status staničnog ciklusa HSC-a analizom proliferativnog staničnog markera Ki-67 u kombinaciji s određivanjem sadržaja DNA 7-AAD u LSK populaciji. Uočili smo povećan broj LSK stanica u G0 fazi u skupinama R. glutinosa i A. membranaceus u usporedbi s onim u kontrolnoj skupini (Slika 4A). Ovi rezultati pokazuju da R. glutinosa i A. membranaceus održavaju mirovanje HSC-a.

PCR analiza regulatora staničnog ciklusa u LSK stanicama u stvarnom vremenu otkrila je da p18, p19 i p57 imaju kritične uloge u održavanju mirovanja HSC-a.22-24 Nisu uočene očite promjene za p57 i p19 (Slika 4C- D), a p18 je bio reguliran prema gore u skupini s R. glutinosa u usporedbi s onom u kontrolnoj skupini, a lagano je reguliran u skupini s A. membranaceus (Slika 4B).

SLIKA 2 Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus utjecali su na broj hematopoetskih matičnih/progenitorskih stanica. Miševi (stari

20 mjeseca) hranjeni su dijetama s dodatkom R. glutinosa ili A. membranaceus (200 mg/d) tijekom 10 mjeseci (n=5/skupina); kontrolna skupina je hranjena standardnom prehranom. Svježe izolirane stanice koštane srži (BM) obojene su navedenim antitijelima i analizirane protočnom citometrijom. A, Reprezentativni profili bojenja BM hematopoetskih matičnih stanica i populacija progenitorskih stanica. B, Postotak Lin–Sca1 plus c‐kit– stanica (LSK) u BM stanicama. C‐ I, Broj stanica (C) dugoročnog (LT; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit, CD34 plus –, Flt3–); D, kratkotrajni (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit, CD34 plus plus, Flt3–); E, multipotentni progenitor (MPP; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit plus, Flt3 plus); F, zajednički mijeloični preteča (CMP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34 plus, CD16/ CD32–); G, granulocitno-makrofagni progenitor (GMP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34 plus, CD16/CD32 plus); H, megakariocitno-eritroidni progenitor (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34–, CD16/CD32–); i I, zajednički limfoidni progenitor (CLP; Lin–, Sca‐1low, c‐ Kitlow, CD127 plus). Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD; n=5 miševa/skupini. *P <0,05, **p=""><>

3.4|R. glutinosa odgodila je starenje HSC-a

Dugotrajni dodaci prehrani s R. glutinosa mogu produžiti životni vijek miševa. Stanično starenje se povećava s godinama; stoga smo istražili starenje HSC u miševa koji stare protočnom citometrijskom analizom SA-‐gal obojenih HSC-a koristeći fluorescentni ‐gal supstrat (C12FDG).25 Postotak SA‐‐gal-pozitivnih stanica smanjen je u skupinu R. glutinosa, što ukazuje da R. glutinosa odgađa starenje LSK stanica (Slika 5A).

Reaktivne kisikove vrste igraju glavnu ulogu u starenju HSC-a, a gubitak mirovanja HSC-a često je povezan s povećanim staničnim ROS-om.26 Analiza unutarstaničnog ROS-a u LSK-ovima pokazala je da su razine smanjene u skupini R. glutinosa u usporedbi s onima u kontrolnoj skupini. skupinu (Slika 5B). Ovi podaci pokazuju da R. glutinosa može održavati mirovanje HSC-a i poboljšati funkciju HSC-a smanjenjem razine ROS-a.

Zatim smo istražili ekspresiju nekoliko gena uključenih u stanično starenje pomoću RT-PCR analize LSK stanica. U odnosu

SLIKA 3 Funkcija hematopoetskih matičnih stanica poboljšana dodacima Rehmannia glutinosa u ishrani. In vitro klonogenski potencijal dugotrajnih jetrenih zvjezdastih stanica miševa (n=3)

s kontrolnom skupinom, ekspresija proteina p53 i p16 povezanih sa staničnim starenjem bila je smanjena u skupini R. glutinosa (Slika 5D-E). Ali ekspresija p53 i p16 nije značajno smanjena između skupine A. membranaceus i kontrolne skupine (Slika 5D-E). Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da nekoliko ključnih gena povezanih sa staničnim ciklusom i staničnim starenjem reguliraju funkciju HSC-a kod miševa hranjenih hranom s dodatkom R. glutinosa.

3.5|R. glutinosa pojačala imunitet B-stanica

Limfociti B i T važni su za imunološke odgovore. Limfociti T imaju ključnu ulogu u staničnom imunitetu i njegovoj regulaciji, dok limfociti B sudjeluju uglavnom u humoralnom imunitetu. Proliferacija limfocita je najneposredniji pokazatelj koji odražava organsku imunost. Kako bi se istražila uloga u imunološkom poboljšanju, ispitani su učinci R. glutinosa i A. membranaceus na proliferaciju limfocita.

Miševi u skupini R. glutinosa pokazali su smanjen broj HSC-a i povećan broj CLP-a. Protočna citometrijska analiza pokazala je povećani broj zrelih B stanica (B220 plus) u PB, BM i slezeni miševa u skupini R. glutinosa u usporedbi s brojevima otkrivenim u kontrolnoj skupini (Slika 6A); međutim, nije bilo značajnih razlika u broju T stanica (CD4 plus i CD8 plus), monocita i granulocita (CD11b plus) između dviju skupina (Slika 6B-D). Dakle, ovi rezultati pokazuju da R. glutinosa u prehrani pojačava imunitet B-stanica.

SLIKA 4. Dodaci prehrani Rehmannia glutinosa i Astragalus membranaceus održavali su mirovanje krvotvornih matičnih stanica. A, Postotak stanica u svakoj fazi staničnog ciklusa. Protočna citometrijska analiza 7-aminoaktinomicina D (7-AAD) i Ki-67 bojenje Lin–Sca1 plus c-kit– stanica (LSK). B, Analiza lančane reakcije polimeraze u stvarnom vremenu ekspresije gena sortirane LSK stanice; Za normalizaciju je korišten GAPDH. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD tri eksperimenta. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

SLIKA 5 Dodatak prehrani Rehmannia glutinosa smanjio je starenje jetrenih zvjezdastih stanica (HSC). Miševi (stari 20 mjeseca) hranjeni su hranom s dodatkom Rehmannia glutinosa ili Astragalus membranaceus (200 mg/d) tijekom 10 mjeseci (n {{4 }}/skupina); kontrolna skupina je hranjena standardnom prehranom. A, Protočna citometrijska analiza SA‐‐gal‐pozitivnih stanica Lin–Sca1 plus c‐kit– (LSK) korištenjem fluorescentnog supstrata ‐galaktozidaze (C12FDG). B, Postotak stanica pozitivnih na reaktivne kisikove vrste (ROS) u LSK-ovima. Protočna citometrijska analiza ROS-pozitivnih LSK. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± standardna devijacija (SD). *P < 0.05,="" ***p="">< 0,001.="" c,="" obrazac="" ekspresije="" gena="" povezanih="" sa="" staničnim="" starenjem="" u="" lsk-ovima;="" za="" normalizaciju="" je="" korišten="" gapdh.="" podaci="" predstavljaju="" srednju="" vrijednost="" ±="" sd="" tri="" eksperimenta.="" *p=""><0,05, **p=""><0,01, ***p=""><>

4|RASPRAVA

U ovoj studiji istraživali smo mehanizamefekti protiv starenjaR. glutinosa ili A. membranaceus dopunjavanjem prehrane miševa s biljem u dozi od 200 mg/dan tijekom 10 mjeseci. Utvrđeno je da R. glutinosa pokazuje učinke protiv starenja, uključujući smanjeno starenje i povećano preživljavanje HSC-a, kao i

pojačan imunitet B-stanica. Što se tiče mehanizmaefekti protiv starenja, otkrili smo da je R. glutinosa smanjila broj HSC-a, dok je kapacitet proliferacije povećan. Nadalje, R. glutinosa je održavala HSC mirovanje i smanjivala broj SA‐‐gal‐pozitivnih stanica i razine ROS-a kroz regulaciju p18, p53 i p16. U kombinaciji, naši su rezultati potvrdili daefekti protiv starenjaR. glutinosa u miševa liječe se održavanjem mirovanja i pojačavanjem funkcije HSC-a.

Rehmannia glutinosa, koja se tisućama godina koristi kao tradicionalni kineski biljni lijek, može se koristiti za liječenje hipoglikemije kod raznih dijabetičkih poremećaja.27,28 Također je objavljeno da ekstrakt R. glutinosa poboljšava metabolizam kostiju.29 Nadalje, R. glutinosa inhibira upalne reakcije i sindrome,30,31 i štiti od oštećenja stanica hvatanjem slobodnih radikala.14,32 U ovoj smo studiji otkrili da dodatak prehrani miševa s R. glutinosa djelujeefekti protiv starenjai pojačan imunitet B-stanica povećanjem proliferativnog kapaciteta LT-HSC i smanjenjem broja SA--gal-pozitivnih stanica i razina ROS-a.

Utvrđeno je da se stupanj oksidativnog oštećenja povećava s godinama u raznim stanicama i tkivima. Oksidativni stres je kritična determinanta samoobnavljanja HSC. Gubitak mirovanja LT-HSC često je u korelaciji s povećanim staničnim ROS-om, što je negativno povezano sa samoobnavljanjem HSC-a.26 Catalpol je iridoidni glukozid koji je pronađen u korijenu R. glutinosa. Catalpol je u prethodnoj studiji pokazao inhibiciju oksidativnog stresa, oštećenja DNA i skraćivanja telomera putem PGC-1 /TERT puta.33 U našoj studiji, razina ROS-a bila je smanjena u LSK stanicama iz skupine R. glutinosa u usporedbi s kontrolnom skupinom. Tako R. glutinosa produljuje preživljavanje miševa inhibicijom oksidativnog stresa u HSC-ima.

SLIKA 6. Protočna citometrijska analiza postotka zrelih imunoloških stanica u perifernoj krvi (PB), koštanoj srži (BM), slezeni i timusu. Miševi (stari 20 mjeseca) hranjeni su hranom s dodatkom Rehmannia glutinosa ili Astragalus membranaceus (200 mg/dan) tijekom 10 mjeseci (n=5/skupina); kontrolna skupina je hranjena standardnom prehranom. A, Protočna citometrijska analiza postotka B stanica (B220 plus ) u PB, BM i slezeni. B, Protočna citometrijska analiza postotka monocitnih i granulocitnih stanica (CD11b plus ) u PB i BM. C i D, Protočna citometrijska analiza postotka CD4 plus i CD8 plus stanica u PB, slezeni i timusu. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD. *P <>

Astragalus membranaceus također se koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini za jačanje imuniteta, smanjenje šećera u krvi i poticanje apoptoze tumorskih stanica, a također imaantioksidacijaiprotiv starenjaSvojstva. U ovoj smo studiji otkrili da dodatak prehrani s A. memranaceusom tijekom 10 mjeseci nije imao očite učinke u usporedbi s onima primijećenima kod kontrolnih miševa, dok je težina miševa smanjena nakon 20 mjeseci. Stoga A. membranaceus može biti neprikladna za LT tretman hranjenih miševa.

Zaključno, naši rezultati pokazuju da R. glutinosa može produljiti životni vijek miševa održavanjem mirovanja i pojačavanjem funkcije HSC-a. Nadalje, R. glutinosa može smanjiti međustanične razine ROS-a i broj SA-‐gal-pozitivnih stanica te poboljšati imunitet B-stanica.

ZAHVALA

Ovu studiju djelomično su podržali Nacionalna znanstvena zaklada za Kinu (31672374), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2016‐ 12M‐ 1‐012) i PUMC Youth Fund (2017310018).

SUKOB INTERESA

Nijedan.

AUTORSKI PRILOZI

Svi navedeni autori ispunjavaju uvjete za autorstvo. CQ i LFZ osmislili su i dizajnirali eksperimente. LB je izveo pokuse i napisao glavni test rukopisa. GYS je izvršio i analizirao podatke FACS-a. YJY je osmislio eksperiment o kineskoj tradicionalnoj medicini. WC je upravljao miševima. Svi su autori pročitali i odobrili rukopis.