Going Micro in Leptospirosis Bolest bubrega Ⅱ

4. Imunološki odgovori domaćina na Leptospira spp.

Glavni put Leptospira je izravan prodor kroz sluznicu ili otvorenu kožu kroz krv, tkiva, urin ili kontaminiranu vodu, koja se širi sustavnom cirkulacijom i diseminira u nekoliko organa, npr.jetra, pluća i proksimalnog tubulanefron u bubrezima, gdje se može razmnožavati i preživjeti mjesec dana [51]. U početnoj fazi infekcije,urođeni imunološki odgovorigra temeljnu ulogu kao prva linija obrane kod leptospiroze, utječući na odgovorreceptori za prepoznavanje uzoraka, fagocitoza makrofaga, indukcija ekstracelularnognakupljanje neutrofila, iintervencija sustava komplementa [52].

Theimunološki odgovorkod ljudi igra bitnu ulogu urazvoj kliničkih znakova, kao i čimbenici virulencije nekih patogenih sojeva. Većina ljudskih leptospiroza je asimptomatska ili blaga, a samo 10% slučajeva razvije teške oblike s višeorganskim zatajenjem i povećanom stopom smrtnosti povezanom scitokinska olujai stanje imunološke paralize. Patogene vrste stimuliraju humoralni odgovor u fazi bakterijemije, iako naknadno ponašanjeimunološki odgovorje nejasno. U ispitivanjima pacijenata s višestrukim kliničkim manifestacijama leptospiroze, ozbiljnost kliničke slike bila je povezana s različitim razinama citokina u serumu, kao što su TNF-, IL-10 i IL-6 [53], ali ovaj zaključak ostaje kontroverzan [54]. Ova stanja dovela su do povećanog interesa za razumijevanje imunološkog odgovora općenito i bioloških događaja koji se događaju tijekom infekcije.

KOLIKO JE POTREBNO DA CISTANCHE DJELUJE?

4.1. Leptospira i sustav komplementa

Proteolitička aktivnost leptospiralnih proteaza protiv izvanstaničnog matriksa omogućuje infekciji da uđe u krvotok. Sustav komplementa u krvožilnom sustavu jedan je od glavnih mehanizama urođenog imunološkog odgovora na patogene leptospire. Međutim, Leptospira je razvila strategije za izbjegavanje napada sustava komplementa vezanjem proteina na molekule komplementa i proizvodnjom proteaza, kao što je termolizin, termostabilni neutralni enzim metaloproteinaze koji utječe na lanac C3 proteina. Patogeni sojevi vežu faktor H (FH), protein 1 povezan s faktorom komplementa H (FHR-1), protein 1 sličan faktoru H (FHL-1) i vezni protein C4b (C4BP), svi od kojih su odgovorni za inhibiciju sustava komplementa [55]. Postoje tri glavne strategije za izbjegavanje komplementa kod patogenih Leptospira [55,56] kroz interferenciju regulatora komplementa domaćina, proteaze domaćina i bakterijske proteaze. Za regulatore komplementa, Leptospira koristi faktor H (FH; regulator alternativnog puta komplementa) i C4 vezni protein (C4BP; regulator klasičnih i lektinskih putova komplementa) za ubrzavanje raspadanja C3 konvertaza i također djeluju kao kofaktori za faktor I za cijepanje C3b i C4b [57,58]. Leptospiralni protein (LcpA), zajedno s vitronektinom (Vn; regulator terminalnog puta) veže C9 i inhibira njegovu polimerizaciju [59], čime potencijalno blokira stvaranje kompleksa koji aktivira membranu (MAC) [60]. Uz to, patogena leptospira veže nekoliko proteaza domaćina, kao što je aktivator plazminogena tipa urokinaze (uPA), koji inducira aktivni plazmin [61] (serinska proteaza) za probavu C3b, C4b i C5 na površini leptospire [62]. Štoviše, metaloproteaze i termolizin, endogena proteaza Leptospire, mogu cijepati i inaktivirati nekoliko proteina komplementa (C2, C3, C4 i faktor B) [60]. Kombinacija regulatora komplementa, iz domaćina i patogenih leptospira, olakšava kolonizaciju bakterija u ciljnim organima domaćina [63].

4.2. Leptospira i neutrofili

Tijekom infekcije, patogene vrste Leptospira izazivaju snažnu aktivaciju neutrofila i proupalni odgovor. Neutrofili su važni za kontrolu mikroorganizama, ali također doprinose oštećenju tkiva u domaćinu. Dokazano je da niske razine nakupljanja izvanstaničnih neutrofila zbog niske aktivnosti neutrofila u cirkulaciji povećavaju leptospiremiju, što ukazuje da intravaskularno stvaranje nakupljenih neutrofila može biti kritično u sprječavanju ranog širenja patogenih leptospira [64].

4.3. Leptospire i makrofagi

U početnoj fazi infekcije leptospirama, makrofagi igraju važnu ulogu u eliminaciji spiroheta. Ovaj efektorski mehanizam zajedno s učinkovitim odgovorom citokina povezan je s kontrolom fagocita i širenjem infekcije, iako Leptospira spp. pokazalo se da inducira apoptozu u makrofagima putem Fas/FasL-kaspaze-8/-3 puta i olakšava njihov preživljavanje i proliferaciju u domaćinu zbog otpuštanja mitohondrijskog faktora koji inducira apoptozu i endonukleazu kod zaraženih makrofagi [65]. Nedavno istraživanje provedeno je na mikro-transkriptomu makrofaga zaraženih Leptospirom kako bi se odredili epigenetski mehanizmi, kao što je posttranskripcijska regulacija pomoću RNA. Makrofagi zaraženi Leptospirom su pokazali da su mikroRNA (miRNA) regulirane infekcijom spirohetom, pokazujući da je ta regulacija vitalno važna u odgovoru ovih stanica imunološkog sustava kod infekcije Leptospirom [66]. U ljudskim makrofagima, aktivacija upale posredovana reaktivnim kisikovim vrstama i lizosomskim katepsinom B generiranim infekcijom Leptospira ima istaknute razine NLRP3 i IL-18, pogodujući proizvodnji IL-1 i dovodeći do visokog mogućnost fagocitoze i brzo modeliranje nekih citokina u korelaciji s rezistencijom na leptospirozu [67].

4.4. Humoralni odgovor na leptospiru

Specifični humoralni odgovor protiv Leptospira karakteriziran je proizvodnjom protutijela IgM i IgG trećeg dana od pojave simptoma. Osim toga, zabilježena je proizvodnja IgA od prvog dana do devetog mjeseca nakon infekcije; zapravo, porast IgM korišten je kao alternativna mjera u ranoj dijagnozi leptospiroze [68]. Učinak humoralnog odgovora kod ljudi s leptospirozom omogućuje postavljanje serološke dijagnoze nakon prirodne infekcije [69]. Najvažniji aspekt humoralnog odgovora kod infekcije Leptospirom može biti stvaranje zaštitnih protutijela. Cjepiva koja su trenutno dostupna za leptospirozu sastavljena su od kompletnih staničnih pripravaka i imaju ograničenja, kao što su niska učinkovitost, višestruke nuspojave, nisko stvaranje imunološke memorije i nedostatak unakrsne zaštite za razlike serovara. Stoga je razvoj novih cjepiva nužan za kontrolu bolesti, a trenutno se provode istraživanja za proizvodnju cjepiva iz genetske imunizacije [70]. OMP-ovi leptospire smatraju se antigenom, s boljom imunogenošću za B limfocite, koji uključuju strukturne epitope OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} i LipL41263-282 [71]. Ovi epitopi su obećavajući kandidati za razvoj univerzalnog cjepiva.

4.5. Adaptivni imunološki odgovor na leptospiru: T-stanice i citokini

Patogene vrste Leptospira induciraju imunološki odgovor posredovan limfocitima T i B, praćen ekspresijom citokina koji mogu biti povezani s gravitacijskim kartama. Aktivacija T stanica tijekom infekcije Leptospirom pokreće upalni odgovor, uglavnom kroz proizvodnju citokina. To je kritično u ranoj eliminaciji infekcije, ali nekontrolirana proizvodnja proupalnih citokina također može rezultirati prekomjernom proizvodnjom citokina praćenom stanjem imunoparalize, što može dovesti do sepse i zatajenja više organa. T limfociti proizvode IL-1, IL-6, IL-12, interferon (IFN)- i TNF-, koji djeluju kao kemoatraktanti za regrutiranje leukocita na mjestu infekcije. Zanimljivo, in ex vivo, naivne δ T stanice proliferirale su u kulturama mononuklearnih stanica periferne krvi (PBMC) stimuliranih s antigenima Leptospira uz proizvodnju IL-17 i IFN [72]. Štoviše, dok su miševi divljeg tipa zaraženi leptospirozom pokazali više razine puno citokina, uključujući IL-4, IL-10 i IL-13 u usporedbi s neinficiranim miševima, kronični mišji mišji izazvani Leptospirom nefritis (Daf1-/- miševi) pokazali su veću ekspresiju aktina glatkih mišića, IL-10, IL-13, ali nema razlike između IL-12 i IL{{21} } razine [73]. Kao takvi, Daf1 i IL-17 mogu igrati ključnu zaštitnu ulogu u progresiji CKD-a kao poveznica između mišjeg CKD-a izazvanog Leptospirom i fibroze bubrega [72,73]. Međutim, hipoteza odabranog citokinskog odgovora u progresiji bolesti još uvijek nije uvjerljiva u humanoj leptospirozi do sada. U bolesnika s teškom leptospirozom i zahvaćenošću pluća, dobivene su povišene razine IL-6, CXCL8 i IL-10 u usporedbi s bolesnicima s blagom leptospirozom [53]. Ove visoke koncentracije citokina u bolesnika s leptospirozom naglašavaju njihovu ključnu ulogu u razvoju teške leptospiroze.

U bolesnika s teškom infekcijom nalaze se CD4+ T limfociti s proupalnim profilom i proizvođači IL-2 i IFN-, dok CD4+ CD25 imaju visoke proizvođače IL-10 su gotovo odsutni. Čini se da regulacija imunološkog odgovora posredovanog T-limfocitima ne sprječava oštećenje tkiva uzrokovano upalnim odgovorom na Leptospiru. U CD4+ T limfocitima ljudi s teškom leptospirozom, proizvodnja TNF-a i drugih proupalnih citokina veća je nego u onih s blagim oblikom bolesti, što ukazuje da se ovi citokini mogu koristiti kao markeri ozbiljnosti u imunološkoj fazi infekcije [74]. Proizvodnja IL-10 povezana je s rizikom smrti kod ljudi s leptospirozom; međutim, studija provedena na izloženim i asimptomatskim ljudima povezala je proizvodnju ovog citokina s kontrolom upalnog odgovora i preživljavanjem [74]. Tijekom infekcije Leptospirom, upalni medijatori i djelovanje nekih leukocitnih stanica, kao što su T limfociti, brzo se reguliraju kod rezistentnih osoba, za razliku od onoga što se događa kod osoba s teškim oblicima leptospiroze [75].

Ukratko, imunološki odgovor na infekciju leptospirom nije u potpunosti shvaćen zbog kliničkog ponašanja bolesnika s leptospirozom, koji su u interakciji s različitim čimbenicima virulencije bakterijskog genoma, što leptospirama daje čvrstu patogenu sposobnost.

5. Kliničke manifestacije

Kliničke manifestacije leptospiroze su različite, u rasponu od blagih, nespecifičnih simptoma, kao što su simptomi slični gripi (groznica, mialgija i glavobolja), do teških simptoma zajedno s završnim stadijem ozljeda organa (npr. AKI, akutno zatajenje jetre i dijateza krvarenja, također poznata kao Weilov sindrom), akutna hemoptiza uzrokovana plućnim krvarenjem, akutna smetenost uzrokovana aseptičnim meningoencefalitisom i akutno zatajenje srca uzrokovano akutnim ili subakutnim miokarditisom [7]. Sukladno tome, tri pokazatelja sumnje na infekciju leptospirozom sastoje se od (i)akutna febrilna bolest, (ii) žutica, i (iii)akutna ozljeda bubrega[12]. Prediktori teškog oblika leptospiroze su jaka mialgija na početku, jaka sklonost krvarenju i izražena žutica. Zanimljivo, prisutnost bilo koje već postojećekronična bolest bubrega(mala veličina bubrega) ili povećani, zagušeni bubrezi s anurijom povezani su s najgorim ishodom [12]. Stoga, bolesnike s bubrežnom bolešću povezanom s leptospirozom treba odmah liječiti.

6. Dijagnoza

6.1. Klinička dijagnoza

Dijagnoza leptospiroze temelji se na povijesti izloženosti, čimbenicima rizika i kliničkim manifestacijama. Visoki indeks sumnje može zaobići kasnije oštećenje organa. Međutim, simptomi leptospiroze često se pogrešno zamjenjuju s drugim uzrocima akutnog febrilnog sindroma, poput infekcije denga groznicom, malarije, hepatitisa i aktivne autoimune bolesti. Nedostatak patognomonskih znakova leptospiroze znači da se dijagnoza okvirno temelji na procjeni vrućice i mialgije u bolesnika iz endemskog područja. Iz tog razloga laboratorijska dijagnostika leptospiroze je neophodna.

6.2. Laboratorijska dijagnostika

Leptospirozu je teško laboratorijski dijagnosticirati, osobito tijekom akutne faze. Može se izvesti izravnim identificiranjem spiroheta ili njihovih komponenti u tjelesnim tekućinama ili tkivima, izolacijom leptospira u kulturi ili otkrivanjem određenih protutijela kroz različite kliničke faze. Leptospirozu je teško razlikovati od bolesti kao što su malarija, denga groznica, rikecija, gripa, hepatitis i žuta groznica zbog nejasnog kliničkog izgleda. Kao rezultat toga, potrebni su laboratorijski testovi za potvrdu dijagnoze. Detekcija antitijela protiv leptospira, samih leptospira ili njihove deoksiribonukleinske kiseline temelj je za ove testove (DNA). Trenutna laboratorijska dijagnoza uključuje i izravnu identifikaciju (otkrivanje Leptospira spiroheta ili DNA u uzorcima ili izolaciju organizma iz uzoraka) i neizravnu detekciju (serološka dijagnoza ili serologija za identifikaciju Leptospiralne infekcije, koja se temelji na otkrivanju specifičnih protutijela protiv različitih Leptospiralni antigeni) (Tablica 1).

6.2.1. Izravni mikroskopski pregled, kultura i detekcija antigena

Leptospire su tanke, svijetle, aktivno pokretne spirale s karakterističnim brzim okretanjem (pokretljivost trzanja) pod konvencionalnim mikroskopom tamnog polja (DFM) i otprilike je 10 leptospira/mL potrebno za detekciju jedne stanice po polju. Uz tjedan dana duljeg trajanja zaraze, u prinosu DFM-a ima približno 10% umrlih (od 100 do 90%). Za povećanje osjetljivosti, nekoliko posebnih metoda bojenja; Warthin – Starry srebrno bojenje [76] i imunobojenje (imunohistokemija, imunofluorescencija, imunomagnetsko hvatanje antigena i imunoperoksidazno bojenje [77]) za koje su potrebna primarna antitijela specifična za serovar (u izolaciji ili kombinaciji).

Tablica 1. Laboratorijski testovi za dijagnozu leptospiroze.

LAMP, izotermno pojačanje posredovano petljom; PCR, lančana reakcija polimeraze; NGS, sekvenciranje sljedeće generacije; IHA, neizravna hemaglutinacija; ELISA, imunoenzimski test; IgM, imunoglobulin M; MAT, test makroskopske aglutinacije; MCAT, test aglutinacije mikrokapsula; DNA, deoksiribonukleinska kiselina; DFM, mikroskopija tamnog polja

Paralelno je moguća kultura Leptospira iz krvi, urina, cerebrospinalne tekućine i biopsijskog tkiva tijekom prvih nekoliko dana do 10 dana nakon pojave simptoma bolesti (stadij leptospiroze). Budući da sporo rastu (vrijeme udvostručenja 6-8 sati), zahtjevni su i skloni kontaminaciji, uzorci kulture moraju se čuvati najmanje 3-4 mjeseca prije nego što se odbace kao negativni) sa samo 23% osjetljivosti, ali je neophodno za test osjetljivosti na lijek [6]. Kao takav, EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) medij (kompleks oleinskog albumina) sastoji se od goveđeg serumskog albumina (frakcija V), Tweena 80, amonijevog klorida tiamina, monokalijevog fosfata, dinatrijevog fosfata i raznih hranjivih tvari [78]. obično se koristi, dok je za neke serovare potreban specijaliziraniji T80/40/LH medij (polisorbat 40, hidrolizat laktalbumina, superoksid dismutaza i zečji serum) [79]. Za primarnu izolaciju velikog i raznolikog raspona izbirljivih patogenih leptospira, čini se da je Hornsby–Alt–Nally (HAN) dobar medij [80].

Detekcija leptospiralnih antigena imunoperoksidazom, imunofluorescencijom ili imunomagnetskim sustavom za hvatanje antigena razvijena je za uzorke s niskim opterećenjem bakterijama ili se mikroskopija tamnog polja ne može koristiti, ali se ne provodi rutinski zbog ograničenja primarnih protutijela [77]. Nasuprot tome, prepoznavanje nukleinske kiseline s novim pojačanjem DNA; lančana reakcija polimeraze (PCR) (tj. ugniježđena PCR, kvantitativna PCR [qPCR]), izotermna amplifikacija posredovana petljom (LAMP) i sekvenciranje sljedeće generacije (NGS) dragocjeni su za ranu i točnu laboratorijsku dijagnozu, posebno s Izolacija leptospira korištenjem inokulacije biološkog medija i DNA hibridizacije (DNA sonda) [81,82]. Različite leptospiralne mete (kao što je 16S ribosomska RNA) ili DNA mogu se pojačati za dijagnozu [83], a PCR u stvarnom vremenu (RT-PCR) je osjetljiviji i specifičniji od standardne PCR [84]. Budući da se neki RT-PCR početnici mogu vezati na nespecifična mjesta, što dovodi do lažno pozitivnih rezultata, najnoviji multipleksni PCR testovi u stvarnom vremenu razvijeni su pomoću dva seta početnica [85]. Ugniježđeni PCR također pomaže u otkrivanju specifičnijih i osjetljivijih DNK mjesta s dodatnim skupovima početnica [86,87]. Međutim, trenutačni trendovi za dijagnosticiranje leptospiroze su korištenje i seroloških i molekularnih tehnika, kao što su PCR i ELISA (lakše od zlatnog standarda serološkog MAT-a), za zemlje s ograničenim resursima [88,89]. Osim toga, LAMP tehnika [90] za otkrivanje gena 16S rRNA (rrs) isplativa je, brza i visokoučinkovita za otkrivanje patogenih leptospira u urinu. Trenutačno je NGS najpreciznija metoda neovisna o kulturi na analizi jezgre genoma u tjelesnim tekućinama (krv i urin) [91], a budući smjer testova na leptospirozu bio bi pomak prema molekularnoj klasifikaciji leptospira, koja prevladava ograničenja izolacija kulture leptospira iz kliničkih uzoraka. Stoga je vrijednost PCR-a u kliničkoj dijagnozi leptospiroze osobito dobra i pojavljuje se nekoliko modernih tehnika

6.2.2. Detekcija anti-leptospira antitijela

Koristi se nekoliko seroloških dijagnoza; na primjer, testovi na antitijela specifični za rod (indirektna hemaglutinacija [IHA], imunoenzimski test [ELISA], Lepto Dri Dot [aglutinacija lateksa], aglutinacija mikrokapsula [MCAT]) i testovi na antitijela specifični za serovar (test mikroskopske aglutinacije [ MAT]) [92,93]. Kao takvi, MAT kriteriji za dijagnozu su (i) četverostruki porast titra u uparenim serumima (serokonverzija trenutne infekcije) ili (ii) jedan visoki titar (veći ili jednak 1:400 ili 1:800, veći u epidemiji područja) (seropozitivnost) (protutijela mogu postojati neko vrijeme nakon infekcije ili križno reagirati s drugim bolestima). Dodatno, MAT zahtijeva živi panel svih serovara Leptospira u regiji, s panelom lokalno standardiziranih serovara [93,94] prema Svjetskoj organizaciji za zdravlje životinja (19 antigena reprezentativnih za 15 serogrupa) [95]. Budući da se antitijela mogu otkriti 5-7 dana nakon infekcije, MAT test može biti negativan (titar < 1:50) tijekom prvih nekoliko dana infekcije. Dijagnoza leptospiroze može se postaviti uzorcima urina [96] uz korištenje i serologije i molekularne detekcije (16S rRNA), osobito u bolesnika s nedavnom infekcijom (MAT veći od ili jednak 1:800 ili ELISA IgM-pozitivan ili oboje) [97] .

S ograničenim resursima, rezultat kliničkog predviđanja [98] temeljen na relevantnoj kliničkoj povijesti i povezanim laboratorijskim testovima s bodovanjem u sedam aspekata je kako slijedi: hipotenzija (3), žutica (2), bol u mišićima (2), AKI (1,5) , nizak hemoglobin (3), hipokalemija s hiponatrijemijom (3) i neutrofilija (1) predložena (granična sumirana ocjena od 4 ima površinu ispod krivulje radne karakteristike prijemnika {{10}}).78 ( 95% CI 0.68–0.89) za dijagnozu leptospiroze [77]). Ovaj Thai-Lepto rezultat vjerojatnosti prijema mogao bi biti dijagnostički alat za ranu presumptivnu dijagnozu leptospiroze kod pacijenata s ozbiljnom kliničkom sumnjom na bolest.