Brzo istodobno određivanje šest učinkovitih komponenti u Cistanche Tubulosa u blizini infracrvene spektroskopije

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Xinhong Wang, Xiaoguang Wang i Yuhai Guo

Sažetak:

Kvantitativno određivanje višestrukih učinkovitih komponenti u određenoj biljci obično zahtijeva vrlo veliku količinu autentičnih prirodnih proizvoda. U ovoj studiji predložena je brza i nerazorna metoda za istodobno određivanje ehinakozida, verbaskozida, manitola, saharoze, glukoze i fruktoze uCistanche tubulosagotovo infracrvenom spektroskopijom (NIRS). Gotovo infracrvena difuzna reflektirajuća spektroskopija (DRS) i tekuća kromatografija visokih performansi (HPLC) provedeni su na 116 serija uzoraka Cistanche tubulosa. Podaci DRS-a obrađeni su metodama standardne normalne sorte (SNV) i multiplikativne korekcije raspršenja (MSC). Djelomična regresija najmanjih kvadrata (PLSR) korištena je za izradu kalibracijskih modela za komponente od interesa za Cistanche tubulosa. Svi modeli zatim su procijenjeni izračunavanjem srednje kvadratne pogreške korijena kalibracije (RMSEC), koeficijenta korelacije kalibracije (r). Utvrđeno je da su r vrijednosti svih šest kalibracijskih modela veće od 0,94, što sugerira da je svaki model pouzdan. Stoga se kvantitativni NIR modeli prijavljeni u ovoj studiji mogu kvalificirati za točnu kvantificiranje sadržaja šest ljekovitih komponenti uCistanche tubulosa.

Ključne riječi: Cistanche tubulosa; tekuća kromatografija visokih performansi; gotovo infracrvena spektroskopija; djelomični najmanji kvadrati

Uvod

Cistanche(Hoffmg. Et Link) je višegodišnji fenogamički rod obitelji biljaka Orobanchaceae. Većina vrsta roda Cistanche koristi se kao ljekovita biljka tisućljećima u Kini; imaju reputaciju superiornog tonika; i poznati su kao "Ginseng pustinja" [1,2].Cistanche tubulosaje obvezni parazit korijena višegodišnje biljke Tamarix Chinensis. Dokumentiran je u kineskoj farmakopeji kao autentični izvor Cistanches Herba (kineski naziv: Roucongrong) iz izdanja iz 2005. godine [3]. Moderna farmakološka istraživanja vrsta Cistanche pokrenuta su 1980-ih [4]. Farmakološka istraživanja pokazala su da ekstrakti cistančkih biljaka posjeduju širok spektar aktivnosti, kao što su liječenje nedostatka bubrega i senilni zatvor, napredovanje sposobnosti učenja i pamćenja, anti-Alzheimerova bolest, poboljšanje imuniteta, protiv starenja, protiv umora itd. [1,5–7]. U posljednja tri desetljeća sveobuhvatna i sustavna farmakološka istraživanja kombinirana su s fitokemijskim istraživanjima kako bi se osvijetlila materijalna osnova blagotvornih učinaka korijena cistanche biljaka. Ova istraživanja pokazuju da su feniletanoidni glikozidi (PhG) bili glavne učinkovite komponente u biljkama Cistanche koje su igrale ključne uloge za liječenje nedostatka bubrega, impotencije [8], protiv starenja [9] i anti-Alzheimerove bolesti [10]. Sadržaj dva phG (ehinakozid i verbascoside) bio je potreban u kineskoj farmakopeji. U međuvremenu, ugljikohidrati kao što su manitol, saharoza, glukoza i fruktoza u cistanche biljkama posjeduju laksativnu funkciju, a ugljikohidratne nakupine cistanche biljaka korištene su za liječenje zatvora [11].

Divlji resursiCistanche tubulosauglavnom se distribuiraju u području koje okružuje pustinju Taklamakan u južnoj autonomnoj regiji Xinjiang u Kini. Slično mnogim drugim vrstama koje se koriste kao tradicionalni kineski lijekovi (TCM), C. tubulosa je od velike ekonomske vrijednosti i gotovo je izumrla u svom divljem staništu zbog prekomjernog prikupljanja. Uzgoj C. tubulosa započeo je 1990-ih u Kini kako bi se osigurala opskrba sirovinama za Cistanches Herba, kao i zaštitili divlji biljni resursi. Od 2017. godine gotovo 13 tisuća ha kultiviranih C. tubulosa postoji u prefekturi Hotan u Xinjiangu [12,13]. Potreban je napredak u tehnologiji sadnje koji će proširiti uzgoj, kao i poboljšati kvalitetuCistanche tubulosa.

Primarna svrha uzgojaCistanche tubulosaje proizvesti Cistanches Herba, bogat u tim učinkovitim komponentama. Međutim, na sadržaj učinkovitih komponenti u Cistanches Herba, kao što su PHG i oligosaharidi, mogu značajno utjecati mnogi čimbenici tijekom proizvodnje [12,13]. Trebalo bi istražiti sustav detekcije kvalitete C. tubulosa u stvarnom vremenu. Stoga je potrebno razviti metodu visoke propusnosti kako bi se u potpunosti ispunio zahtjev za analizom velikog broja uzoraka u kratkom vremenskom razdoblju. Tradicionalno, određivanje tih primarnih učinkovitih komponenti, kao što su PHG i ugljikohidrati, u C. tubulosa obično je postignuto pomoću tekuće kromatografije visokih performansi (HPLC) [14,15]. Iako je točan i pouzdan, dugotrajan je i naporan za prikupljanje i obradu podataka. Osim toga, potrebno je i mnogo vremena i truda za pripremu uzorka koja obično uključuje pulverizaciju, ekstrakciju i filtriranje HPLC testova. Stoga je za dobivanje relativno velike količine podataka potrebno jasno načelo i alat koji se lako koristi. Srećom, gotovo infracrvena spektroskopija (NIRS) uvelike se koristi za procjenu poljoprivrednih proizvoda [16], hrane [17], medicinskih uzoraka [18] i farmaceutskih proizvoda [19] jer je brza i nerazorna. Stoga bi NIRS mogao točno odgovarati zahtjevima za učinkovita mjerenja TCM-ova i ne iznenađuje da je NIRS primijenjen za kvalitativnu identifikaciju [20,21] i kvantifikaciju spojeva [22] u TCM-ovima.

U ovoj studiji HPLC je prvo odredio sadržaj šest učinkovitih komponenti, uključujući ehinakozid, verbascozid, manitol, saharozu, glukozu i fruktozu u 116 serija uzoraka C. tubulosa koji su prikupljeni iz prefekture Hotan u Xinjiangu između 2013.-2015. Nakon toga utvrđeni su kalibracijski modeli tih šest komponenti metodom regresije djelomičnih najmanjih kvadrata (PLSR). Ti su modeli zatim potvrđeni koeficijentom korelacije i pogreškama predviđanja u kalibracijskim skupovima. Rezultati su pokazali da se razvijena metoda može primijeniti kao pouzdana metoda za kvantitativnu analizu C. tubulosa.

Rezultat

HPLC analiza

Sadržaj ehinakozida i verbaskozida određen je dobro definiranom HPLC-UV metodom u literaturi [3,23], a četiri ugljikohidrata (manitol, saharoza, glukoza i fruktoza) određena su dobro definiranom HPLC-ELSD metodom u literaturi [24] za svih 116 uzoraka. Metode pripreme i određivanja uzoraka opisane su u odjeljcima 3.1. i 3.3. Slika 1 prikazuje karakteristične kromatograme mješovitih standarda. Može se vidjeti da je svih šest učinkovitih komponenti bilo osnovno odvojeno i stoga se može kvantificirati. HpLC metoda potvrđena je prije ispitivanja uzorka. Glavni rezultati HPLC metode navedeni su u tablici 1. U rezultatima su prikazani povoljan linearni odnos (r = 0,9998) i oporavak (98,5%) metode određivanja ehinakoida, što je isti rezultat kao i svih pet komponenti. Stoga se sadržaj šest učinkovitih komponenti može točno odrediti. Svi određeni rasponi sadržaja sažeti su u tablici 1.

NIRS analiza

Slika 2 prikazuje NIR spektre (4000–10.000 cm−1 ) uzoraka C. tubulosa. Značajni apsorpcijski vrhovi pojavili su se od 4000 cm−1 do 7500 cm−1 u svim uzorcima, dok su se nježne fluktuacije pojavile od 7500 cm−1 do 10.000 cm−1. Do osnovnog pomaka NIR spektra došlo je jer su na uzorak lako utjecali čimbenici kao što su veličina čestica i boja (slika 2.A). Matematičke predobrade spektra korištene su za smanjenje utjecaja nepotrebnih informacija u određenoj mjeri. Matematičke predobrade uključivale su prvo izvođenje (1. derivacija), drugo izvođenje (2. derivacija), standardnu normalnu sortu (SNV) i multiplikativnu korekciju raspršenja (MSC). Na slici 2.B prikazana je druga izvedba NIR spektra C. tubulosa, a očito su uočene značajne varijacije koje su se dogodile iz tri regije, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 i 7000–7500 cm−1.

Uspostava kvantitativnih kalibracijskih modela

Djelomična regresija najmanjih kvadrata (PLSR) klasična je metoda modeliranja i široko se primjenjuje u kvantitativnim modelima zbog visoke kvalitete rezultata. Prednosti PLSR-a uključuju njegovu dobru sposobnost predviđanja i relativnu jednostavnost. PLSR se također široko primjenjuje u uspostavi modela kvantitativne kalibracije TCM-ova [25]. Na temelju prethodno obrađenih NIR spektra i NIR modela kvantitativne analize za šest učinkovitih komponenti u C. tubulosi uspostavljen je pomoću PLSR metode s hplc analizom podataka kao pravih vrijednosti. 116 uzoraka nasumično je podijeljeno u skupove kalibracije i validacije s omjerom 3:1. Najprikladniji uvjeti za kalibraciju odabrani su niskim RMSEC-om i visokim koeficijentom korelacije.

Odabir valnog pojasa za kalibracijske modele

Odabir prikladnog valnog pojasa bio je važan korak za izgradnju kalibracijskih modela. U ovoj studiji uspoređeni su NIR intervalni spektri od 4000–7500 cm-1 (preporučuje softver TQ analitičara) i 4000–10.000 cm-1. Primijećeno je da taj raspon nije prikladan za kalibraciju u razmaku između 4000 cm-1 i 7500 cm-1 iz tablice 2. Stoga su u trenutnoj studiji odabrani spektralni intervali za šest kemijskih sastojaka iz intervala od 4000 do 10.000 cm-1 usporedbom performansi RMSEC-a i koeficijenta korelacije.

Odabir optimalnog broja čimbenika za kalibracijske modele

PLSR objašnjava maksimalnu količinu varijabilnosti podataka smanjenjem dimenzionalnosti podataka spektra izračunom čimbenika. Problem "nedovoljne opremljenosti" pojavio se zbog nedovoljnih informacija koje su proizašle iz ograničenog broja čimbenika; međutim, odabir čimbenika većih od optimalnih vrijednosti uvedenih u modelu donijet će problem "prekomjerne opremljenosti". Ili će "nedovoljno opremljenost" ili "prekomjerna opremljenost" smanjiti prediktivnu snagu utvrđenih modela [22]. Na slici 3. prikazan je odnos između RMSECV-a i čimbenika za svih šest spojeva. Stoga smo odabrali one čimbenike koji odgovaraju najnižim vrijednostima RMSECV-a. Optimalan odabir čimbenika za kalibracijske modele naveden je u tablici 3.

Izbor spektralne predobrade za kalibracijske modele

Još jedan najkritičniji utjecajni čimbenik za kalibracijske modele je spektralna predobrada koja je usmjerena na smanjenje utjecaja raspršenja i osnovnog pomaka, poboljšanje omjera signala i buke i uklanjanje nepravilnih varijacija. Za uklanjanje utjecaja raspršenja zračenja korištene su multiplikativne metode korekcije raspršenja (MSC) i standardnog normalnog varijata (SNV). Kako bi se riješili učinci osnovnog pomaka, uspoređeni su 1. i 2. izvedeni spektri te je odabrana 2. derivacija [26]. Za poželjan učinak izgladili smo spektre algoritmom filtra Savitzky-Golay (SG) prije izvođenja kako bismo spriječili povećanje buke. Tablica 3 prikazuje informacije o spektralnoj predobradi i njezinim rezultatima za kalibracijske modele.

Evaluacija utvrđenih modela

Dobar model kalibracije NIRS-a trebao bi imati niske vrijednosti RMSEC-a i RMSEP-a, kao i visok koeficijent korelacije (r) i male razlike između RMSEC-a i RMSEP-a [27–29]. Kalibracijski modeli šest odabranih spojeva utvrđeni su u skladu s gore navedenim postupcima (tablica 3.). Vrijednosti RMSEC i r za kalibracijski skup ehinakozida bile su 27,6 odnosno 0,9808. Parametri performansi drugih modela kemijskih spojeva navedeni su u tablici 3., iz koje možemo zaključiti da utvrđeni modeli proizlaze zadovoljavajuće rezultate predviđanja i mogu se koristiti za brzu kvantitativnu analizu C. tubulosa. Raspršene parcele šest kemijskih spojeva prikazane su na slici 4 kako bi kalibracijski modeli bili opisniji i vizualno promatrani. Kao što je prikazano na slici 4, dogodile su se manje razlike između prediktivnih i izmjerenih vrijednosti, jer je većina točkica raspoređena oko regresivne krivulje jednadžbom kao y = x. Stoga su na slici 4. uočene izvrsne prediktivne izvedbe.

Materijali i metode

Priprema uzorka

Stotinu šesnaest uzoraka C. tubulosa prikupljeno je iz prefekture Hotan u autonomnoj regiji Xinjiang od 2013. do 2015. godine. Svi uzorci su kultivirani, ali su prikupljeni u različitim fazama rasta. Svježa težina uzoraka kretala se od 20 g do 1000 g. Nakon sušenja sunca osušeni uzorci su zgnječeni i prosijani kroz sito od 60 mreža [3,23].

NIR spektroskopsko prikupljanje podataka

NIR spektri uzoraka prikupljeni su u intervalu od 8 cm-1 u spektralnoj regiji od 4000–10.000 cm-1 s Antaris MXFT-NIR sustavom (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) opremljenim ručnim adapterom za refleksiju optičkih vlakana. Svaki spektar dobiven je u prosjeku 64 skeniranja. Svim uzorcima dopušteno je da se uravnoteže na sobnu temperaturu (25 。 C) prije NIR skeniranja spektra kako bi se osiguralo da su uzorci analizirani na istoj temperaturi. Vlažnost u laboratoriju zadržana je na razini okoline.

Prikupljanje podataka HPLC-a

Priprema ekstrakcije

Jedan gram C. tubulosa praha ekstrahiran je s 50 mL od 50% metanola u stožastoj tikvici s ultra-ultrazvukom (500 W, 40 kHz) tijekom 30 minuta. Ekstrakt je pohranjen na 4 ◦C. Supernatant ekstrakta filtriran je kako bi se dobio uzorak za HPLC analizu [3,23].

Istodobno određivanje Echinacosidea i Verbascosidea s HPLC-UV-om

Tekuća kromatografska analiza provedena je na Shimadzu UHPLC sustavu (Shimadzu, Kyoto, Japan) koji se sastoji od dvije jedinice za isporuku otapala LC-20ADXR, pumpe LC-20AD, uzorka SIL-20ACXRauto, pećnice na stupu CTO-20AC, detektora SPD-M20A DAD, deplinasera DGU-20A3R i regulatora ICBM-20A.

Stupac Grace Prevail Ugljikohidrati ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) koji se koristio za kromatografske separacije održavan je na 35 ◦C. Mobilna faza sastojala se od acetonitrila (A) i 0,1% vodene mravlje kiseline (B) i isporučena je slijedeći program gradijenta na sljedeći način: 0–7 min, linearni gradijent od 10–20% A; 7–15 min, 20% A; i 15–20 min, linearni gradijent od 20–10% A. Druga brzina mobilne faze bila je 0,4 mL/min. UV praćenje provedeno je pri brzini od 330 nm.

Istodobno određivanje manitola, saharoze, glukoze i fruktoze s HPLC-ELSD-om

HPLC je izveden na LC sustavu serije Agilent 1100 (Palo Alto, CA, SAD) koji se sastoji od aG1322A degassera, kvartarne pumpe G1311A, autosamplera G1311A, regulatora temperature stupca G1316A i detektora G1315B DAD.

Sigma Prevladavaju ugljikohidrati ES stupac (4,6 × 250 mm, 5 μm) korišten je za kromatografske separacije i održavan na temperaturi stupca od 25 ◦C. Mobilna faza bila je sastavljena od acetonitrila i vode (77:23, v/v) i izokratskog saveznika isporučenog po drugoj stopi od 0,7 mL/min. Izlazna voda praćena je pomoću detektora raspršenja isparavanja svjetlosti (ELSD) sa zadanim parametrima [23,24].

Obrada podataka

TQ Analitičar (verzija 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, SAD) korišten je za izvođenje podjele kalibracijskih i validacijskih skupova, matematičke predobrade spektra, uspostavljanja modela kalibracije i drugih izračuna. Podrijetlo (verzija 9.1) korišteno je za izradu brojki.

Zaključci

Priznanja: Taj je rad podržan nacionalnim projektom planiranja znanosti i tehnologije Kine(2015BAD29B00-04).

Doprinosi autora: Xinhong Wang osmislio je i osmislio eksperimente. Xinhong Wang i Xiaoguang Wangper informirali su eksperimente. Xinhong Wang i Yuhai Guo napisali su rad.

Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Jiang, Y.; Tu, P.F. Analiza kemijskih sastojaka u cistanche vrstama. J. Kromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

2. Xu, R.; Chen, J.; Chen, S.-L.; Liu, T.-N.; Zhu, W.-C.; Xu, J. Cistanche deserticola Ma uzgaja se kao novi usjev u Kini. Genet. Resour. Crop Evol. 2008, 56, 137–142. [CrossRef]

3. Uređivanje kineskog odbora za farmakopeju. Kineska farmakopeja, 2005.; Kemijski industrijski tisak: Peking, Kina, 2005.; Svezak 1, str.

4. Kobayashi, H.; Komatsu, J. Sastavni dijelovi cistanchE herbe (1). Jakugaku Zasshi 1983., 103., 508.-511. [CrossRef] [PubMed]

5. Pjesma, Z.H.; Lei, L.; Tu, P.F. Napredak u istraživanju farmakološke aktivnosti u biljkama cistanche huffing. Et link. Brada. Tradit. Trava. Lijekovi 2003, 34, 473–476.

6. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Antioksidativni učinci feniletanoida iz Cistanche deserticola. Bik biol. 1996, 19, 1580–1585. [CrossRef] [PubMed]

7. Xuan, GD; Liu, C.Q. Istraživanje učinka feniletanoidnih glikozida (PEG) cistanche deserticola na anti-starenje kod starih miševa izazvanih D-galaktozom. J. Chin. Med. Mater. 2008, 31, 1385–1388.

8. Sato, T.; Kozima, S.; Kobayashi, K.; Kobayashi, H. Farmakološke studije na Cistanchis Herbi. I. Učinci sastojaka Cistanchis Herbe na seks i ponašanje u učenju kod kronično stresnih miševa. Yakugaku Zasshi 1986,105, 1131–1144. [CrossRef]

9. Shen, C.Y.; Jiang, J.G.; Yang, L.; Wang, D.W.; Zhu, W. Anti-age aktivni sastojci iz bilja i nutraceutika koji se koriste u tradicionalnoj kineskoj medicini: farmakološki mehanizmi i implikacije za otkrivanje lijekova. Br. J. Pharmacol. 2016, 11, 1395–1425. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, N.; Wang, J.; Mama, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Neuroprotektivni učinci cistanches herba terapije na pacijente s umjerenom Alzheimerovom bolešću. Evid. Dopuna na temelju. Altern. med. 2015, 2015. [CrossRef] [PubMed]

11. Gao, J.Y.; Jiang, Y.; Dai, F.; Han, Z.L.; Liu, H.Y.; Bao, Z.; Zhang, T.M.; Tu, P.F. Studija o laksativnim sastojcima u Cistanche deserticola Y.C. Ma. Mod. Brada. Med. 2015, 17, 307–310.

12. Tu, P.F.; Chen, Q.L.; Jiang, Y.; Guo, Y.H.; Yang, T.X.; Wang, X.Y.; Aierkan, M.; Li, X.B.; Du, Y.; Nan, Z.D.; et al. Tehnike uzgoja Cistanche tubulosa i domaćin Tamarix spp. Brada. Med. 2015, 17, 349–358.

13. Tu, P.F.; Jiang, Y.; Guo, Y.H.; Tian, Y.Z.; Li, X.B.; Wang, X.Y.; Wei, J.; Chen, Q.L.; Aierkan, M. Razvija ekološku industriju cistanches herba za promicanje ekološke civilizacije zapadne pustinjske regije. Mod. Brada. Med. 2015, 17, 297–301.

14. Lu, D.Y.; Zhang, J.Y.; Yang, Z.Y.; Liu, H.M.; Li, S.; Wu, B.J.; Ma, Z.G. Kvantitativna analiza cistanches herba pomoću visokoučinkovite tekuće kromatografije zajedno s detekcijom niza dioda i masenom spektrometrijom visoke rezolucije u kombinaciji s kemometrijskim metodama. 2013., 36., 1945.-1952. [CrossRef] [PubMed] Molekule 2017, 22, 843 9 od 9

15. Jiang, Y.; Li, S.P.; Wang, Y.T.; Chen, X.J.; Tu, P.F. Diferencijacija herba cistanchesa otiskom prsta s visokoučinkovitom tekućom kromatografijom-diodnom spektrometrijom detekcije niza-mase. J. Kromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]

    ---