Iridoidni i aciklički monoterpenski glikozidi, kankanozidi L, M, N, O i P iz Cistanche Tubulosa

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) je višegodišnja parazitska biljka koja raste na korijenima vrste Salvadora ili Calotropis, rasprostranjena u sjevernoj Africi, Arabiji i azijskim zemljama.1) Stabljike ove biljke (kanka-nikujuyou na japanskom) tradicionalno su koristi se za liječenje impotencije, steriliteta, lumbaga i tjelesne slabosti, kao i sredstvo za pospješivanje cirkulacije krvi.1,2) Tijekom naših studija o bioaktivnim sastojcima iz stabljika Cistanche tubulosa,3-6) prethodno smo izvijestili dvadeset i četiri feniletanoidna aminoglikozida uključujući kankanozide H1, H2, I, J1, J2, K1 i K2, i dva acilirana oligosećera iz svježih stabljika Cistanchetubulosa.5,6) Nadalje, glavnifeniletanoidni glikozidi,ehinakozid, akteozid,i izoakteozid, utvrđeno je da inhibiraju povećanje razine serumske aspartat aminotransferaze (sAST) i alanin aminotransferaze (sALT) u ozlijeđenoj jetri miševa izazvano D-galaktozaminom (D-GalN)/lipopolisaharidom u dozama od 25-100 mg/kg per os ( po). Strukturni zahtjevi feniletanoidnih glikozida za hepatoprotektivno djelovanje također su razjašnjeni.5) U ovoj kontinuiranoj studiji o sastojcima u svježim stabljikama Cistanchetubulosa, dodatno smo izolirali jedanaest iridoidnih glikozida uključujući kankanozide L (1), M (2), i N (3), sedam acikličkih monoterpenskih glikozida uključujući kankanozide O (4) i P(5), tri fenilpropanoida i četiri lignana. Ovaj se rad bavi izolacijom i razjašnjavanjem strukture pet novih spojeva (1-5).

Svježe stabljike C. tubulosa (uzgajane u Urumuqiju, pokrajina Xin jiang, Kina) ekstrahirane su metanolom pod refluksom da bi se dobio metanolni ekstrakt (8,36 posto iz svježih stabljika). Iz metanolnog ekstrakta frakcije eluirane s H2O i MeOH (5,63 posto odnosno 2,73 posto) dobivene su kromatografijom na stupcu Diaion HP-20 (H2O→MeOH) kao što je prethodno opisano.5) Frakcija eluirana s MeOH je podvrgnuti SiO2 i ODS kromatografiji na stupcu i konačno HPLC-u da bi se dobili kankanozidi L (1, 0.0026 posto), M (2, 0.{{ 27}}001 posto ), N (3, 0.00{{60}}7 posto ) , O (4, 0.0{{90}}2{{105}} posto ) i P (5, {{118} }.0002 posto ), 6-deoksikatalpol3,7) (6, 0.197 posto ), barciozid3,7) (7, 0.0583 posto ), glurozid3,7) (8, 0.0443 posto ), kankanoizid A3) (9, 22,3 mg, 0,0010 posto ), musaenozidna kiselina 3,7) (10, 0,0056 posto ), 8- epiloganska kiselina 3,8) (11, 0,0023 posto ), 8-epideoksiloganska kiselina 3,7) (12, 0,0004 posto ), genipozidna kiselina 3,7) (13, 0,0040 postotak), kankanozid E3) (14, 0,0026 posto), (2E,6Z)-8-b D-glukopiranoziloksi-2,6-dimetil-2,6-oktadienska kiselina3,9) (15, 31,0 mg, 0,0014 posto), (2E,6E){{95 }},7-dimetil-8-hidroksioktadien-1-il-ObD-glu kopiranozid10) (16, 0,0082 posto), 8-hidroksigeraniol 8-Ob-D-glukopiranozid11 ) (17, 0,0044 posto), betulalbusid A12) (18, 0,0004 posto), coniferin13) (19, 0,0002 posto), syringin13) (20, 0,0015 posto), sinapin aldehid 4-ObD-glukopiranozid14) (21, 0,0001 posto), ()-pinorezinol ObD-glukopiranozid4,8,15) (22, 0,0010 posto), eucommin A16) (23, 0,0002 posto), izoeukommin A17) (24, 0,0010 posto), i ()-syringaresinol ObD- glukopira nosid4,8,18) (25, 0,0044 posto).

Cistanche tubulosapoboljšati seksualnu funkciju

Strukture kankanozida L (1), M (2) i N (3)

Kankanozid L (1) je dobiven kao bijeli prah s negativnom optičkom rotacijom ([a]D 26 45,7 u MeOH). Njegov IR spektar pokazao je jaku apsorpcijsku traku na 3433 i 1{{20}}80 cm 1 što ukazuje na glikozidnu skupinu. Bombardiranje brzim atomima (FAB)-MS od 1 izvođenja u modovima s pozitivnim i negativnim ionima pokazalo je kvazimolekularne vršne vrijednosti iona na m/z 371 [M Na], odnosno 347 [MH], a molekulska formula određena je kao C15H24O9 FAB-MS mjerenjem visoke rezolucije. Kisela hidroliza 1 s 1,0 M solnom kiselinom (HCl) oslobodila je D-glukozu, koja je identificirana HPLC analizom pomoću detektora optičke rotacije.3-6) 1H- i 13C-NMR spektri 1 (CD3OD, tablice 1, 2), koji su dodijeljeni različitim NMR eksperimentima,19) pokazali su signale koji se mogu označiti za četiri metilena [d 1,43 (1H, br dd, J oko 5, 13 Hz, 4a-H), 1,73 (1H, br dd, J ca. 12, 14 Hz, 6a-H), 1,85 (1H, m, 4b-H), 1,93 (1H, br dd, J= ca. 8, 14 Hz, 6b-H), 3,50 ( 1H, ddd, J 2,4, 12,5, 13,0 Hz, 3a-H), 3,83 (1H, br dd, J=ca. 5, 13 Hz, 3b-H), 3,78, 4,12 (1H svaki, oba d, J 13,1 Hz, 10-H2)], dva metina [d 2,15 (1H, dd, J 7,2, 8,9 Hz, 9-H) i 2,23 (1H, m, 5- H)], i acetalnu skupinu [d 4,81 (1H, d, J 8,9 Hz, 1-H)] zajedno s b-glukopiranozilnim ostatkom [d 4,70 (d, J 7,9 Hz, 1 -) H)]. Kao što je prikazano na slici 1, eksperiment 1 H–1H korelacijske spektroskopije (1 H–1 H COSY) na 1 pokazao je prisutnost djelomičnih struktura napisanih podebljanim crtama. U eksperimentu heteronuklearne korelacije višestrukih veza (HMBC) na 1, uočene su korelacije dugog dometa između sljedećih protona i ugljika (1-H i 3-C, 8-C; {{ 124}}H i 1-C; 7-H i 8-C, 10-C; 9-H i 8-C; {{131 }}H2 i 7-C, 8-C; 1 -H i 1-C) kao što je prikazano na slici 1. Zatim je relativna stereostruktura 1 karakterizirana fazno osjetljivom nuklearnom Eksperiment Overhauserove pojačane spektroskopije (fazno osjetljiv NOESY), koji je pokazao korelacije NOE između sljedećih parova protona (1-H i 3a H; 3a-H i 4a-H; 3b-H i 4b-H; 4b-H i 5-H, 9-H; 5- H i 6b-H, 9-H; 6a-H i 7-H; 7-H i 10-H2), kao što je prikazano na slici 1. 1H- i 13C-NMR spektri 1 su se preklapali sa onima glavnog iridoidnog sastojka 6-deoksikatalpola (6), osim signala zbog na zasićenu d-laktolnu skupinu. Konačno, hidrogenacijom 6 dobiven je 1, tako da je stereostruktura kankanozida L razjašnjena kao 3,4- dihidro-6-deoksikatalpol (1).

Kankanozid M (2) je dobiven kao bijeli prah s negativnom optičkom rotacijom ([a]D 26 18,7 u MeOH). IR spektar 2 pokazao je apsorpcijske trake na 3433, 1736, 1655 i 1076 cm 1 koje se mogu pripisati hidroksilnim, d-laktonskim, olefinskim i eterskim dijelovima. FAB-MS spektar pozitivnih iona 2 pokazao je kvazimolekularni ionski pik pri m/z 353 [M Na], a molekularna formula je određena kao C15H22O8 FAB-MS mjerenjem pozitivnih iona visoke rezolucije. Kiselom hidrolizom 2 s 1,0 M HCl oslobođena je D-glukoza. 1H- i 13C NMR spektri 2 (CD3OD, tablice 1, 2) pokazali su signale koji se mogu pripisati četirima metilenima [d 1,66, 2,11 (1H svaki, oba m, 4-H2), 2,15, 2,75 (1H svaki , oba m, 6-H2), 4,29 (1H, ddd, J 2,8, 8,4, 14,3 Hz, 3b-H), 4,32, 4,51 (1H svaki, oba d, J 13,1 Hz, 10- H2), 4,35 (1H, ddd, J 3,1, 6,7, 14,3 Hz, 3a-H)], dva metina [d 2,97 (1H, m, 5-H), 3,82 (1H, br s, {{ 84}}H)], olefin [d 5,94 (1H, m, 7-H)] i zasićena laktonska skupina (d C 174,9) zajedno s bD-glukopiranozilnim dijelom [d 4,32 (1H, d J 7,9 Hz, 1 -H)]. Kao što je prikazano na slici 1, 1 H–1H COSY eksperiment na 2 ukazao je na prisutnost parcijalnih struktura napisanih podebljanim crtama, a u HMBC eksperimentu, uočene su korelacije dugog dometa između sljedećih parova protona i ugljika ({{105 }}H i 1-C; 7-H i 9-C; 9-H i 1-C, 8-C; {{112} }H2 i 7-C, 8-C, 9-C; 1-H i 10-C). Relativna stereostruktura 2 karakterizirana je fazno osjetljivim NOESY eksperimentom, koji je pokazao NOE korelacije između sljedećih parova protona (3a-H i 4a-H; 3b-H i 4b-H; 4b-H i 5- H; 5-H i 6b-H, 9-H) kao što je prikazano na slici 1. Dakle, stereostruktura 2 je razjašnjena kao što je prikazano.

Kankanozid N (3) izoliran je kao bijeli prah s negativnom optičkom rotacijom ([a]D 25 24,6 u MeOH). U FAB-MS s pozitivnim ionima od 3, kvazimolekularni ionski pik opažen je pri m/z 371 [M Na]. Molekulska formula C16H28O8 određena je FAB-MS mjerenjem visoke rezolucije. Kisela hidroliza 3 s 1.0 M HCl oslobađa D-glukozu. Podaci 1H- i 13C-NMR (CD3OD, tablice 1, 2) pokazali su signale koji se mogu pripisati metilu [d 1.07 (3H, d, J 7,2 Hz, 10-H3)] , četiri metilena {d 1,37, 1,87 (1H svaki, oba m, 7-H2), 1,65, 1,81 (1H svaki, oba m, 6-H2), [3,65 (1H, dd, J 9,1) , 9,8 Hz), 3,90 (1H, dd, J 5,9, 9,8 Hz), 11-H2], i [3,70 (1H, dd, J 3,3, 12,0 Hz), 3,88 (1H, m), {{ 71}}H2]}, četiri metina [d 1,69 (1H, m, 4-H), 1,75 (1H, m, 9-H), 2,06 (1H, m, 8- H), 2,16 (1H, m, 5-H)], i poluacetalna skupina [d 4,67 (1H, d, J 7,4 Hz, 1-H)] zajedno s bD-glukopiranozilnim dijelom [ d 4,26 (IH, d, J 7,9 Hz, 1 -H)]. Iridoidna struktura 3 razjašnjena je 1 H–1 H COSY i HMBC eksperimentima, a relativna stereostruktura karakterizirana je fazno osjetljivim NOESY eksperimentom kao što je prikazano na slici 1. Posljedično, sterostruktura 3 je razjašnjena kao što je prikazano.

Cistanche tubulosa

Strukture kankanozida O (4) i P (5)

Kankanozidi O (4) i P (5), C16H26O8, također su dobiveni kao bijeli prahovi s negativnim optičkim rotacijama (4: [a]D 23 26,1; 5: [a]D 21 32,7 oba u MeOH). IR spektri 4 i 5 pokazali su apsorpcijske trake na 3433, 1696, 1647 i 1076 cm 1 za 4, i na 3434, 1701, 1647 i 1{{96} }76 cm 1 za 5, koje se mogu pripisati glikozidnim, karboksilnim i olefinskim funkcijama. Njihovi UV spektri pokazali su zajednički maksimum apsorpcije na 217 nm što ukazuje na prisutnost ostatka b-nezasićene karboksilne kiseline u obojici. Kiselom hidrolizom 4 i 5 oslobođena je D-glukoza, dok su enzimskom hidrolizom s b glukozidazom 4 i 5 dali (2E,6E)-8-hidroksi-2,6-dimetil{{39 }},{{40}}oktadecenska kiselina20) (4a) i (2E,6E)-8-hidroksi-3,7- dimetil{{ 48}},6-oktadecenska kiselina21) (5a). Podaci 1H- i 13C-NMR 4 (CD3OD, tablice 2, 3) pokazuju signale koji se mogu pripisati dvama metilima [d 1,71 (3H, br s, 10-H3), 1,81 (3H, d, J 1,0 Hz , 9-H3)], tri metilena {d 2,19 (2H, br t, J ca. 7 Hz, 5-H2), 2,36 (2H, m, 4-H2), [ 4,24 (1H, dd, J 7,6, 12,0 Hz), 4,33 (1H, dd, J 6,2, 12,0 Hz), 8-H2]}, i dva trisupstituirana olefina [d 5,41 (1H, ddd, J 1,2, 6,2, 7,6 Hz, 7- H), 6,75 (1H, tq, J 7,2, 1,0 Hz, 3-H)] zajedno s bD glukopiranozilnim dijelom [d 4,34 (d, J 7,8 Hz, 1 -H)]. Usporedbom signala ugljika u 13C-NMR spektru 4 s onima od 4a, uočen je glikozilacijski pomak na položaju 8- (d C 4: 65,5; 4a: 59,4). Položaj glukozidne veze također je potvrđen HMBC eksperimentima kao što je prikazano na slici 2. Posljedično, stereostruktura 4 je pojašnjena kao (2E,6E)-8-bD-glukopiranoziloksi-2,{{ 143}}dimetil-2,6-oktadecenska kiselina. S druge strane, 1H- i 13C-NMR podaci za 5 (CD3OD, tablice 2, 3) ukazuju na prisutnost (2E,6E)-8-hidroksi-3,{{158} }dimetil-2,6-oktadecenska kiselina [d 1,70 (3H, br s, 10-H3), 2,14 (3H, br s, 9-H3), 2,24 ( 2H, m, 4-H2), 2,27 (2H, m, 5-H2), 4,05, 4,20 (1H svaki, oba br d, J oko 12 Hz, 8-H2) , 5,47 (1H, tq, J 7,1, 0,9 Hz, 6-H), 5,67 (1H, br s, 1-H)] zajedno s bD-glukopiranozilnim dijelom [d 4,23 (d, J 7,7 Hz, 1 -H)]. Povezanost bD-glukopiranozilnog ostatka u 5 razjašnjena je na temelju HMBC eksperimenata kao što je prikazano na slici 2. Nadalje, uočen je tipičan glikozilacijski pomak za signale na 8-položaju (d C 5: 75,6; 5a: 68.8). Na temelju gore navedenih dokaza, utvrđeno je da je stereostruktura 5 (2E,6E)-8-bD-glukopiranosiloksi-3,7-dimetil-2,{ {230}}okta dienska kiselina.

Učinci sastojaka na citotoksičnost izazvanu faktorom nekroze tumora-a (TNF-a) u stanicama L929

Poznato je da TNF-a posreduje u raznim ozljedama organa kroz njegovu indukciju stanične apoptoze. U slučaju jetre, biološki učinci TNF-a bili su uključeni u oštećenje jetre izazvano jetrenim toksinima, ishemijom/reperfuzijom, virusnim hepatitisom i alkoholom.22-24) Stoga se TNF-a smatra važnim cilj otkriti protuupalna i hepatoprotektivna sredstva. Na temelju gore navedenog koncepta, istraživali smo zaštitne sastojke iz prirodnih proizvoda na TNF-a-induciranu staničnu smrt u L929 stanicama, staničnoj liniji osjetljivoj na TNF-a. 25) Prethodno smo izvijestili da nekoliko sastojaka iz Piper Chaba, 26—29) Boesenbergia rotunda, 30,31) Punica granatum, 32) Helichrysum arenarium, 33—35) i Sapindus rarak, 36—38) utvrđeno je da pokazuju inhibitorne učinke TNF-a -inducirana citotoksičnost u L929 stanicama. Budući da su feniletanoidni sastojci C. tubulosa (npr. ehinakozid, akteozid i izoakteozid, itd.) 5) također inhibirali ovu citotoksičnost, dodatno smo ispitali iridoidne, fenilpropanoidne i lignanske sastojke kao što je prikazano u tablici 4. Kao rezultat, kankanozid A (9, inhibicija: 16,3 2.0 posto na 100 mM), musaenozidna kiselina (10, 44,7 8,7 posto ), 8-epiloganska kiselina (11, 10,7 0,4 posto ), 8-hidroksigeraniol Utvrđeno je da 8-ObD-glukopiranozid (17, 21,3 2,4 posto) i ( )-pinorezinol ObD-glukopiranozid (22, 22,3 1,6 posto) pokazuju značajnu aktivnost. Iako su njihove aktivnosti bile slabije od aktivnosti ehinakozida (IC50 31,1 mM), akteozida (17,8 mM) i izoaceteozida (22,7 mM), glavnih sastojaka feniletanoida.5)

Eksperimentalno

Za dobivanje spektralnih i fizikalnih podataka korišteni su sljedeći instrumenti: specifične rotacije, Horiba SEPA-300 digitalni polarimetar (l 5 cm); UV spektri, Shimadzu UV-1600 spektrometar; IR spektri, Shimadzu FTIR-8100 spektrometar; 1H- i 13C-NMR spektri, spektrometri JEOL JNM-ECA600 (600, 150 MHz) i JEOL JNM-ECS400 (400, 100 HMz) s tetrametilsilanom kao internim standardom; FAB-MS i FAB-MS visoke rezolucije, maseni spektrometar JEOL JMS-SX 102A; HPLC detektor, Shimadzu RID-10A indeks loma, Shimadzu SPD-10A UV–VIS i Shodex OR-2 detektori optičke rotacije. HPLC kolona, ​​Cosmosil 5C18-MS-II i pNAP (Nacalai Tesque Inc., 250 4,6 mm id) i (250 20 mm id) kolone korištene su za analitičke i preparativne svrhe.

Sljedeći eksperimentalni uvjeti korišteni su za kromatografiju: normalna faza kromatografije na stupcu silika gela (CC), silika gel 60N (Kanto Chemical Co., Ltd., 63—210 mesh, sferični, neutralan); silikagel CC reverzne faze, Diaion HP-20 (Nippon Rensui) i Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd., 100-200 mesh); TLC normalne faze, TLC ploče prethodno obložene silika gelom 60F254 (Merck, 0,25 mm); TLC reverzne faze, TLC ploče prethodno obložene silikagelom RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); HPTLC reverzne faze, TLC ploče prethodno obložene silika gelom RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm), detekcija je postignuta raspršivanjem s 1 posto Ce(SO4)2 – 10 posto vodene otopine H2SO4, nakon čega je uslijedilo zagrijavanje .

Biljni materijal

Ova je stavka opisana u prethodnom izvješću.

Ekstrakcija i izolacija

Svježe stabljike C. tubulosa (2,98 kg) su sitno izrezane i ekstrahirane tri puta s metanolom pod refluksom tijekom 3 sata. Uparavanjem otapala pod smanjenim tlakom dobiven je metanolni ekstrakt (249,1 g, 8,36 posto). Metanolni ekstrakt podvrgnut je Diaion HP-20 CC (5.0 kg, H2O→MeOH) da se dobiju frakcije eluirane H2O i MeOH (167,84 g, 5,63 posto i 81,21 g, 2,73 posto, odnosno). Frakcija eluirana s MeOH (61.00 g) je podvrgnuta normalnoj fazi silika gela CC [1,8 kg, CHCl3– MeOH–H2O (15 : 3 : 0).4→1{{ 36}} : 3 : 0.5→6 : 4 : 1, v/v/v)→MeOH] da se dobije sedam frakcija [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4 (10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) i 7 (4,6{{104}} g)], kao što je prethodno opisano. 5) Frakcija 1 (1,12 g) odvojena je silikagelom reverzne faze CC [55 g, MeOH–H2O (4 0 : 60, v/v)→MeOH] da se dobije pet frakcija [Fr. 1-1 (132,8 mg), 1-2 (267.0 mg), 1-3 (182,8 mg), {{80}} (31{{ 156}}.9 mg) i 1-5 (91.4 mg)]. Frakcija 1-1 (132,8 mg) dalje je pročišćena pomoću HPLC [Cosmosil 5C{{9{{160}}}}MS-II, CH3CN–1 posto vodene AcOH (1{{166} } : 90, v/v)] da se dobije kankanozid M (2, 2,8 mg, 0.{{203}}{{22{{24{{248 }}}}}}01 posto ), barciozid (7, 5,2 mg, 0.0002 posto ), sinapin aldehid {{1{{295 }}6}}O- bD-glukopiranozid (21, 1,4 mg, {{3{{3{{3{{310}}9}}5}}{{320} }}}.0001 posto ). Frakcija 1-2 (267.{{350}} mg) dalje je pročišćena pomoću HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 posto vodene AcOH (7:93, v/v)] da se dobije (2E,6E)-3,7-dimetil-8-hidroksioktadien{{13{{360}}}}il-O- bD -glukopiranozid (16, 15,8 mg, {{370}}.{{406}}007 posto ), 8-hidroksigeraniol 8-ObD glukopiranozid (17, 5,2 mg, 0,0002 posto), ( )-pinorezinol ObD-glukopira nozid (22, 22,0 mg, 0,0010 posto), eucommin A (23, 5,0 mg, 0,0002 posto), isoeu commin A (24, 21,3 mg, 0,0010 posto), i ()-syringaresinol ObD-glucopy ranoside (25, 98,0 mg, 0,0044 posto). Frakcija 2 (9,56 g) odvojena je reverzno-faznim silikagelom CC [400 g, MeOH–H2O (10 : 90, v/v)→MeOH→ aceton] da se dobije pet frakcija [Fr. 2-1 (55,9 mg), 2-2 (4,48 g), 2-3 (3,42 g), 2-4 (1,16 g) i 2-5 (31,9 mg) ], kao što je prethodno opisano.5) Frakcija 2-2 (500,0 mg) podvrgnuta je HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 posto vodene AcOH (5 : 95, v/v )] da se dobije kankanozid L (1, 6,6 mg, 0,0026 posto) i 6-deoksikatalpol (6, 455,5 mg, 0,182 posto). Frakcija 2-3 (1,00 g) podvrgnuta je HPLC-u [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 postotna vodena otopina AcOH (7 : 93, v/v)] da se dobije sedam frakcija [Fr . 2-3-1 (66,5 mg), 2-3-2 (20,4 mg), 2-3-3 (26,0 mg), 2-3-4 (136,6 mg), 2-3-5 [ 7 (380,6 mg , 0,0581 posto )], 2-3-6 [ glurozid (8, 285,1 mg, 0,0435 posto )], i 2-3-7 (84,9 mg)]. Frakcija 2-3-4 (106,6 mg) dalje je pročišćena pomoću HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 posto vodene otopine AcOH (5 : 95, v/v)] da se dobije 6 (68,4 mg, 0,0134 posto) zajedno sa salidrozidom5) (13,7 mg, 0,0027 posto). Frakcija 2-4 (1,16 g) podvrgnuta je HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 posto vodene otopine AcOH (15 : 85, v/v) i Cosmosil pNAP, CH3CN–1 posto vodenom AcOH (10 : 90 ili 15 : 85, v/v)] da se dobiju kankanozidi N (3, 15,6 mg, 0,0007 posto), O (4, 44,1 mg, 0,0020 posto) i P (5, 4,2 mg, 0,0002 postotak), 6 (24,0 mg, 0,0011 posto), 8 (17,7 mg, 0,0008 posto), kankanoizid A (9, 22,3 mg, 0,0010 posto), 8-epideoksiloganska kiselina (12, 8,1 mg, 0,0004 posto), kankanozid E (14, 58,1 mg, 0,0026 posto), (2E,6Z)-8-bD-glukopiranosiloksi-2,6-dimetil-2,6-oktadienska kiselina kiselina (15, 31,0 mg, 0,0014 posto), 16 (168,6 mg, 0,0075 posto), 17 (94,3 mg, 0,0042 posto), betulalbusid A (18, 8,1 mg, 0,0004 posto), koniferin (19, 3,8 mg, 0,0002 posto) ), i syringin (20, 33,9 mg, 0,0015 posto). Frakcija 4 (10,69 g) odvojena je silikagelom reverzne faze CC [500 g, MeOH–H2O (30 : 70, v/v)→MeOH→aceton] da se dobiju četiri frakcije [Fr. 4-1 (878,2 mg), 4-2 (7,06 g), 4-3 (1,57 g) i 4-4 (792,8 mg)], kao što je prethodno opisano.5) frakcija 4-1 (500,0 mg) pročišćena je pomoću HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 postotna vodena otopina AcOH (10 : 90, v/v)] da se dobije musaenozidna kiselina (10, 39,1 mg, 0,0031 posto) i genipozidna kiselina (13, 51,2 mg, 0,0040 posto). Frakcija 5 (8,84 g) odvojena je silikagelom reverzne faze CC [400 g, MeOH–H2O (20 : 80→30 : 70, v/v)→MeOH→aceton] da se dobije sedam frakcija [Fr. 5-1 ​​(870,2 mg), 5-2 (478,9 mg), 5-3 (3,72 g), 5-4 (979,9 mg), 5-5 (1,19 g), 5-6 (1,27 g) i 5-7 (130,1 mg)], kao što je prethodno opisano. 5) Frakcija 5-1 (870,2 mg) dalje je pročišćena pomoću HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN –1 posto vodene otopine AcOH (5 : 95, v/v)] da se dobije 10 (55,3 mg, 0,0025 posto) i 8-epiloganska kiselina (11, 51,5 mg, 0,0023 posto).

Kankanozid L (1): bijeli prah, [a]D 26 45,7 (c 0,48, MeOH). FAB-MS s pozitivnim ionom visoke rezolucije: izračunato za C15H24O9Na [M Na] 371,1318; Nađeno 371.1309. IR (KBr, cm1): 3433, 2928, 1080. 'H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: dano u tablici 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: dano u tablici 2. Pozitivna- ion FAB-MS m/z: 371 [M Na]. FAB-MS negativnih iona m/z: 347 [MH].

Kankanozid M (2): bijeli prah, [a]D 26 18,7 (c 0,11, MeOH). FAB-MS s pozitivnim ionom visoke rezolucije: izračunato za C15H22O8Na [M Na] 353,1212; Pronađeno 353.1208. IR (KBr, cm1): 3433, 2924, 1736, 1655, 1076. 'H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: dano u tablici 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: dano u tablici 2. FAB-MS pozitivnih iona m/z: 353 [M Na].

Kankanozid N (3): bijeli prah, [a]D 25 24,6 (c 1.00, MeOH). FAB-MS s pozitivnim ionom visoke rezolucije: izračunato za C16H28O8Na [M Na] 371,1682; Nađeno 371.1686. IR (KBr, cm'): 3415, 2874, 1076, 1028. 'H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: dano u Tablici 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: dano u Tablici 2. FAB-MS pozitivnih iona m/z: 371 [M Na].

Kankanozid O ​​(4): bijeli prah, [a]D 23 26,1 (c 2,30, MeOH). FAB-MS s pozitivnim ionom visoke rezolucije: izračunato za C16H26O8Na [M Na] 369,1525; Nađeno 369.1528. UV [1 max (log e), MeOH, nm]: 217 (4,04). IR (KBr, cm1): 3433, 2926, 1696, 1647, 1076. 'H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: dano u tablici 3. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: dano u tablici 2. FAB-MS pozitivnih iona m/z: 369 [M Na].

Kankanozid P (5): bijeli prah, [a]D 21 32,7 (c 0,18, MeOH). FAB-MS s pozitivnim ionom visoke rezolucije: izračunato za C16H26O8Na [M Na] 369,1525; Nađeno 369.1520. UV [1 max (log e), MeOH, nm]: 217 (4,08). IR (KBr, cm1): 3434, 2926, 1701, 1647, 1076. 'H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: dano u tablici 3. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: dano u tablici 2. FAB-MS pozitivnih iona m/z: 369 [M Na].

Kisela hidroliza kankanozida L—P (1—5): Otopine 1—5 (svaka 1.0 mg) u 1.0 M HCl (1.0 ml) su grijana na 80 stupnjeva 3 h. Nakon hlađenja, reakcijska smjesa je neutralizirana s Amberlite IRA-400 (OH oblik), a smole su uklonjene filtracijom. Nakon uklanjanja otapala pod sniženim tlakom, ostatak je odvojen kolonom Sep-Pak C18 uloška (H2O→MeOH). H2O-eluirana frakcija podvrgnuta je HPLC analizi pod sljedećim uvjetima: HPLC kolona, ​​Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm id 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd., Tokyo, Japan); detekcija, optička rotacija [Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd., Tokio, Japan); mobilna faza, CH3CN–H2O (85:15, v/v); brzina povrata 0,8 ml/min]. Identifikacija D-glukoze prisutne u H2O-eluiranim frakcijama od 1-5 provedena je usporedbom njihovih retencijskih vremena i optičke rotacije s onima autentičnog uzorka [tR 17,9 min (pozitivno)].

Hidrogenacija {{0}}deoksikatalpola (6) Suspenzija od 6 (12.0 mg) i 10 posto paladija ugljika (5.0 mg) u MeOH (2,0 ml) se miješa na sobnoj temperaturi u atmosferi H2 2 h. Katalizator se odfiltrira, a filtrat se kondenzira pod smanjenim tlakom da se dobije 1 (12,0 mg, kvant.).

Enzimska hidroliza kankanozida O (4) i P (5) s b-glukozidazom U otopinu 4 (8.0 mg) u H2O (1,5 ml) dodana je b-glukozidaza (4,7 mg, iz badema, Oriental Yeast Co., Tokyo, Japan), a otopina je miješana na 37 stupnjeva 24 sata. Reakcija je ugašena dodatkom EtOH (5.0 ml), smjesa je kondenzirana pod smanjenim tlakom. Ostatak je ekstrahiran s EtOAc i uparavanjem otapala dobiven je (2E,6E)-8-hidroksi-2,{{20}}dimetil-2,{{22} }oktadecenska kiselina20) (4a, 3,9 mg, 92 posto). Sličnim postupkom, (2E,6E)-8-hidroksi-3,7-dimetil-2,6-oktadecenska kiselina21) (5a, 0,9 mg, 94 posto ) dobiven je iz kankanozida P (5, 1,8 mg).

Metoda biološke analize Inhibicijski učinak na TNF-a-induciranu citotoksičnost u L929 stanicama ispitan je metodom opisanom u prethodnom radu.5)

Statističke vrijednosti su izražene kao srednje vrijednosti SEM Jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) praćena Dunnettovim testom korištena je za statističku analizu. Vrijednosti vjerojatnosti (p) manje od 0.05 smatrane su značajnima.

cistanche herb