Kemijska svojstva mannoglukana iz Cistanche Deserticola
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
1. Materijali
Korištene su oralne paste za konje dvaju različitih proizvođača koje su sadržavale 10 mg/g (A) odnosno 20 mg/g (B) ivermektina. Provedena je kvantitativna analiza ivermektina i sadržaj je iznosio 104,4 – 107,7 posto od deklarirane koncentracije.
2. Ispitivanje otapanja
Ispitivanje je provedeno s Ph. Eur. aparat s lopaticom (Pharma Test, Heinberg, Njemačka), pri miješanju od 75 okretaja u minuti ili 5 0 okretaja u minuti, na 37 -0,5 C. Natrijev lauril sulfat (BDH Chemicals, Poole, Engleska) 0,5 posto (w /v) vodena otopina korištena je kao medij za otapanje (900 ml). Pasta (4 g A ili 2 g B) stavljena je u posudu štrcaljkom s kanilom (A) ili kapanjem uzorka na površinu medija za otapanje (B). Nakon vremenskih intervala (15, 30, 45, 60 min i 2 h) uzet je uzorak medija za otapanje (2 ml), filtriran kroz stakleni filter i analiziran.
3. HPLC analiza
Određivanje ivermektina provedeno je modificiranom HPLC metodom kako je opisano u Ph. Eur. Analizirane otopine razrijeđene su metanolom (1:10). HPLC sustav sastojao se od oktadecilne kolone (250 -4 mm; 5 mm; Lichrospher RP-18; Merck), integratora D-12500 A, detektora UV-Vis L{{7} }, pumpa L-6200A (Merck-Hitachi, Darmstadt, Njemačka). Mješavina acetonitril:metanol:voda (64:24:16) korištena je kao mobilna faza s brzinom protoka od 1,9 ml/min. Volumen ubrizganog uzorka bio je 20 ml, a detekcija je obavljena na 254 nm.
4. Studije topljivosti
Pristup tvari je mućkan u dobro zatvorenim staklenim posudama s odgovarajućim otapalom (Tablica 1) 20 h na 37 0.1 C. Suspenzije su filtrirane i filtrat je, nakon razrjeđivanja u metanolu, analiziran HPLC-om .
5. Stabilnost u kiseloj otopini
Otopine ivermektina u HCl {{0}}.1 M pohranjene su u dobro zatvorenim staklenim bočicama na 20 C i 37 C. Kromatogrami otopina snimani su na t=0 i nakon 1, 2 i 6 h. Izračunata je površina ivermektina (vrijeme zadržavanja 10,5 min) i dodatni pikovi.
Reference
Smjernice FDA za industriju: SUPAC-SS nesterilni polukruti oblici doziranja. Promjene u skaliranju i nakon odobrenja: kemija, proizvodnja i kontrole; in vitro testiranje otpuštanja i in vivo dokumentacija bioekvivalencije. Svibanj 1997. FIP smjernice za ispitivanje otapanja krutih oralnih proizvoda (1997) Dissolute. Technol. 4: 5–14. Siewert M, Dressman J, Brown C, Shah VP (2003) FIP/AAPS smjernice za ispitivanje otapanja/in vitro otpuštanja novih/posebnih oblika doziranja, AAPS PharmSciTech, 4 (1) članak 7 Moderni istraživački centar za tradicionalnu kinesku medicinu, škola farmaceutskih znanosti, Zdravstveni znanstveni centar Sveučilišta Peking, Peking, Kina
Xiang mei Wu, Pengfei Tu Primljeno 13. veljače 2004., prihvaćeno 4. travnja 2004., Prof. Dr. Pengfei Tu, Moderni istraživački centar za tradicionalnu kinesku medicinu, Fakultet farmaceutskih znanosti, Zdravstveni znanstveni centar Sveučilišta u Pekingu, br. 38, Xueyuan Road , Haidian District, Peking 100083, Kina Pengfeitu@bjmu.edu.cn Pharmazie 59: 815–816 (2004.)
Novi mannoglukan izCistanche deserticolaiz Kine karakterizira se. Spoj je odgovoran za blagu stimulaciju mitogenom inducirane proliferacije T i B limfocita.
Cistanche deserticolaYC Ma je holoparazit koji raste na korijenju dikotilne biljke Haloxylon ammodendron Bunge koja je široko rasprostranjena na sjeverozapadu Kine. Budući da je to važan tonik u istočnjačkoj medicini, tvrde se mnoge aktivne komponente i farmakološka djelovanja (Karasawa et al. 1986; Yoshizawa et al. 1990). Ova svojstva mogu biti povezana s nekim od polisaharidnih komponentiCistanchekoji još nisu istraženi. Mitogeni pektinski polisaharidi i neutralni polisaharidi izolirani su i iz njih karakteriziraniCistanche deserticolaiz Mongolije (Radna i sur. 1996; Anna i sur. 1997; Bozena i sur. 1999). Ovdje donosimo kemijska svojstva novog mannoglukana izCistanche deserticolaiz Kine, koji je odgovoran za blagu stimulaciju mitogenom inducirane proliferacije T i B limfocita. Nakon stabljika odCistanche deserticolaYC Ma su ekstrahirani 95 postotnim etanolom, a za ekstrakciju ostatka korištena je hladna destilirana voda. Ekstrakt hladne vode je istaložen s EtOH, protein je uklonjen i dijaliziran, dobivajući sirovi polisaharid CCDP. Sirovi polisaharid je frakcioniran na koloni DEAE i koloni Sephadex G-150 da bi se dobio polisaharid bez proteina (CDP-6), koji je sadržavao glukozu (89,2 posto) i manozu (1{{58} }.4 posto ), a od kojih je prosječni Mr procijenjen na 6.8 -104. Polisaharid CDP-6 pokazao je [a 20 D 42 (c 1, H2O). Apsolutne konfiguracije šećera određene su GC TMS (– )-2-butil glikozida. CDP-6 je metiliran (Needs et al. 1993), hidroliziran, preveden u alditol acetate i analiziran pomoću GC i GC-MS (tablica). Ovaj rezultat zajedno s podacima o molarnom omjeru iz analize metilacije sugerirao je da CDP-6 ima pretežno 1,6-vezani Glcp i okosnicu 1,6- povezanu u manjoj mjeri razgranatu na O{{ 24}} manoze. Analiza metilacije dva polimera (CDP-6-1, CDP-6–2) iz djelomične hidrolize potvrdila je da CDP-6 ima okosnicu koja se sastoji od 1,6-povezanih glukozilnih ostataka i 1,6-vezanih manozilnih ostataka, koji su supstituirani na O-3 manoze granama koje se sastoje od terminalnih, 1,6- povezanih glukozilnih ostataka i 1,3,{{38} }vezanih manozilnih ostataka. Prema molarnim omjerima i literaturi (Bozena et al. 1999; Bacon et al. 1996), 13C NMR spektar CDP-6 pokazao je signale zbog anomernih ugljika a-d-Glcp (C{{45 }} pri 98,4 ppm), bd-Map (C-1 pri 104,3–104,9 ppm) i ad-Map (C-1 pri 100,0 ppm). 1H NMR spektar CDP-6-2 u D2O pokazao je protonske signale koji odgovaraju ad-Glcp (H-1 na 4,94–4,95 ppm) i a-d-Map (H-1 na 4,96–5,00 ppm). 13C NMR spektar CDP-6-2 u D2O pokazao je protonske signale koji odgovaraju aD-Glcp (C-1 pri 98,6 ppm) i ad-Map (C-1 pri 98,4 ppm). Prijavljeno je da mannoglukani imaju 1,4-vezani glukopiranan i 1,4-vezani manopiranan okosnicu (Radjabi Nassab et al. 1984; Tanabe et al. 2000). CDP-6 ima neke različite strukturne značajke svojom a-1,6-povezanom Glcp i b-1,6-povezanom Map okosnicom, a zamijenjena je granama mannoglukana (Sl.). Kako bi se istražila upotrebaCistanche deserticolau narodnoj medicini procijenjen je učinak CDP-6 na T i B stanični sustav. Utvrđeno je da blago stimulira proliferaciju T i B limfocita izazvanu mitogenom.
Eksperimentalno
1. Opći postupci
Optička rotacija mjerena je automatskim polarimetrom W22-1S. IR spektri su određeni na spektrometru Perkin-Elmer 599B. GC analiza je provedena na instrumentu Agilent HP6890N, opremljenom FID detektorom. GC-MS je izveden na Finnigan Trace GC-MS instrumentu. Homogenost i Mr CDP-6 procijenjeni su iz kalibracijske krivulje volumena eluacije standardnih dekstrana, koja je izvedena na
aparat serije Agilent 1100 sa kolonom Shodex KS-805.1H NMR i 13C NMR spektri snimljeni su instrumentom INOVA-500. Sadržaj proteina analiziran je Bradfordovom metodom (Andre i sur. 1975.). Monosaharidi su analizirani na njihov alditol acetat nakon što su hidrolizirani (2 M TFA, 2 h, 110 C), reducirani i acetirani. Hidrolizati su analizirani pomoću TLC na ploči silika gela koja je sadržavala 5 posto natrij dihidrogen fosfata u BuOH-EtOAc-izopropil alkohol-HOAC––H2Opiridin (3,5:10:6:3,5:3:3), a šećeri su detektirani prskanjem orcinolom -H2SO4. Rezultirajući alditol acetati analizirani su pomoću GLC upotrebom HP-5 kapilarne kolone (30 m 0,32 mm). CDP-6 je metiliran Ciucanu metodom, nakon čega je uslijedila hidroliza, te je analiziran kao djelomično metilirani alditol acetati pomoću GC-MS. Nakon djelomične hidrolize, produkti su dijalizirani i razdvojeni, čime su dobivena dva polimera, CDP-6-1 i CDP-6–2.
2. Biljni materijal
Biljka je sakupljena u provinciji Unutrašnja Mongolija u Kini u kolovozu 2001., a identificirao ju je Hu-Biao Chen, Odjel za prirodnu medicinu, Fakultet farmaceutskih znanosti, Zdravstveni znanstveni centar Sveučilišta u Pekingu. Uzorak [E-1-(9)] ove biljke deponiran je na Fakultetu farmaceutskih znanosti, Pekinško sveučilište. 3. Ekstrakcija, izolacija i pročišćavanje polisaharida CDP-6 StabljikaCistanche deserticolaYC Ma (1500 g) ekstrahirani su s 95 postotnim etanolom (6 L) pod refluksom. Osušeni ostatak netopljiv u etanolu je maceriran tri puta hladnom destiliranom vodom po 12 h. Ekstrakt hladne vode je filtriran, a filtrat centrifugiran. Nakon taloženja s četiri volumena EtOH (miješanje i stajanje 24 sata na 4°C), dobiven je produkt precipitat (35,5 g). Protein u talogu uklonjen je Savageovom metodom. Nakon otapanja u destiliranoj vodi, ostatak (25,5 g) je dijaliziran i liofiliziran (prinos: 10,6 g). Sirovi polisaharid (8 g) otopljen je u destiliranoj vodi (100 mL, 8 posto w/v) i odvojen pomoću DEAE kolone (70 5 cm, gradijent 0-2 M NaCl, po 1,5 L). Dobivena je frakcija eluirana vodom (600 mg). Uzorak (250 mg) je pročišćen kolonskom gel-permeacijskom kromatografijom na Sephadex G- 150 kolonama (4 - 80 cm, 1600 mL, 5 mL po frakciji). Frakcije CDP-6 (1500-1600 mL) su skupljene, dijalizirane i osušene smrzavanjem. Nakon desalinizacije Sephadexom G-25 (60 1 cm). CDP-6 (110 mg) je dobiven i određen kao pojedinačni maksimum pomoću HPSGC.
Priznanje:Autor zahvaljuje dr. Baomei Shao i prof. Xiaoming Gao, Škola osnovnih medicinskih znanosti, Pekinški sveučilišni zdravstveni znanstveni centar, za mjerenje imunomodulatorne aktivnosti CDP-6.
