Formononetin ublažava autoimuni prostatitis putem JAK/STAT modulacije i rebalansa imunološkog sustava: implikacije za CP/CPPS i TCM dodatke ekstrakta Cistanche
Dec 10, 2025
Cilj:Istražiti kako formononetin (FN) regulira diferencijaciju stanica T pomoćnika tipa 1 (Th1) i polarizaciju makrofaga putem JAK/STAT signalnih putova u mišjem modelu eksperimentalnog autoimunog prostatitisa (EAP).
Metode:Četrdeset muških nepretilih dijabetičkih (NOD) miševa nasumično je raspoređeno u četiri skupine: normalna kontrola, kontrola EAP modela, FN s niskom dozom (LFN, 50 mg/kg) i FN s visokom dozom (HFN, 100 mg/kg). EAP je induciran u zadnje tri skupine supkutanom injekcijom antigena prostate (PAgs) emulgiranih u potpunom Freundovom adjuvansu (CFA). Nakon modeliranja, LFN i HFN skupine primile su intragastrični FN od 50 odnosno 100 mg/kg/dan; normalne i modelne kontrole primile su natrij karboksimetilcelulozu (CMC-Na). 42. dana nakon početka liječenja, miševi su eutanazirani i tkiva su sakupljena. Patologija prostate procijenjena je HE bojenjem; Diferencijacija Th1 stanica i polarizacija makrofaga u prostati procijenjeni su imunofluorescentnim dvostrukim bojanjem (CD4 s interferonom- [IFN-]; inducibilna sintaza dušikovog oksida [iNOS] i CD206). Proporcije Th1 stanica i makrofaga u slezeni mjerene su protočnom citometrijom, a razine IFN-a i čimbenika tumorske nekroze (TNF-) u serumu ELISA-om. Fosforilirani (p)-JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-STAT1 i STAT1 u tkivu prostate određeni su Western blotom.
Rezultati: U usporedbi s kontrolama modela, obje doze FN dovele su do urednijeg rasporeda žljezdanih epitelnih stanica, značajno smanjile rezultate upale prostate (P <0,05), smanjile udio Th1 stanica i markera makrofaga M1 (P <0,05) i povećale markere makrofaga M2 u tkivima prostate i slezene (P <0,05). Razine IFN-a i TNF-a u serumu bile su izrazito smanjene u LFN i HFN skupinama (P <0,05). Na molekularnoj razini, omjeri p-JAK1/JAK1, p-JAK2/JAK2 i p-STAT1/STAT1 u tkivu prostate bili su značajno smanjeni (P <0,05), što ukazuje da FN ima terapeutske učinke u EAP modulacijom JAK/STAT signalizacije, promicanjem rješavanja upale i vraćanjem imunološke ravnoteže.
Zaključak:FN ublažava EAP inhibicijom JAK/STAT signalnih putova i reguliranjem Th1 diferencijacije i polarizacije makrofaga. Ova otkrića, zajedno s rastućim interesom za dodatke tradicionalne kineske medicine (TCM), kao što su dodaci ekstrakta Cistanche za imunološku modulaciju i potporu boli u zdjelici, sugeriraju strategiju s više ciljeva vrijednu daljnje validacije u rigoroznim, recenziranim okruženjima.
Ključne riječi:formononetin;autoimuni prostatitis; upalni odgovor; JAK/STAT signalni putovi; miševi;Dodatak ekstrakta TCM biljke Cistanche; imunomodulacija
Dodatak ekstrakta TCM biljke Cistanche
Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
Uvod
Kronični prostatitis/sindrom kronične boli u zdjelici (CP/CPPS) pogađa 5%–10% muškaraca i čini otprilike 90% svih slučajeva prostatitisa. Osobito je raširen među mladim i sredovječnim muškarcima, manifestirajući se primarno bolovima u donjem dijelu trbuha, perineumu i zdjeličnoj regiji, često praćenim simptomima donjeg urinarnog trakta, a ponekad i erektilnom disfunkcijom. Trenutne terapije prve linije uključuju nesteroidne protuupalne lijekove (NSAID), antibiotike i blokatore adrenergičkih receptora, same ili u kombinaciji. Međutim, visoke stope recidiva dovode do toga da mnogi pacijenti budu nezadovoljni ovim režimima. Stoga su hitno potrebni novi terapijski zahvati i dublji uvid u patogenezu CP/CPPS.
Dodatak ekstrakta biljke CM Cistanche Prednosti
Sve više dokaza pokazuje da imunološka disregulacija igra ključnu ulogu u razvoju CP/CPPS. Bolesnici obično pokazuju opsežnu infiltraciju T limfocita i monocita u tkivu prostate i povišene leukocite u izraženom prostatskom sekretu, u kojem dominiraju CD4+ T limfociti i makrofagi. Pretklinički podaci dalje sugeriraju da imunosupresivne strategije mogu ublažiti upalu i bol kod CP/CPPS. Stoga, ciljanje infiltracije leukocita i upalnog odgovora može biti učinkovito za ublažavanje simptoma. Formononetin (FN), glavni bioaktivni izoflavon u nekoliko TCM biljaka, posjeduje antioksidativna i protuupalna svojstva. Može li FN poboljšati CP/CPPS ostaje nejasno. Ovdje smo procijenili terapeutski učinak FN-a u mišjem EAP modelu. Paralelno s rastućim kliničkim interesom za integrativne pristupe, primjećujemo da se dodaci ekstrakta biljke Cistanche iz TKM-a istražuju za imunomodulatornu i protuupalnu potporu kod sindroma boli u zdjelici; iako nisu fokus ove studije, oni kontekstualiziraju FN unutar šireg terapijskog krajolika temeljenog na TCM-u.
Materijali i metode
Životinje
Muški NOD miševi stari 6-7 tjedana dobiveni su iz Centra za eksperimentalne životinje Šangajskog sveučilišta tradicionalne kineske medicine (SUTCM) (licenca SYXK [Hu] 2020-0009; potvrda SCXK [Jing] 2021-0006). Životinje su držane u ciklusima od 12 sati svjetla/12 sati mraka s ad libitum pristupom hrani i vodi. Sve postupke odobrio je Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja SUTCM (br. odobrenja PZSHUTCM2301040003).
Reagensi i lijekovi
Formononetin (MedChemExpress, HY‑N0183); potpuni Freundov adjuvans (CFA; Sigma-Aldrich, F5881); fosfatno puferirana fiziološka otopina (PBS); goveđi serum albumin (BSA); ultraosjetljivi ECL setovi (Shanghai YaYme Biotech, CB012, PS113, SQ201); antitijela na p-JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-STAT1, STAT1, GAPDH i DAPI (tehnologija stanične signalizacije, #74129, #3344, #3776, #3230, #9167, #9172, #5174, #8961); RIPA pufer i test BCA proteina (Thermo Fisher Scientific, 89901, A55866); HE pribor za bojenje (Servicebio, GP1031); iNOS i CD206 (Abcam, ab178945, ab125028); APC anti-mišji CD3, FITC anti-mišji CD4, PE anti-mišji IFN‑ (BioLegend, 100235, 100405, 505807).
instrumenti
Aparat za elektroforezu (E11001, Bio‑Rad); laserski skenirajući konfokalni mikroskop (LSM 780, Zeiss); CytoFLEX protočni citometar (Beckman Coulter).
Uspostava EAP modela
Nakon tjedan dana privikavanja, miševi su randomizirani u četiri skupine (n=10): kontrola, model, niska doza FN (50 mg/kg) i visoka doza FN (100 mg/kg). EAP je induciran prethodnim metodama. Supernatant koji sadrži antigene prostate (PAg) pripremljen je iz homogenata prostate štakora Sprague-Dawley i pomiješan 1:1 s CFA. Dana 0 i 28, miševi su primili supkutane injekcije u oba stražnja šapa, donji dio leđa i bazu repa ili PAg (300 ug/miš; EAP grupe) ili PBS (kontrola), emulgiran s CFA (150 µL/miš). FN skupine primale su dnevno intragastrični FN (50 ili 100 mg/kg); kontrolne i modelne skupine primile su CMC-Na usklađenog volumena. Eksperiment je završio 42. dana nakon čega je uslijedila humana eutanazija.
HE bojenje tkiva prostate
Prostata je fiksirana u 4% paraformaldehidu, dehidrirana, uklopljena u parafin i izrezana na 5 µm. Sekcije su obojene pomoću HE kita i snimljene konfokalnom mikroskopijom. Upala je ocijenjena ocjenom 0-3 na temelju utvrđenih kriterija, pri čemu 0 označava odsustvo upale, a 3 ukazuje na izraženu infiltraciju upalnih stanica.
Protočna citometrija za Th1 stanice i makrofage
Suspenzije pojedinačnih stanica su pripremljene i održavane u PBS s 0,5% BSA. Površinsko i unutarstanično bojenje slijedilo je standardne protokole koristeći APC anti-CD3, FITC anti-CD4 i PE anti-IFN-. Stanice su stimulirane s 50 ng/mL PMA, 1 ug/mL ionomicina i 5 ug/mL brefeldina A na 37 stupnjeva tijekom 4 sata, zatim su obojene intracelularno na 4 stupnja tijekom 30 minuta. Podaci su prikupljeni na CytoFLEX-u i analizirani s FlowJo.
Imunofluorescentno bojenje za makrofage
Fiksirani dijelovi prostate su deparafinizirani, podvrgnuti pronalasku antigena i blokirani 10% kozjim serumom 30 minuta. Primarna protutijela (iNOS, CD206) primijenjena su preko noći na 4 stupnja. Nakon ispiranja PBS-om, fluoroforom obilježena sekundarna protutijela primijenjena su 1 sat na 37 stupnjeva u mraku. Jezgre su obojene DAPI-jem tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega je uslijedilo ispiranje PBS-om i postavljanje za fluorescentnu mikroskopiju.
Mjerenje citokina
Serumski IFN‑ i TNF‑ kvantificirani su pomoću ELISA kompleta prema uputama proizvođača.
Western Blot
Tkiva prostate su lizirana u RIPA puferu (s inhibitorima proteaze i fosfataze). Koncentracija proteina je mjerena BCA testom. Pripremljeni su odgovarajući postotni gelovi; jednake količine proteina su podvrgnute elektroforezi i prenesene na PVDF membrane. Primarna protutijela (p-JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-STAT1, STAT1, GAPDH; sva 1:1000) inkubirana su preko noći na 4 stupnja, nakon čega je uslijedilo ispiranje i inkubacija s HRP-konjugiranim sekundarnim protutijelima (1:5000) tijekom 1,5 h. Trake su vizualizirane pojačanom kemiluminiscencijom i snimljene. Relativna ekspresija proteina izračunata je denzitometrijskom analizom.
Statistička analiza
Podaci su analizirani pomoću GraphPad Prism 9.0. Jednosmjerna ANOVA korištena je za usporedbe više grupa. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD; P Manje od ili jednako 0,05 smatralo se statistički značajnim.
Rasprava
Ova studija pokazuje da formononetin ublažava histopatološku upalu, potiskuje Th1 polarizaciju, pomiče fenotipove makrofaga s proupalnog M1 na pro-razlučujući M2 i smanjuje fosforilaciju JAK1/2–STAT1 u tkivu prostate u EAP mišjem modelu. Smanjeni sistemski IFN‑ i TNF‑ dodatno potvrđuju protuupalne i imunoregulacijske učinke FN-a. Ovi rezultati su u skladu s prethodnim izvješćima o FN modulaciji JAK/STAT puteva u modelima ishemije-reperfuzije i ateroskleroze, naglašavajući sačuvane protuupalne mehanizme. Unutar šireg konteksta TKM-a, putovi integrativne skrbi ponekad uključuju botaničke preparate kao što su dodaci ekstrakta Cistanche (Rou Cong Rong), koji su ispitivani za imunomodulaciju, umor i urogenitalnu potporu. Iako ekstrakt Cistanche nije testiran ovdje, buduće kontrolirane studije mogle bi usporediti ili kombinirati FN sa standardiziranim dodacima ekstrakta biljke Cistanche kako bi se istražila potencijalna sinergija na ishode upale i boli u zdjelici povezane s JAK/STAT-om. Svaki klinički prijevod trebao bi se pridržavati standarda utemeljenih na dokazima, izvora s kontroliranom kvalitetom i sigurnosnog praćenja.
Zaključci
Formononetin ublažava eksperimentalni autoimuni prostatitis inhibicijom JAK/STAT signalizacije i reguliranjem Th1 diferencijacije i polarizacije makrofaga. Ovi nalazi daju mehaničko obrazloženje za daljnji razvoj FN-a i potencijalno pomoćnih strategija TCM-a kao što su dodaci ekstrakta Cistanche-a kao imunomodulatorne intervencije za CP/CPPS, čekajući validaciju u rigoroznim, recenziranim pretkliničkim i kliničkim studijama.
Reference
[1] He SL, Zhang ZJ, Wu JH, et al. Utjecaj erektilne disfunkcije na psihološke simptome u bolesnika s CP/CPPS. Journal of Hunan Normal University (Medical Sciences), 2021., 18(5): 27–30.
[2] Polackwich AS, Shoskes DA. Kronični prostatitis/sindrom kronične boli u zdjelici: pregled evaluacije i terapije. Rak prostate i bolesti prostate, 2016., 19(2): 132–138.
[3] Sun Y, Liu Y, Liu B, et al. Učinkovitost akupunkture za CP/CPPS: randomizirano ispitivanje. Annals of Internal Medicine, 2021, 174(10): 1357–1366.
[4] Franco JV, Turk T, Jung JH, et al. Nefarmakološke intervencije za liječenje CP/CPPS. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2019, 10: CD012551.
[5] Rees J, Abrahams M, Doble A, et al. Dijagnostika i liječenje kroničnog bakterijskog prostatitisa i CP/CPPS: Konsenzusne smjernice. BJU International, 2015., 116(4): 509–525.
[6] Pena VN, Engel N, Gabrielson AT, et al. Dijagnostičke strategije i strategije upravljanja za CP/CPPS. Lijekovi i starenje, 2021., 38(10): 845–886.
[7] Chen L, Zhang M, Liang C. CP/CPPS: Još jedna autoimuna bolest? Archives of Immunology and Therapy Experimentalis, 2021., 69(1): 24.
[8] Murphy SF, Schaeffer AJ, Thumbikat P. Imunološki posrednici sindroma kronične boli u zdjelici. Nature Reviews Urology, 2014., 11(5): 259–269.
[9] Appiya SM, Khan FU, Naveed M, et al. Intervencije za CP/CPPS: Gdje smo i što je sljedeće? European Journal of Pharmacology, 2019, 857: 172429.
[10] Yu L, Zhang Y, Chen Q, et al. Formononetin štiti od upale povezane s cerebralnom ishemijom-reperfuzijom putem JAK2/STAT3. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2022, 149: 112836.
[11] Ma X, Wang J. Formononetin: Put za zaštitu neurona. Frontiers in Integrative Neuroscience, 2022, 16: 908378.
[12] Ma C, Xia R, Yang S, et al. Formononetin ublažava aterosklerozu preko KLF4-SRA interakcije u ApoE−/− miševa. Teranostika, 2020., 10(3): 1090–1106.
[13] Du HX, Yue SY, Niu D, et al. Crijevna mikroflora modulira Th17/Treg diferencijaciju u EAP-u putem propionata. Frontiers in Immunology, 2022, 13: 915218.
[14] Du H, Chen X, Zhang L, et al. EAP izaziva oštećenje pamćenja učenja i neuroplastične promjene kod miševa. Stanična i molekularna neurobiologija, 2020., 40(1): 99–111.
[15] Zhang Y, Feng R, Chen S, et al. Uzročni učinak CXCR7 na EAP ozljedu i fibrozu. International Immunopharmacology, 2025, 144: 113368.
