Prethodno učenje o strahu omogućuje brzu asimilaciju novih sjećanja na strah izravno u kortikalne mreže 2. dio

Prethodno kontekstualno učenje straha omogućuje prednjem cingularnom korteksu da odmah kodira nova sjećanja

Do danas smo istraživali dinamiku konsolidacije sustava u slušnim sjećanjima straha. Međutim, model konsolidacije sustava uglavnom dolazi iz studija o pamćenju ovisnom o hipokampusu.

Auditivni strah je vrlo čest psihološki problem koji može imati veliki utjecaj na svakodnevni život ljudi. Kada se pojavi slušna fobija, ljudi se mogu osjećati vrlo neugodno, a mogu čak uzrokovati razne zdravstvene probleme. Ali u isto vrijeme, postoje i eksperimenti koji dokazuju da slušni strah također može poboljšati pamćenje.

Posljednjih su godina istraživači otkrili da su ljudi s slušnom fobijom pažljiviji i osjetljiviji od drugih. Njihov mozak snažnije i brže reagira na zvučnu stimulaciju. Ova reakcija ih čini osjetljivijima na zvukove u njihovim životima. U nekim slučajevima, oni su sposobniji obraditi različite informacije i čak dobiti korisnije znakove iz zvukova, potencijalno poboljšavajući svoje ukupno pamćenje.

Kada je osoba u napetom ili tjeskobnom emocionalnom stanju, mozak oslobađa tvar koja se zove adrenalin. Ova tvar može pospješiti aktivnost moždanih neurona i povećati koncentraciju ljudi. Stoga, tijekom slušnog stanja straha, oslobađanje adrenalina dovodi do veće koncentracije i pamćenja kod slušatelja.

U isto vrijeme, kada audio podražaj straha traje, mozak se može prilagoditi ovom podražaju izgradnjom dubljeg pamćenja zvuka. Ovo pamćenje može pomoći pacijentima da bolje reagiraju na različite zvučne podražaje, omogućujući im da postanu sigurniji i neovisniji.

Stoga, iako slušni strah može uzrokovati mnoge neugodnosti u svakodnevnom životu ljudi, on također može imati pozitivan utjecaj na pamćenje. Kad ljudi nauče kako se nositi s ovim psihološkim problemom, mogu prevladati svoje strahove i čak imati koristi od njih. Ovo nas također podsjeća da bismo trebali ispravno gledati na psihološke probleme, obratiti pozornost na mentalno zdravlje i koristiti pozitivan stav za suočavanje s poteškoćama kako bismo svoj život učinili boljim. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje. Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer Cistanche deserticola također može regulirati ravnotežu neurotransmitera, poput povećanja razine acetilkolina i faktora rasta. Ove tvari su vrlo važne za pamćenje i učenje. Osim toga, meso također može poboljšati protok krvi i pospješiti opskrbu kisikom, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hranjivih tvari i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite znati suplemente za poboljšanje pamćenja

Smatra se da se ta sjećanja početno formiraju i na hipokampalnoj i na kortikalnoj razini. Tijekom vremena, koordinirana međuigra između hipokampusa i kortikalnih mreža dovodi do postupnog preoblikovanja kortikalnih krugova koji na kraju pohranjuju udaljena sjećanja [1-5]. U skladu s tim, u naivnih životinja, sjećanja na strah ovisna o hipokampusu, odnosno kontekstualna sjećanja na strah, u početku su ovisna o hipokampusu i postupno postaju ovisna o kortikalnoj mreži koja obuhvaća ACC i prefrontalni korteks [1,2,6-8 ].

Stoga smo razmotrili je li se ova vremenski ovisna reorganizacija dogodila drugačije ako je prethodno došlo do konsolidacije sustava prethodne memorije. Štakori su trenirani da povezuju kontekst sa SAD-om. Dva tjedna ranije, 1 skupina štakora naučila je još jednu povezanost između različitog konteksta i SAD-a (CtxA-CtxB), dok je druga skupina primila samo neposredne bolne podražaje koji su ometali kontekstualno učenje straha (šok-CtxB) (S1A Slika). Životinjama je ubrizgan CNQX ili fiziološka otopina u ACC 24 sata nakon kontekstualnog učenja (Slike 4A i S1B).

U skladu s prethodnim studijama [1,6,8], inaktivacija ACC-a kod životinja koje nisu naučile drugu asocijaciju straha prethodno je ostavila nepromijenjeno zamrzavanje na CtxB, što sugerira da ova manipulacija nije utjecala na nedavno pamćenje. Međutim, slično podacima dobivenim u slušnom učenju straha, inaktivacija ACC-a smanjila je smrzavanje na nedavni CtxB kod štakora koji su naučili prethodnu kontekstualnu povezanost straha (Slika 4B i 4C).

Ovaj je fenomen bio uzročno povezan s razvojem spore konsolidacije sustava prvog sjećanja jer ga nije bilo kod životinja kod kojih su dva događaja straha bila odvojena samo 7 ili 24 sata, te kod onih kod kojih je ACC bio inaktiviran 24 sata nakon oba prvo i drugo kontekstualno učenje straha. Štoviše, nije ga bilo kod štakora koji su iskusili istraživanje prvog konteksta u odsutnosti bilo kakvih US-ova (skupina Kontekst-CtxB) (Slika 4D i 4E).

Kritično, deaktivacija ACC-a izvedena 1 sat nakon učenja također je utjecala na nedavno pamćenje straha (Slika 4F i 4G). U ovoj vremenskoj točki, primjena anizomicina smanjila je smrzavanje na CtxB kod životinja koje su iskusile prethodno kontekstualno učenje straha (Slika 4H i 4I). Ovi podaci podupiru ideju da, nakon što se prvi događaj straha zapamti, neokorteks odmah postaje neophodan za nova sjećanja, koristeći samo mehanizme sinaptičke konsolidacije.

Prethodno kontekstualno učenje straha reorganizira ACC-to-BLA projekcije tako da podržavaju nedavna sjećanja

Zatim smo ispitali može li neuronska povezanost koja se regrutira tijekom daljinskog zadržavanja pamćenja kod naivnih životinja također sudjelovati u nedavnom zadržavanju pamćenja kod životinja koje su prethodno naučile drugo kontekstualno sjećanje na strah. U tu svrhu, istražili smo uključenost projekcija od ACC do BLA u zadržavanju nedavnih i udaljenih kontekstualnih sjećanja.

Prethodno istraživanje pokazalo je da je optogenetska inhibicija terminala aksona projiciranih iz prefrontalnog korteksa u BLA oslabila kontekstualno zadržavanje sjećanja na strah u udaljenim, ali ne i nedavnim vremenskim točkama u naivnih životinja [7]. Adeno-povezani virusni vektor (AAV5-CaMKIIa-eNpHR3.0-mCherry) ili kontrolni vektor (AAV5-CaMKIIa-mCherry) ubrizgani su u ACC u 2 skupine, kao u gore opisani eksperimenti (slike 5A–5C i S3C). Optogenetička inhibicija ACC terminala u BLA tijekom nedavnog kontekstualnog zadržavanja sjećanja na strah oslabila je zamrzavanje na CtxB samo kod životinja kojima je ubrizgan eNpHR3.0-mCherry vektor i koje su prethodno naučile jasnu povezanost konteksta i SAD-a (Slika 5D ).

U ovoj skupini, naknadna inhibicija ACC terminala u BLA također je uzrokovala značajno smanjenje zamrzavanja do CtxA, što sugerira da je također utjecalo na zadržavanje povezanosti udaljenog konteksta i SAD-a (Slika 5E). Ovi rezultati podržavaju ideju da je isti neuralni put bitan za zadržavanje udaljenog sjećanja na prvi događaj straha i nedavna sjećanja na nove slične događaje. Ovi podaci također sugeriraju da je preuređenje kortikalnih putova koji se spuštaju do BLA, izazvano prvim sjećanjem, uobičajen proces i za slušna i za kontekstualna sjećanja na strah.

Nakon prethodnog učenja o strahu, i dorzalni hipokampus i ACC neophodni su za formiranje novih sjećanja

Ovi nalazi postavljaju pitanje stvara li hipokampus nova sjećanja čak i ako se prethodno dogodilo kontekstualno učenje straha. Alternativno, korteks bi mogao formirati nova sjećanja, čak i u odsutnosti hipokampusa. Kako bismo odgovorili na ova pitanja, deaktivirali smo hipokampus 1 sat nakon kontekstualnog učenja straha u 2 skupine slično gornjim eksperimentima.

Budući da većina literature o konsolidaciji sustava dolazi iz studija u kojima je hipokampus bio trajno uništen, započeli smo s nepovratnom lezijom dorzalnog hipokampusa 1 sat nakon učenja (Slika 6A-6C). Lezije hipokampusa uzrokovale su značajno smanjenje smrzavanja do CtxB u obje skupine (Slika 6C). Budući da ekscitotoksične lezije mogu prolazno utjecati na aktivnost moždanih regija izvan hipokampusa, kao što je ACC, ponovili smo ovaj eksperiment inaktivacijom dorzalnog hipokampusa s CNQX kako bismo blokirali lokalne AMPA glutamatne receptore i pronašli amnezičke učinke u obje skupine (Slika 6D i 6E). ).

Ovi rezultati su pokazali da je hipokampus neophodan za formiranje novih kontekstualnih sjećanja, bez obzira je li se prethodno dogodilo učenje straha. Zajedno s gornjim rezultatima, ovi podaci također pokazuju da su kod životinja koje su naučile prethodni kontekstualni događaj straha i hipokampus i ACC neophodni za formiranje nedavnih sjećanja na strah, a niti jedno od ovih mjesta samo po sebi ne može podržati formiranje pamćenja u odsutnosti drugoga.

Zatim smo istražili vremenski tijek zahvaćenosti hipokampusa odgađanjem lezije hipokampusa na 1 tjedan nakon učenja. U skladu s prethodnim otkrićima [46], lezije hipokampusa još uvijek utječu na formiranje pamćenja kod životinja koje nikada prije nisu naučile druge asocijacije straha. Nasuprot tome, u skupini koja je naučila prethodni događaj straha, lezije hipokampusa nisu utjecale na zadržavanje pamćenja (Slika 6F i 6G), što sugerira da prethodno sjećanje na strah skraćuje vremenski okvir uključenosti hipokampusa (od 2 tjedna do 1 tjedan), jer također promatrano za prostorno učenje [3,20,21].

Rasprava

U ovoj studiji otkrili smo da prethodna sistemska konsolidacija slušnog sjećanja na strah omogućuje Te2 da odmah kodira novo slušno sjećanje na strah putem sinaptičke konsolidacije. Štoviše, silazne projekcije od Te2 do BLA koje su se aktivirale tijekom konsolidacije prethodnog učenja postaju neophodne u formiranju novih slušnih sjećanja na strah.

Slični rezultati primijećeni su kod kontekstualnog učenja straha ovisnog o hipokampusu. U posljednjem smo zadatku također otkrili da prethodno učenje skraćuje trajanje uključenosti hipokampusa u nedavno kontekstualno učenje straha. Uzevši zajedno, naša otkrića sugeriraju da prethodno učenje reorganizira moždane krugove tako da se nove analogne informacije odmah nauče u kortikalnim strukturama.

Trenutačni koncept konsolidacije sustava sjećanja ovisnih o hipokampusu pretpostavlja da je hipokampus uključen na vremenski ograničen način i da se popratni postupni proces reorganizacije moždanih krugova događa tijekom vremena tako da kortikalne mreže postaju sve važnije [1-5].

Iako postoje i alternativne teorije [47], brojne studije podupiru vremenski ograničenu ulogu hipokampusa u procesima pamćenja u ljudskim i životinjskim modelima [1-3]. Naprotiv, reorganizacija moždanih sklopova koji podržavaju pamćenje tijekom vremena prikazana je uglavnom na životinjskim modelima, dok su dokazi kod ljudi kontroverzniji [3].

Neke su studije pokazale da se aktivnost hipokampusa tijekom vraćanja pamćenja kod ljudi progresivno smanjuje tijekom tjedana i mjeseci, dok se aktivnost u ventralnoj medijalnoj prefrontalnoj regiji [48], u temporalnom neokorteksu [49] ili povezanost među kortikalnim područjima [48] značajno povećala. Naprotiv, novije studije su pokazale da iako je hipokampalna aktivnost opadala kako je vrijeme prolazilo, kortikalna aktivnost je ostala stabilna tijekom vremena [50] ili se također smanjila [51]. Dosljedniji dokazi o reorganizaciji moždanih sklopova koji podupiru pamćenje tijekom vremena dobiveni su na životinjama [1-3]. Ova su istraživanja provedena na eksperimentalno naivnim životinjama.

Istražujući ovaj problem kod životinja koje su formirale prethodno sjećanje na strah, otkrili smo da je hipokampus neophodan za formiranje novih sjećanja, bez obzira na to je li se dogodilo prethodno učenje straha. Međutim, reorganizacija moždanih krugova potaknuta prvim učenjem omogućuje neokorteksu da odmah kodira nova sjećanja, jednostavno kroz stanične mehanizme sinaptičke konsolidacije. Ovaj se fenomen odnosi i na sjećanja straha koja ovise o hipokampusu i na njega neovisna, a posebno je induciran sporom konsolidacijom sustava izazvanom početnim događajem učenja.

Nije ga bilo kod štakora gdje su 2 pokusa učenja bila vremenski blizu jedno drugom (nekoliko sati ili 1 dan) i kod onih gdje je kortikalna inaktivacija nakon prvog događaja učenja onemogućila preuređenje korteksa i njegovo kasnije uključivanje u brzu asimilaciju novih sjećanja. Štoviše, nakon što je prvo učenje o strahu reorganiziralo moždanu povezanost, putovi koji se spuštaju od korteksa do BLA nisu potrebni samo za zadržavanje udaljenih sjećanja kao kod naivnih štakora, već i za nedavna. Zaključujemo da ako je analogno sjećanje prethodno bilo kodirano, reorganizacija moždanih krugova se već dogodila i možda više nije potrebna za formiranje novih sjećanja, koja obrnuto odmah uključuju korteks i njegovo međudjelovanje s subkortikalnim mjestima.

Unatoč velikom broju studija koje pokazuju vremenski ovisnu reorganizaciju moždanih krugova u naivnih životinja, točna svrha ovog procesa je daleko od definirane. Budući da reakcije ponašanja povezane s pamćenjem mogu ostati slične tijekom vremena, smatra se da ovaj proces služi za poboljšanje stabilnosti pamćenja tijekom vremena [1,2,52]. Na temelju naših otkrića, predlažemo da, kada se događaj straha dogodi prvi put, moždani krugovi prolaze kroz produljeni proces reorganizacije, kao što je opisano u modelu konsolidacije sustava. Ovaj proces može poslužiti za preuređivanje neuronskih mreža koje trajno pohranjuju sjećanje na strah tako da mogu odmah dobiti nove analogne informacije kroz mehanizme sinaptičke konsolidacije. Doista, ovaj operativni mehanizam može novo učenje učiniti "ekonomičnijim", jer može smanjiti utrošak resursa za stjecanje novih povezanih informacija, oslobađajući tako više resursa za učenje novih, nepovezanih informacija.

Važno pitanje koje proizlazi iz naših otkrića jest mijenja li prethodno učenje trajno neuronske mreže tako da se slična iskustva mogu odmah pohraniti u neokortiksu, čak i ako se dogode u vrlo udaljenim vremenskim intervalima. Alternativno, moglo bi se dogoditi da se sustav vrati na početnu razinu naivnih životinja ako se uskoro ne dogode nova slična iskustva. Eksperimenti koji procjenjuju uključenost neokorteksa u sve većim vremenskim intervalima između prvog i drugog učenja razjasnit će ovu točku.

Također smo otkrili da je blokada neokorteksa tijekom rane konsolidacije prvog iskustva spriječila neposrednu dodjelu novih sličnih iskustava neokorteksu (vidi slike 1F i 4D). Ovi rezultati sugeriraju da su stanični procesi koji se odvijaju odmah nakon prvog učenja unutar neokorteksa neophodni za njegovo uključivanje u proces konsolidacije memorije sustava. Ova ideja je u skladu s otkrićima da se neke "označene" stanice aktiviraju unutar neokorteksa nakon učenja kod naivnih životinja i služe za pohranu udaljenih, ali ne i nedavnih sjećanja [7,8,12,44]. Potrebne su buduće studije kako bi se razjasnilo igraju li te stanice ovu ulogu i nakon prethodnog učenja ili sudjeluju iu formiranju nedavnih sjećanja.

Izvorno, model konsolidacije sustava doveo je do dodatne ideje da hipokampus brzo uči nove informacije dok ih neokorteks uči sporo, ali kasnije studije su pokazale da je neokorteks sposoban i za brze procese učenja [3,20,21,53]. Naši su podaci pokazali da 2 različita korteksa (Te2 i ACC) mogu odmah naučiti nove informacije ako se analogni događaj prethodno dogodio.

Prema našim prethodnim studijama [10,16,17,34,43,45], koristimo pojam Te2 za označavanje najstražnje regije slušnog područja pojasa koja, na temelju Zillesovih studija [24,25], uključuje uglavnom vremenska asocijacija i ektorinalna područja. Iako ne možemo isključiti da naši rezultati mogu odražavati doprinose učinaka lijeka iu okolnim regijama, točnije u susjednom vizualnom korteksu, primarnom slušnom korteksu i peririnalnom korteksu, podaci koje smo dobili kod naivnih životinja sugeriraju da su primarno bili posljedica inaktivacije Te .

Otkrili smo da je kod naivnih životinja Te2 bio neophodan za udaljena, ali ne i nedavna slušna sjećanja, dok je inaktivacija susjednog vidnog korteksa ostavila udaljena slušna sjećanja nepromijenjena [10]. Nasuprot tome, kombinirana blokada primarnog i Te2 korteksa također je oslabila nedavno pamćenje [34]. Slično, inaktivacija prednjeg peririnalnog korteksa oslabila je sjećanja na strah [32,54], dok inaktivacija stražnjeg peririnalnog korteksa nije utjecala na nedavna [54] i udaljena [10] sjećanja na strah.

Također u slučaju ACC i kontekstualnih sjećanja na strah, inaktivacija susjednog primarnog i sekundarnog motoričkog korteksa nije utjecala na nedavna i udaljena sjećanja [55], dok je inaktivacija susjednog prelimbičkog korteksa oštetila i nedavna i udaljena sjećanja [11].

Što se tiče uloge koju ove kore igraju u procesima pamćenja, Te2 sudjeluje u memoriranju emocionalne vrijednosti uparene sa zvukovima [10,13,16,56]. Ova je ideja nedavno demonstrirana iu vizualnom korteksu višeg reda [57,58]. S druge strane, ACC može formirati i pohranjivati ​​sjećanja, ali također može modulirati aktivnost drugih kortikalnih područja [1-3,6].

Unatoč velikom broju studija koje pokazuju da su Te2 i ACC nužni za udaljena, ali ne i nedavna sjećanja, neke nedavne studije su izvijestile da ti kortiksi mogu biti također potrebni za zadržavanje nedavnih slušnih [34,59] i kontekstualnih [55] sjećanja na strah. Precizni granični uvjeti koji mogu odrediti nužnost ovih korteksa za nedavna sjećanja su slabo poznati.

Jedna od tih studija sugerira da bi intenzitet emocionalnog iskustva mogao igrati važnu ulogu [34], ali buduće studije trebale bi se bolje pozabaviti ovim pitanjem. Buduće studije također će trebati razjasniti igraju li stanice koje se aktiviraju unutar neokorteksa nakon učenja kod naivnih životinja i koje služe za pohranu udaljenih, ali ne i nedavnih sjećanja [7,8,12,44], ovu ulogu nakon prethodnog učenja ili sudjeluju li u formiranju nedavnih sjećanja.

Što se tiče sudjelovanja hipokampusa u procesima pamćenja, ovdje smo otkrili da je dorzalni hipokampus neophodan za učenje novog kontekstualnog pamćenja čak i ako se prethodno kontekstualno učenje dogodilo. Sličan rezultat primijećen je izvođenjem unutarsubjektnog dizajna na štakorima koji su naučili i udaljena i nedavna kontekstualna sjećanja [60]. S druge strane, također je pokazano da se stanični mehanizmi koji posreduju naknadno učenje u hipokampusu mogu razlikovati od onih uključenih tijekom prethodnog ispitivanja učenja [22,61].

Također smo otkrili da je kod životinja koje su prvi put doživjele kontekstualni strah hipokampus neophodan i 1 tjedan nakon učenja, u skladu s prethodnim nalazima kod naivnih životinja [46]. Nasuprot tome, u drugoj skupini, lezije hipokampusa nisu utjecale na zadržavanje pamćenja u ovom vremenskom intervalu, što sugerira da prethodno učenje o strahu skraćuje vremenski prozor uključenosti hipokampusa, kao što je također primijećeno za prostorno učenje [3,20,21]. Te studije i ova sadašnja stoga pružaju konvergentne dokaze da vremenski prozor temporalne amnezije izazvan lezijama hipokampusa ovisi o prethodnim naučenim iskustvima u prostornim i emocionalnim sjećanjima.

U tim studijama, autori su također predložili da treniranje štakora kroz dulje vrijeme u prostornom zadatku proizvodi "mentalnu" shemu znanja, gdje se nove povezane informacije mogu brzo asimilirati [3,20,21,53]. Iako naši nalazi također mogu biti u skladu s ovom idejom, vrlo je teško reći može li jedan pokušaj učenja straha formirati asocijativnu "shemu" znanja i može li se novi i drugačiji događaj koji se događa u drugom okruženju integrirati unutar te sheme . Potrebne su daljnje studije kako bi se razjasnio ovaj problem. U svakom slučaju, s obzirom na to da je većina sjećanja kod ljudi i drugih životinja izgrađena na prošlim iskustvima, moždane mreže koje po prvi put pohranjuju udaljena sjećanja na strah mogu biti one koje kodiraju nedavna i udaljena sjećanja na strah tijekom života.

Metode Eksperimentalni model i detalji subjekta

Životinje

Zdravi mužjaci Wistar štakora (dob, 65 do 70 dana; težina, 250 do 350 g, divlji tip), dobiveni iz internog uzgoja životinja, držani su po 3 po kavezu s hranom i vodom dostupnim ad libitum, pod svjetlom od 12 sati /tamni ciklus (svjetla se pale u 7:00 ujutro) na konstantnoj temperaturi od 22 ± 1˚C. Sve pokuse odobrilo je talijansko Ministarstvo zdravlja (autorizacija br. 408/2020-PR) i lokalno bioetičko povjerenstvo Sveučilišta u Torinu.

Eksperimentalni dizajn

Reproducibilnost podataka procijenjena je različitim ponavljanjima (tablica S1). Prvi eksperimenti inaktivacije CNQX u Te2 (Slika 1A-1C) izvedeni su u većem broju ponavljanja jer su to bili prvi eksperimenti koje smo proveli i služili su za testiranje glavne hipoteze naše studije. Životinje su a priori raspoređene u različite bihevioralne skupine na način uravnotežene težine.

Muške životinje iz istog legla nasumično su raspoređene u svaku pokusnu skupinu. Prvo smo se pozabavili glavnom hipotezom naše studije, tj. kortikalna inaktivacija može različito utjecati na konsolidaciju novog sjećanja na strah kod eksperimentalno naivnih štakora i kod životinja koje su naučile prethodni događaj straha. U slučaju statističkih razlika između tih skupina, na kraju smo izveli dodatne kontrolne skupine putem injekcije fiziološke otopine. Sličan pristup primijenjen je na optogenetske eksperimente, gdje je AAV-kontrolna skupina izvedena tek nakon što su otkrivene statističke razlike između naivnih i prethodno treniranih štakora. Ovi rasporedi pokusa omogućili su nam da izbjegnemo nepotrebne kontrolne skupine i korištenje nepotrebnih životinja, što je ključno pitanje u europskom i talijanskom zakonodavstvu o pokusima na životinjama (načelo 3 Rs).

Postupci ponašanja

Svi eksperimenti su provedeni tijekom svijetle faze dana (od 8 do 16 sati). Životinje su pojedinačno transportirane iz objekta u pokusne prostorije u različitim malim prozirnim kantama, ovisno o zahtjevima pokusa.

Slušni trening: Prva sesija ponašanja.

Životinje uvjetovane slušnim strahom (CS1-CS2). U ovoj skupini štakori su nježno izvađeni iz kućnog kaveza i odneseni iz prostorije za smještaj u zvučno izoliranu prostoriju. Kad su tamo, životinje su stavljene u uređaj za kondicioniranje koji se sastoji od pravokutnog crnog kaveza (35 × 40 cm) opremljenog rešetkom od nehrđajućeg čelika (promjera 1 cm, razmaknute 1,5 cm) povezanog s elektrošokom postaviti. Štakori su ostavljeni neometani 1 minutu. Nakon tog vremena, primijenjeno je 7 uvjetovanih podražaja (CSs) koji se sastoje od čistog tona od 15 kHz frekvencije (15 s trajanja svaki, 80 dB, 36 s probni interval). Posljednja 1 s svakog tona bila je uparena s bolnim UZ (0,5 mA, 1 s). Na kraju sesije kondicioniranja štakori su vraćeni u svoj kućni kavez.

Životinje samo za šok (šok-CS2). U ovoj skupini, štakori su na sličan način smješteni unutar istog uređaja za kondicioniranje. Neposredno nakon toga, svaki je štakor bio podvrgnut 7-šokovima stopala (1 s, 0.5 mA) jedan odmah nakon drugog. Na kraju stimulacije, životinje su vraćene u svoj kućni kavez. Vremenska trajnost u kondicionom kavezu bila je manja od 9 sekundi. Prethodne studije pokazale su da ovaj postupak omogućuje izbjegavanje asocijativnih procesa između bolnih podražaja i osjetilnih podražaja [29,30].

Životinje uvjetovane strahom od mirisa (odour-CS2). U ovoj skupini štakori su stavljeni unutar istog pravokutnog crnog kaveza koji je korišten u gornjim eksperimentalnim skupinama i spojeni na postavku za isporuku šoka. Štakori su ostavljeni neometani 2 minute. Nakon tog vremena, primijenjeno je 7 CS-ova koji su se sastojali od mirisa vanilije (10 s trajanja svaki, 24 s probni interval). Posljednja 1 s svakog mirisa bila je uparena s bolnim ultrazvukom (0,5 mA, 1 s). Modul za kondicioniranje postavljen je blizu izvora ventilacije kako bi se izbjegla postojanost isporučenih podražaja nakon njihovog pomaka. Kavez je bio osiguran gornjom rešetkom. Mirisi su predstavljeni pomoću olfaktometra za razrjeđivanje protoka. Čisti zrak (1,5 L/min) usmjeren je na solenoidni ventil, koji je, kada je radio, propuštao zrak u bocu od 15 ml koja je sadržavala 10 ml mirisa vanilije.

Životinje koje imaju samo ton (Tone-CS2). Štakori u ovoj skupini stavljeni su u isti crni kavez i prikazan im je 15-kHz ton (7 podražaja, 15 s trajanja, 36 s ITI) isporučen u odsutnosti SAD-a.

Prethodno izložene životinje (Tone-CS1-CS2). Štakori su stavljeni u kavez za kondicioniranje i, 1 minutu kasnije, predstavljen im je 20 puta sam ton 15-kHz, a 24 sata kasnije isti ton je uparen sa US-om koji je postao CS1.

Životinje uvjetovane strahom od bijelog šuma (WN-CS2). U ovoj skupini štakori su stavljeni u pravokutni crni kavez i ostavljeni neometani 1 minutu. Nakon tog vremena, primijenjeno je 7 CS-ova koji se sastoje od WN-a (15 s trajanja svaki, 75 dB, 36 s interval među pokusima). Posljednja 1 s svakog tona bila je uparena s bolnim UZ (0,5 mA, 1 s). Na kraju sesije kondicioniranja štakori su vraćeni u svoj kućni kavez.

Auditivno učenje straha: Drugi trening ponašanja.

Dva tjedna nakon postupaka opisanih u gornjem paragrafu, životinje su trenirane u drugom drugom zadatku slušnog uvjetovanja straha. Štakori su stavljeni u standardnu ​​kutiju za skinner, kao u našem prethodnom radu [10], i ostavljeni neometani 2 minute. Nakon tog vremena isporučeno je 7 CS-ova koji se sastoje od čistih tonova frekvencije 3 kHz (svaki 8 s trajanja, 80 dB, 22 s međuprobni interval). Posljednja 1 s svakog tona bila je uparena s bolnim UZ (0,5 mA, 1 s). Na kraju sesije kondicioniranja štakori su vraćeni u svoj kućni kavez.

Strah od zadržavanja pamćenja. Zadržavanje slušnog pamćenja straha nedavno stečeno na CS2 (3 kHz) testirano je 4 dana kasnije. Za optogenetičke pokuse, test nedavnog pamćenja proveden je isporukom lasera 24 h nakon CS2-US učenja analogno vremenskom intervalu u kojem smo izvršili kortikalnu inaktivaciju primjenom CNQX-a (tj. 24 h nakon trening). Štakori su naviknuti na aparat koji se razlikuje od onog koji se koristi za kondicioniranje i smješteni su u drugu prostoriju kako bi se izbjeglo uvjetovano ponašanje straha prema kontekstualnim znakovima [10,62]. Novi uređaj sastojao se od prozirnog plastičnog kaveza s crno obojenom stranom zatvorenog unutar kutije za prigušivanje zvuka opremljene ispušnim ventilatorom, koji je eliminirao mirisni zrak iz kućišta i stvarao pozadinsku buku od 60 dB. Životinjama je dopušteno istraživati ​​kavez 5 minuta dnevno tijekom sesije navikavanja. Na dan testa zadržavanja pamćenja straha, nakon 2 minute slobodnog istraživanja, isporučili smo 4 CS2 od 3 kHz (8 s—22 ITI) nakon kojih nije uslijedio nijedan US.

Ako je to zahtijevao eksperimentalni zahtjev, štakori su zatim testirani na zadržavanje daljinskog pamćenja straha, stečenog 2 tjedna prije drugog pokusa slušnog uvjetovanja straha. U tu svrhu, 7 dana nakon testa zadržavanja pamćenja straha na ton 3-kHz, životinje su stavljene u novi okoliš (crno-bijeli prugasti kavez), a zatim im je predstavljen ton 15-kHz. Predstavljena su četiri tona u intervalima od 36 s.

Kontekstualni trening: Prva sesija ponašanja.

Skupina uvjetovanja kontekstualnog straha (CtxA-CtxB). U ovoj skupini, štakori su nježno izvađeni iz kućnog kaveza, stavljeni u kantu i preneseni iz prostorije za smještaj u zvučno izoliranu prostoriju. Kad su tamo, životinje su stavljene u uređaj za kondicioniranje koji se sastoji od gore spomenutog pravokutnog crnog kaveza, opremljenog rešetkom od nehrđajućeg čelika spojenom na postavu za isporuku šoka. Štakori su ostavljeni neometani 1 minutu. Nakon tog vremena, primijenjeno je 5 US (0,5 mA, 1 s) u vremenskim intervalima od 51 s. Na kraju seanse, životinje su vraćene u njihov kućni kavez.

Skupina samo za šok (shock-CtxB). Štakori, nakon što su stavljeni u uređaj za kondicioniranje, odmah su primili 5-šokove stopala (1 s, 0.5 mA) odmah jedan za drugim. Vremenska trajnost u kondicionom kavezu bila je manja od 7 sekundi. Prethodne studije pokazale su da ovaj postupak omogućuje izbjegavanje asocijativnih procesa između bolnih podražaja i osjetilnih podražaja [29,30].

Životinje samo u kontekstu (kontekst-CtxB). Štakori su stavljeni u isti crni kavez korišten u gornjim eksperimentima na 5 minuta bez isporuke bilo kakvog US.

Novo kontekstualno uvjetovanje straha i nedavno zadržavanje sjećanja na strah. Dva tjedna nakon postupaka opisanih u gornjem odlomku, sve su grupe obučene da povežu novo kontekstualno okruženje (modul skinner box-a, smješten u drugoj prostoriji) s bolnim ultrazvukom (0,5 mA, 1 s) . Svaka životinja je stavljena u novu komoru i ostavljena neometana 2 minute. Zatim je bio izložen 5 US odvojenim intervalima od 30 s.

Zadržavanje kontekstualnog pamćenja straha testirano je 4 dana nakon postupka kondicioniranja straha ponovnim stavljanjem štakora u komoru Skinner box-a na 3 minute. Za optogenetičke pokuse, test nedavnog pamćenja proveden je isporukom lasera 24 sata nakon CtxB-US učenja u analogiji s vremenskim intervalom u kojem smo izvršili kortikalnu inaktivaciju primjenom CNQX-a (tj. 24 sata nakon treninga). Ako je to zahtijevao eksperimentalni zahtjev, štakori su zatim testirani na zadržavanje daljinskog pamćenja straha stavljanjem životinja u kontekst uparen sa SAD-om 2 tjedna prije nove povezanosti.

Životinje su nošene u 2 različite kante u komore za kondicioniranje prema različitim kontekstualnim postupcima.

Mjera zamrzavanja. U svim eksperimentalnim postupcima procjena zadržavanja sjećanja na strah određivana je kao odgovor na smrzavanje [10], analiziran kao potpuni izostanak somatske pokretljivosti osim respiratornih pokreta. Za svaku životinju, vrijeme (u sekundama) provedeno u smrzavanju izmjereno je offline od strane 2 neovisna promatrača koji su bili slijepi za skupine životinja.

For more information:1950477648nn@gmail.com