Dio 2: Verbascoside štiti stanice gušterače od ER-stresa
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 i Carla Perego 1,*
Kliknite ovdje natrag na 1. dio
3.4 Verbaskozid modulira aktivnost i dinamiku mitohondrija stanica
Testovi održivosti MTT ukazuju na mogući utjecajverbaskozidizravno na mitohondrije što osigurava spregu izlučivanja inzulina sa stanjem uhranjenosti i preživljavanjem stanice u ovoj vrsti stanice. Oblik i membranski potencijal markeri su zdravlja mitohondrija [42]. Prvo smo procijenili potencijal mitohondrijske membrane označavanjem stanica s MitoSpyw Orange CMTMRos, propusnom bojom čija koncentracija ovisi o potencijalu unutarnje mitohondrijske membrane, dok je MitoSpyw Green FM korišten za normalizaciju podataka na mitohondrijsku masu (Slika 4A, B). Membranski potencijal mitohondrija uverbaskozid-tretiranih stanica povećao se u usporedbi s kontrolom u bazalnim i stresnim uvjetima. Zanimljivo,verbaskozidmetaboliti su imali različite učinke. Kafena kiselina nije poboljšala mitohondrijski potencijal, dok je hidroksitirozol izazvao oštećenje mitohondrijske funkcije ovisno o dozi, u skladu s podacima o vitalnosti stanica, takav je učinak bio očitiji nakon izlaganja H2O2 (Slika S3).
Budući da je funkcija strogo povezana s morfologijom, izmjerili smo Feretov promjer, površinu i cirkularnost mitohondrija. Akutni oksidativni stres potiče opsežnu fisiju mitohondrija, što rezultira manjim, kružnim mitohondrijima [42]. Pod uvjetima H2O2 stresa, mitohondriji stanica tretiranih verbaskozidom bili su izduženiji i pokazali su povećanu površinu od kontrolnih (Slika 4C, D i Slika S4). Mitohondrijska cirkularnost bila je niža u stanicama tretiranim verbaskozidom nego u kontrolama, a razlike su bile očitije u stanicama tretiranim H2O2 (Slika S3), ponovno potvrđujući zaštitnu ulogu polifenola.
Sposobnost ovih organela da modificiraju svoj oblik kao odgovor na prehrambena stanja ili stresne uvjete pod kontrolom je događaja fuzije i fisije i zahtijeva pokretljivost mitohondrija [39]. Praćenje kretanja mitohondrija navelo nas je da izračunamo kumulativnu prijeđenu udaljenost, a analiza je otkrila značajno povećanje dinamike mitohondrija u stanicama tretiranim verbaskozidom u usporedbi s kontrolom, već u bazalnim uvjetima (Slika 4E, F i video zapisi S1–S4). Učinak je bio izraženiji nakon tretmana s H2O2, štoviše, predtretman verbaskozidom gotovo je u potpunosti poništio utjecaj oksidativnog stresa na dinamiku mitohondrija.
Uzeti zajedno, ovi podaci snažno podupiru ključnu ulogu verbaskozida u osiguravanju dinamike mitohondrija što je ključno za promicanje brze prilagodbe ove organele uvjetima stresa.
3.5 Utjecaj verbaskozida na ljudsko preživljavanje i funkcioniranje Langerhansa
S obzirom na prevoditeljski potencijalverbaskozidprimjene u ljudskom zdravlju, potvrdili smo njegov utjecaj na ljudske izolirane Langerhansove otočiće, relevantniji model za fiziopatološka i farmakološka istraživanja na -stanicama. Izolirani otočići tretirani su s 16 uM verbaskozida tijekom 5 dana i procijenjen je potencijal mitohondrijske membrane. Kao što je prikazano na slici 5A, dok je potencijal organela bio ugrožen u kontrolnim ljudskim otočićima nakon izlaganja H2O2, potencijal unutarnje membrane mitohondrija u otočićima prethodno tretiranim verbaskozidom nije se značajno smanjio, podupirući hipotezu o zaštitnoj ulozi verbaskozida protiv ROS-induciranih - disfunkcija stanica. Analiza ekspresije markera ER-stresa pokazala je značajno smanjenje frakcije P-eIF2 u dva različita pripravka otočića koji su održavani u 16 uM verbaskozida, potvrđujući smanjenu regulaciju ovog puta iu ljudskim uzorcima (Slika 5D). Korisni učinci liječenja polifenolima potkrijepljeni su povećanim sadržajem inzulina opaženim u otočićima tretiranim verbaskozidom u usporedbi s kontrolama (Slika 5B). Disperzija podataka u našim eksperimentima nije omogućila da se pokaže bilo kakva značajna razlika u izlučivanju inzulina stimuliranom glukozom (GSIS) u otočićima tretiranim verbaskozidom, iako se pozitivan trend čini očitim i pod bazalnim i pod uvjetima stresa (Slika 5C).
4. Rasprava
Oksidativni stres i upala osnova su stanične disfunkcije koja se javlja tijekom T2D [43,44] kao takva, funkcionalna hrana, nutraceutici i fitokemikalije su istraživani kao alati za prevenciju dijabetesa tipa 2 [45]. U ovom smo se radu usredotočili na verbaskozid, za koji je poznato da djeluje protuupalno i antioksidativno u neuronima [18]. Unatoč visokoj strukturnoj složenosti, verbaskozid i izoverbaskozid pronađeni su u krvnoj plazmi štakora hranjenih ekstraktom Lippia citriodora zajedno s nekim metabolitima [20]. Osim toga, stanično nakupljanje verbaskozida i verbaskozida otkriveno je u staničnoj liniji raka dojke SKBR3 [23], a studije provedene na Caco-2 stanicama pokazuju da umjerene količine verbaskozida i izoverbaskozida ostaju netaknute i biodostupne nakon in vitro probave postupak. Nadalje, Caco-2 može preuzeti obje molekule brzim i linearnim transportom u rasponu od 10 do 100 uM [22]. Nema podataka o bioraspoloživosti verbaskozida kod ljudi, ali gore spomenute studije sugeriraju da bi moglo biti izvedivo da nemetabolizirani verbaskozid prijeđe crijevnu barijeru, cirkulira u krvnoj plazmi i ima antioksidativne učinke na endokrine stanice gušterača.
Pronašli smo o dozi ovisnu (0.8–16 uM) zaštitnu ulogu verbaskozida na klonske i ljudske stanice, kako u bazalnim tako iu uvjetima stresa. Taj je učinak posljedica samog verbaskozida, a ne njegovih metabolita kofeinske kiseline i hidroksitirozola, koji se zapravo čine citotoksičnim pri koncentraciji od 16 uM. Koncentracije dokazane aktivne u našim pokusima u skladu su s onima opisanim kod životinja hranjenih verbaskozidom [20].
Iako ne znamo djeluje li verbaskozid izvanstanično vežući se na membranski receptor ili se internalizira endocitozom i djeluje unutarstanično, naši podaci potvrđuju da verbaskozid ima antioksidativna i protuupalna svojstva te štiti stanice od disfunkcija povezanih s ER-stresom smanjujući UPR i promicanje mitohondrijske dinamike.
Uistinu, otkrili smo značajno smanjenje sadržaja ROS-a u stanicama tretiranim verbaskozidom, što je dodatno potvrđeno smanjenjem lipidne peroksidacije mjereno putem ekspresije HNE i akroleina. Za razliku od većine biljnih polifenola, aktivnost verbaskozida za uklanjanje ROS-a uglavnom slijedi neizravne (putem regulacije enzima koji uklanjaju ROS), a ne izravne putove. Zapravo, povećava transkripciju gena nekih antioksidativnih enzima putem aktivacije puta Nrf2 (NF-E2-povezani faktor 2) i putem mehanizma ovisnog o AhR (aril ugljikovodikovom receptoru) [24,29]. Kao takvi, pronašli smo povećanu ekspresiju SOD1 u stanicama tretiranim verbaskozidom.
Homeostaza ROS-a iznimno je važna u patologiji stanica. Zbog nedostatka antioksidativnih enzima, povećana proizvodnja ROS ne može se neutralizirati i inducira se ER stres koji potiče pogrešno savijanje proteina. ER stres dovodi do smanjenja transkripcije i translacije inzulina kroz aktivaciju UPR [44,46]. Ovaj put ima glavnu svrhu oporavka ER funkcije kroz reprogramiranje ekspresije gena, međutim, kada je prekomjerno stimuliran, pokreće apoptozu. Naši podaci sugeriraju da je važno djelovanje verbaskozida ublažavanje UPR-a, dopuštajući modifikacije potrebne za popravak disfunkcije ER-a, bez izazivanja apoptoze. Prema ovoj mogućnosti, ekspresija BIP, HSP70 i PERK proteina smanjena je u stanicama tretiranim verbaskozidom, a aktivacija PERK puta je oslabljena kao odgovor na ER stres izazvan tunikamicinom. Slično djelovanje zabilježeno je za tirozol u staničnoj liniji insulinoma NIT-1 [47].
Osobito je zanimljiva sposobnost verbaskozida da modulira aktivaciju PERK grane UPR-a. U -stanicama ovaj je put potreban za održavanje bazalne sekretorne homeostaze i preživljavanje -stanica, a kod dijabetesa je ozbiljno dereguliran [41,48]. Što je još intrigantnije, uobičajene varijante PERK-a doprinose riziku od predijabetesa, a recesivne mutacije u genu EIF2AK3 (koji kodira PERK) u osnovi su osjetljivosti na Wolcott–Rallisonov sindrom karakteriziran trajnim neonatalnim dijabetesom ovisnim o inzulinu [49,50].
Smanjena regulacija IKB -NFKB upalnog puta također je otkrivena u našem sustavu u prisutnosti verbaskozida. NFKB predstavlja glavni upalni put u -stanicama i njegova kontinuirana aktivacija pokreće kaskadu događaja koji kulminiraju smrću -stanice. U stanicama pod stresom, smanjenje ekspresije NFKB štiti stanice gušterače od dijabetogenih agenasa [27,51], dodatno podupirući primjenu verbaskozida u prevenciji dijabetesa. Zanimljivo je da PERK signalizacija aktivira faktore transkripcije NFR2 (uključen u redoks homeostazu) i NFKB, čime se objašnjavaju antioksidativni i protuupalni učinci verbaskozida [40,52].
Naši podaci također otkrivaju važnu ulogu verbaskozida na aktivnost i dinamiku mitohondrija.
Oznaka operativne kvalitete mitohondrija je njihova dinamika, proces karakteriziran koordiniranim ciklusima događaja fuzije i fisije koji reguliraju broj mitohondrija, distribuciju, morfologiju i membranski potencijal [39]. U skladu s ovom mogućnošću, verbaskozid poboljšava tc3 potencijal mitohondrijske membrane i pod bazalnim i stresnim uvjetima. Opet, učinak je posljedica verbaskozida, a ne njegovih metabolita, budući da kofeinska kiselina ne poboljšava funkciju mitohondrija, a hidroksitirozol značajno smanjuje potencijal organela. Povećana dinamika mitohondrija i promjene u njihovoj morfologiji uočene su praćenjem kretanja mitohondrija, što sugerira da verbaskozid potiče program mitomorfoze. Preoblikovanje stanične mitohondrijske mreže utječe na sastavljanje superkompleksa dišnog lanca, mijenjajući tako ne samo metabolizam stanice, već i njegovo redoks stanje i omogućujući stanicama da se bolje suprotstave oksidativnom stresu i upali [5,37,39].
Iako je molekularni mehanizam još uvijek nepoznat, možemo pretpostaviti da verbaskozid, kao i drugi polifenoli, štiti mitohondrijsku DNA smanjujući koncentraciju ROS [53] i sprječava otvaranje prijelaznih pora mitohondrijske propusnosti [54], osiguravajući fiziološku aktivnost mitohondrija. Još jedna intrigantna mogućnost je da je modifikacija dinamike i aktivnosti mitohondrija ponovno posredovana djelovanjem verbaskozida na UPR. Doista, nedavno istraživanje u području mitohondrija ukazuje da mjesta interakcije ER-mitohondrija igraju ključnu ulogu u kontroli dinamike i aktivnosti mitohondrija kao odgovor na oksidativni stres, a PERK je uključen u taj fenomen [55]. Većina in vitro studija s polifenolima provedena je na staničnim linijama, često tumorskog porijekla, koje se razlikuju od izvornih stanica u smislu metabolizma i proizvodnje ROS-a. Ovdje pružamo dokaze da verbaskozid ima zaštitni učinak i na ljudske izolirane Langerhansove otočiće, konačnu metu intervencije u dijabetesu. Zanimljivo je da polifenol ublažava PERK signalnu aktivaciju već u bazalnim uvjetima, povećavajući tako sadržaj inzulina i sprječavajući mitohondrijske disfunkcije posredovane oksidativnim stresom. Ostaje za razjasniti odražava li učinak polifenola na sadržaj inzulina sposobnost spoja da spriječi smrt stanica, ublaži ER stres ili izravno kontrolira ekspresiju gena inzulina, kao što je pokazano za druge polifenolne spojeve [56]. Ovi su podaci osobito relevantni s obzirom na moguću primjenu verbaskozida kao komplementarne terapije u liječenju dijabetesa.
5. Zaključci
Ovdje objavljene in vitro studije na klonskim i ljudskim stanicama pokazuju da verbaskozid ispoljava zaštitne učinke protiv disfunkcija povezanih sa ER-stresom, ublažavajući aktivaciju PERK grane UPR-a i poboljšavajući dinamiku mitohondrija. Budući da poremećaj ER homeostaze izaziva oštećenje stanica i dijabetes, ovi podaci daju opravdanje za moguću upotrebu verbaskozida kao nutraceutika u prevenciji i liječenju bolesti. Ipak, potrebno je riješiti mnoga pitanja za učinkovitu kliničku primjenu verbaskozida. Unatoč bogatstvu laboratorijskih studija, pouzdane kliničke studije koje potvrđuju zdravstvene učinke verbaskozida in vivo su ograničene. Nadalje, povećanje njegove stabilnosti i bioraspoloživosti obvezno je za buduću primjenu ovog spoja u ljudskom zdravlju. S ove točke, verbaskozid je zanimljiva molekula jer njegova skela ima različita reaktivna mjesta koja se mogu modificirati kombiniranom kemijom. Očekujemo da će informacije dobivene ovim studijama otvoriti puteve za terapeutsku modulaciju oksidativnog stresa i upale u patološkim stanjima korištenjem prirodnih spojeva.
Dopunski materijali: Sljedeći su dostupni na web stranici http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. Slika S1: Učinci kofeinske kiseline i hidroksitirozola na vitalnost stanica. Slika S2: Učinci verbaskozida na ER stres izazvan tunikamicinom. Slika S3: Učinci kofeinske kiseline i hidroksitirozola na potencijal mitohondrijske membrane. Slika S4: Kvantitativna analiza slike mitohondrija u stanicama tretiranim kofeinskom kiselinom i hidroksitirozolom. Videozapisi S1, S2: Dinamika mitohondrija snimljena u bazalnim uvjetima, u odsutnosti (S1) ili prisutnosti (S2) verbaskozida. Video S3, S4: Dinamika mitohondrija snimljena u uvjetima oksidativnog stresa, u odsutnosti (S3) ili prisutnosti (S4) verbaskozida.
Autorski doprinosi: Konceptualizacija, AG, PM i CP; čuvanje podataka, AG i PM; formalna analiza, AG i PM; prikupljanje sredstava, CP; istraga, MC; metodologija, AM i SG; resursi, FB, RR i ADG; nadzor, CP; validacija, AM, SG i MC; vizualizacija, AG i AM; pisanje—izvorni nacrt, AG; pisanje—recenzija i uređivanje, PM, AM, FB, RR, ADG, MC i CP Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.
Financiranje: Ovo istraživanje nije dobilo vanjska sredstva.
Zahvale: Željeli bismo zahvaliti Carlu Corinu i Mariu Dell'Agliju na reagensima i korisnoj raspravi.
Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.
Reference
1. Cho, NH; Shaw, JE; Karuranga, S.; Huang, Y.; da Rocha Fernandes, JD; Ohlrogge, AW; Malanda, B. IDF Atlas dijabetesa: Globalne procjene prevalencije dijabetesa za 2017. i projekcije za 2045. Diabetes Res. Clin. Vježbajte. 2018, 138, 271–281. [CrossRef]
2. Leslie, RD; Palmer, J.; Schlott, NC; Lernmark, A. Dijabetes na raskrižju: Relevantnost klasifikacije bolesti za patofiziologiju i liječenje. Diabetologia 2016, 59, 13–20. [CrossRef] [PubMed]
3. Tokarž, VL; MacDonald, PE; Klip, A. Stanična biologija sistemske funkcije inzulina. J. Cell Biol. 2018, 217, 2273–2289. [CrossRef] [PubMed]
4. Perego, C.; Da Dalt, L.; Pirillo, A.; Galli, A.; Catapano, AL; Norata, GD Metabolizam kolesterola, funkcija stanica gušterače i dijabetes. Biochim. et Biophys. Acta (BBA) Mol. Osnova Dis. 2019, 1865, 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]
5. Galli, A.; Alžir, M.; Marciani, P.; Schulte, C.; Leonardi, C.; Milani, P.; Mafoli, E.; Tedeschi, G.; Perego, C. Oblikovanje pankreasa - Diferencijacija i funkcioniranje stanica: Utjecaj mehanotransdukcije. Ćelije 2020, 9, 413. [CrossRef]
6. Ashcroft, FM; Rorsman, P. Dijabetes melitus i stanica: posljednjih deset godina. Ćelija 2012, 148, 1160–1171. [CrossRef] [PubMed]
7. Rosengren, AH; Braun, M.; Mahdi, T.; Andersson, SA; Travers, ME; Shigeto, M.; Zhang, E.; Almgren, P.; Ladenvall, C.; Axelsson, AS; et al. Smanjena egzocitoza inzulina u ljudskim stanicama gušterače s varijantama gena povezanim s dijabetesom tipa 2. Dijabetes 2012, 61, 1726–1733. [CrossRef] [PubMed]
8. Polonsky, KS Dinamika lučenja inzulina kod pretilosti i dijabetesa. Int. J. Obes. 2000, 24, S29–S31. [CrossRef]
10. Roden, M.; Shulman, GI Integrativna biologija dijabetesa tipa 2. Priroda 2019, 576, 51–60. [CrossRef]
