Cistanche: Echinacoside potiskuje rast stanica adenokarcinoma gušterače inducirajući apoptozu putem puta protein kinaze aktiviranog mitogenom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG i XINFENG LI

Sažetak.

Klinička primjena prirodnih proizvoda izvedenih iz tradicionalne kineske medicine privukla je pozornost u kemoterapiji raka.Ehinakozid(ECH), jedan od feniletanoida, izoliran iz stabljikaCistanche(kineski biljni lijek) ima zaštitne i antiapoptotičke učinke na središnji živčani sustav. Međutim, ostaje uglavnom nedokučivo posjeduje li ECH tumor-supresivno djelovanje. U ovoj je studiji pokazano da ECH može značajno inhibirati proliferaciju stanica adenokarcinoma gušterače induciranjem proizvodnje reaktivnih kisikovih vrsta i poremećaja potencijala mitohondrijske membrane i tako potaknuti apoptozu. Nadalje, razjašnjeno je da ECH(Ehinakozid)potiskuje rast tumorskih stanica putem modulacije MAPK aktivnosti. Zaključno, ova studija otkriva novu funkciju ECH (Ehinakozid) u prevenciji razvoja raka, te implicira da bi uporaba ECH mogla biti potencijalna kemoterapijska strategija za rak.

Uvod

Put supresora tumora p53 putem indukcije supresora tumora, ARF, ublažava onkogenu degradaciju p53 posredovanu dvominutnom mišjom E3-ligazom (MDM)2- (3). Ovo je autoregulirani, samozaštitni mehanizam koji sprječava malignu transformaciju stanica. Naime, p53 može potisnuti Myc aktivnost transkripcijskom aktivacijom, na primjer, miR-145 koji ciljaMycmRNA za utišavanje translacije (4,5), čime se stvara regulacijska petlja negativne povratne sprege.

Najjednostavnija i najučinkovitija strategija za liječenje raka je ubijanje kancerogenih stanica. Pokazalo se da često korišteni lijekovi protiv raka, kao što su cisplatin (6), aktinomicin D (7) i adriamicin (8), inhibiraju rast tumora potičući apoptozu. Nedavno je sve više dokaza pokazalo da brojni prirodni proizvodi i derivati ​​iz biljaka, posebice iz ljekovitih biljaka koje se koriste u tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM), pokazuju funkciju suzbijanja tumora induciranjem apoptoze stanica raka i imaju potencijal za kliničku primjenu u terapiji raka (9). Na primjer, prirodni antrakinon emodin izoliran je iz brojnih vrsta stanica raka (10,11). Kamptotecin, izveden iz kineske riječi "sretno drvo",Camptotheca zašiljeni, vrijedan je prirodni proizvod koji inhibira ligaciju DNK nakon lomova lanaca posredovanih topo I (12). U drugoj retrospektivnoj populacijskoj kohortnoj studiji na ukupno 729 pacijenata s uznapredovalim rakom dojke, sugerirano je da TCM terapija može doprinijeti liječenju raka. Od ove skupine, 115 pacijenata bili su korisnici TKM-a, dok 614 pacijenata nije koristilo TKM. Multivarijantna analiza pokazala je da je, u usporedbi s ne-korisnicima, korištenje TKM-a povezano sa značajno smanjenim rizikom smrtnosti od svih uzroka (13). Sva navedena saznanja upućuju na to da je TKM važan komplementarni i alternativni lijek koji se može koristiti u liječenju raka.

miševi s akutnom ozljedom pluća (16,17). Također, ECH(Ehinakozid)pokazalo se da ima zaštitne učinke na živčano tkivo i poboljšava poremećaje ponašanja u mišjim modelima Parkinsonove bolesti (18). Naime, utvrđeno je da ECH potiče proliferaciju stanica i inhibira apoptozu u MODE-K stanicama crijevnog epitela miša (19). Do sada je, međutim, manje pažnje posvećeno potencijalnoj ulozi ECH u prevenciji raka.

U ovoj studiji ispitano je utječe li liječenje ECH na rast i proliferaciju tumorskih stanica te utječe li ECH(Ehinakozid)inducira apoptozu, povisuje proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) i smanjuje potencijal mitohondrijske membrane (MMP), te posljedično potiskuje rast tumorskih stanica. Nadalje, cilj ove studije bio je identificirati molekularne mehanizme odgovorne za inhibiciju rasta stanica posredovanu ECH.

Materijali i metode

Ćelija crta, reagens, i protutijela.Stanice adenokarcinoma gušterače SW1990 (ATCC, Manassas, VA, SAD) uzgajane su u Dulbecco-ovom modificiranom Eagle mediju s dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma, 50 U/ml penicilina i 0,1 mg/ml streptomicina na 37˚C u 5 posto CO2 ovlažena atmosfera. ECH(Ehinakozid)je kupljen od Jrdun Biotechnology Corp. (Šangaj, Kina). Antitijela protiv AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 i GAPDH kupljena su od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAD); anti-Bax i anti-Bcl-2 su kupljeni od Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, SAD); a anti-Caspase-3 je kupljen od Abcama (Šangaj, Kina).

Ćelija održivostanaliza. Za procjenu brzine rasta tumorskih stanica korišten je komplet za brojanje stanica {{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, SAD) u skladu s uputama proizvođača. Suspenzije stanica su nasađene na 5,000 stanica po jažici s ECH tretmanom tijekom 0, 12, 24, 48 ili 72 h u 96 -pločama s kulturom jažica. Inhibicija rasta stanica određena je dodavanjem reagensa WST-8 iz kompleta CCK-8 u konačnoj koncentraciji od 10 posto u svaku jažicu, a apsorbancija uzoraka mjerena je na 450 nm pomoću čitača mikropločica (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SAD).

Hoechst 33342 bojenje.Stanice (60 posto konfluentnosti) tretirane su Hoechstom 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kina) u konačnoj koncentraciji od 1µg/ml, inkubirano u inkubatoru na 37˚C 15 minuta, isprano dva puta fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom, fiksirano u 4 posto paraformaldehida 30 minuta na sobnoj temperaturi i postavljeno na stakalce. Morfološke promjene staničnih jezgri promatrane su pod fluorescentnim mikroskopom (Olympus BX51, Melville, NY, USA). Normalne jezgre bile su okrugle i obojene svijetloplavo, dok su apoptotičke jezgre bile skupljene i obojene svijetloplavo.

Aktivirana fluorescencija ćelija sortiranje (FACS) analize.Za procjenu apoptoze korišten je komplet za detekciju apoptoze fluorescein izotiocijanat (FITC)-Annexin V (BD Biosciences, Šangaj, Kina) u skladu s uputama proizvođača. Ukratko, 5x104 stanica isprano je s ledeno hladnim PBS-om, resuspendirano u 0,1 ml pufera za vezanje (Beyotime Institute of Biotechnology) i obojeno s 10 ml FITC-konjugiranog aneksina V (10 mg/ml) i 10 ml propidij jodida (PI) (50 mg/ml). Nakon inkubacije od 15 minuta na sobnoj temperaturi u mraku i dodatka 400 ml pufera za vezanje, stanice su analizirane protočnim citometrom (C6; BD Biosciences, Šangaj, Kina).

Mjerenje od reaktivan kisik vrsta (ROS).Za procjenu proizvodnje ROS-a korišten je pribor za analizu reaktivnih kisikovih vrsta (Vigorous Biotechnology, Peking, Kina) u skladu s uputama proizvođača. Ukratko, stanice (80 posto konfluencije) su sakupljene i isprane s PBS-om prije bojenja s otopinom dihidroetidija (DHE) (Beyotime Institute of Biotechnology). Stanice su zatim analizirane protočnom citometrijskom analizom.

Mjerenje od mitohondrijski membrana potencijal (MMP).

Komplet za ispitivanje tetrametilrodamin metil estera (TMRM) (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, SAD) korišten je za otkrivanje promjena u MMP. Ukratko, stanice (80 posto konfluencije) su sakupljene, isprane s PBS i obojene s TMRM 15-20 minuta u inkubatoru na 37°C. Stanice su tada isprane jednom s PBS-om i podvrgnute protočnim citometrijskim analizama.

Imunoblotinganalize. Stanice (80 postotna konfluencija) su sakupljene i lizirane u RIPA puferu (Jrdun Biotechnology) koji se sastoji od 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 posto NP-40, 1 posto natrijeva deoksikolna kiselina i 0,1 posto SDS i svježe dodani inhibitori proteasoma. Jednake količine bistrog lizata stanica korištene su za imunobloting analizu kao što je prethodno opisano (20).

Statistički analiza.Kvantitativni podaci izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Statističke razlike procijenjene su neuparenim Studentovim t-testom pomoću statističkog softvera SPSS 15.0. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Rezultati

ECH (Ehinakozid)potiskuje tumor ćelijarast. Iako je objavljeno da ECH(Ehinakozid)pokazuje zaštitnu ulogu inhibicijom apoptoze i upalnih signala u somatskim stanicama, kao što su neuronske i intestinalne epitelne stanice (16-19), ostaje nejasno kontrolira li ECH rast i proliferaciju kancerogenih stanica. Kako bi se to testiralo, provedena je analiza preživljavanja stanica tretiranjem stanica SW1990, izvedenih iz adenokarcinoma gušterače II. stupnja, s titriranim dozama ECH kao što je prikazano na slici 1. Posebno je pokazano da ECH značajno usporava proliferaciju tumorskih stanica u dozi -ovisan način tijekom 5-dnevnog razdoblja kulture (Sl. 1).ECH okidačiapoptoza. Budući da je gubitak apoptoze jedan od glavnih uzročnih mehanizama u podlozi nekontrolirane proliferacije stanica raka gušterače (21), ova je studija provela niz eksperimenata kako bi se utvrdilo pokreće li ECH apoptozu. Prvo, bojanjem jezgri tumorskih stanica s Hoechst 33342, pokazano je da ECH rezultira apoptozom na način ovisan o dozi (slika 2A). Dodatno, FACS analize su provedene korištenjem Annexin V/PI bojenja kako bi se dodatno potvrdio apoptotski učinak ty ECH (Slika 2B). Prosječni postotak apoptotskih stanica bio je 1,1 posto u normalnim uvjetima kulture, dok se taj postotak značajno povećao na 10,6, 21,4 i 51,3 posto kao odgovor na liječenje ECH-om na način ovisan o dozi (Slika 2C). Ovi rezultati, zajedno s analizom stanične viabilnosti prikazanom na slici 1, pokazuju da ECH tretman potiskuje proliferaciju tumorskih stanica pokrećući apoptozu.

generira etidij koji interkalira s DNA, korišten je u ovoj studiji za procjenu proizvodnje ROS-a. Utvrđeno je da, poput drugih lijekova protiv raka, ECH također stimulira proizvodnju ROS-a na način ovisan o dozi, kao što je prikazano povišenim intenzitetom fluorescencije nakon liječenja ECH-om (slika 3).

ECH (Ehinakozid)smanjuje MMP.Pokazalo se da je mitohondrijska disfunkcija uključena u indukciju apoptoze. Dokazano je da otvaranje prijelazne pore mitohondrijske propusnosti inducira depolarizaciju transmembranskog potencijala i otpuštanje proapoptotskih čimbenika (23). Stoga je ispitano može li ECH inducirati gubitak MMP u tumorskim stanicama izvođenjem TMRM testa, što je dobro uspostavljen pristup, budući da je intenzitet TMRM fluorescencije proporcionalan membranskom potencijalu. Pokazalo se da ECH liječenje značajno smanjuje MMP na način ovisan o dozi (slika 4).ECH kontrole tumor ćelija rast preko mitogenom aktivirani proteinmolekularne osnove smrti tumorskih stanica posredovane ECH-om, ispitana je aktivnost nekoliko vitalnih signalnih putova, kao što su MAPK i AKT (24,25), koji kontroliraju preživljavanje i smrt stanica. MAPK su evolucijski očuvane, prolinom usmjerene Ser/Thr protein kinaze, uključujući ekstracelularne kinaze regulirane signalom (ERK), c-Jun NH2-terminalne kinaze (JNK) i članove obitelji p38 koji se aktiviraju kroz tri signalne kaskade tier kinaze (26,27). U ovoj studiji procijenjena je ekspresija MAPK i AKT, kao i njihovih aktiviranih fosforiliranih oblika, te je otkriveno da ECH značajno potiskuje aktivnost JNK i ERK1/2, ali pojačava aktivnost p38 (slika 5). Naime, pokazalo se da ECH tretman ne utječe na aktivnost AKT, koja je također kritično važna za staničnu proliferaciju (slika 5). Osim toga, pokazalo se da tretman ECH povećava ekspresiju Bax i Caspase-3 dok smanjuje ekspresiju Bcl-2 (slika 5), ​​što je u skladu sa slikom 2. Dakle, rezultati pokazuju da ECH pokreće apoptozu tumorskih stanica putem MAPK puta.

Rasprava

Koliko nam je poznato, ovo je prva studija koja pokazuje da ECH ima funkciju supresije tumora tako što pokreće apoptozu (Slika 2), potiče proizvodnju ROS (Slika 3) i inducira depolarizaciju potencijala mitohondrijske membrane (Slika 4) , što posljedično dovodi do inhibicije rasta tumorskih stanica (slika 1). Nadalje, pokazalo se da molekularna osnova smrti tumorskih stanica posredovane ECH-om nastaje reguliranjem signalnih putova MAPK (slika 5). Ovi nalazi pokazuju novu funkciju ECH-a u prevenciji tumorigeneze i stoga sugeriraju da bi on mogao biti sredstvo kandidat za terapiju raka.

Većina lijekova protiv raka može potaknuti apoptozu tumorskih stanica, starenje i/ili zaustavljanje staničnog ciklusa, što dovodi do inhibicije rasta i proliferacije tumorskih stanica. Zaustavljanje staničnog ciklusa je stanični odgovor na blage signale stresa koji omogućuju stanicama da poprave oštećenu DNK prije pokretanja replikativne sinteze DNK ili mitoze, dok se apoptoza i starenje (trajni zastoj staničnog ciklusa) javljaju kao odgovor na signale stresa koji eliminiraju nepopravljive ili maligne stanice ( 28,29). Stoga je u ovoj studiji procijenjen samo apoptotski učinak ECH-a na tumorske stanice, budući da je ubijanje kancerogenih stanica glavni kriterij za procjenu snage nekog sredstva protiv raka. Naime, pokazalo se da ECH inducira ekspresijuBax(Sl. 5), pro-apoptotski gen, transkripcijski aktiviran tumor supresorom p53 (30). Stoga je vrijedno testirati može li ECH aktivirati p53 signalni put. Ako je tako, ECH bi također mogao izazvati zaustavljanje staničnog ciklusa ovisno o p53-u, starenje, apoptozu ili autofagiju. U ovoj studiji razjašnjena je tumor-supresivna funkcija ECH u staničnoj liniji adenokarcinoma gušterače SW1990. Međutim, potrebna su daljnja istraživanja koja će promatrati više staničnih linija raka gušterače. Dokazano je da su mutacije onkogenog proteina RAS i tumor supresora p53 povezane s razvojem raka gušterače (31); međutim, stanična linija SW1990 ne sadrži nikakvu mutaciju p53, prema bazi podataka IARC p53 (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Stoga je važno istražiti može li ECH utjecati na rast i proliferaciju drugih staničnih linija raka gušterače s različitim mutacijama p53. Dodatno, bilo bi zanimljivo utvrditi može li ECH potaknuti apoptozu i inhibirati rast drugih vrsta tumora.

Povećanje ROS-a i smanjenje MMP-a, koje je uzrokovalo ECH liječenje, pokazalo se ključnim u indukciji apoptoze (22). Osim toga, otkriveno je da ROS može potaknuti oksidaciju mitohondrijskih pora pridonoseći oslobađanju citokromac, intermedijer u apoptozi, zbog poremećaja MMP (22). Prema tome, ostaje za utvrditi ometa li ECH MMP neizravno kroz indukciju ROS. Štoviše, pokazalo se da je oksidativni stres izazvan ROS-om također uključen u modulaciju mnoštva signala koji kontroliraju rast stanica, uključujući p53, NF-κB, HIF i PI3K (32). Ostaje za utvrditi regulira li ECH te važne signalne putove, i ako jest. Naime, oksidativni stres uzrokuje različite neurodegenerativne bolesti zbog velike potrošnje kisika, slabih antioksidativnih sustava i karakteristika terminalne diferencijacije središnjeg živčanog sustava (33). Međutim, nekoliko je studija pokazalo da ECH ima zaštitne i antiapoptotičke učinke na živčano tkivo. U tom smislu, razumno je pretpostaviti da ECH može smanjiti proizvodnju ROS-a u terminalno diferenciranim neuralnim stanicama. Stoga također treba utvrditi ovisi li regulacija proizvodnje ROS pomoću ECH-a o statusu stanične diferencijacije. Stoga sadašnji rezultati zajedno s drugim studijama otkrivaju da ECH, naširoko korišteni TCM, može biti važna kemoterapijska strategija ne samo za liječenje neurodegenerativnih bolesti, već i malignih karcinoma.

Nedavno je korištenje TKM-a u terapiji raka dobilo sve više pažnje. Potencijal prirodnih proizvoda od ljekovitog bilja koji se koriste u TKM prepoznala je znanstvena zajednica čak iu zapadnom svijetu (9). Potrebni su napori da se razjasne temeljni mehanizmi djelovanja ovih prirodnih proizvoda, što bi na kraju moglo dovesti do razvoja učinkovitih i sigurnih lijekova za terapiju raka.

U zaključku, ova studija je pokazala tumorsku inhibitornu funkciju ECH i također razrađuje molekularnu osnovu supresije tumora posredovane ECH, sugerirajući tako potencijalnu kliničku primjenu ECH u terapiji raka.

Priznanja

Ovo je istraživanje financirano i podržano od strane Ključnog programa znanstvenih istraživanja FMU (potpora br. 09ZD014). Autori se zahvaljuju Biomedworldu (Šangaj, Kina) na pomoći pri uređivanju rukopisa.

Reference

1. Hanahan D i Weinberg RA: Obilježja raka: Sljedeća generacija. Ćelija 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Transkripcija: Transkripcijski učinci MYC. Nat Rev Cancer 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ i Roussel MF: Myc signalizacija putem ARF tumor supresora regulira p53-ovisnu apoptozu i imortalizaciju. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K i Mo YY: p53 potiskuje c-Myc indukcijom tumor supresora miR-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X i Lu H: Novi uvidi u funkcije p53 kroz njegove ciljne mikroRNA. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB i Lippard SJ: Cisplatin i popravak DNA u kemoterapiji raka. Trends Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H i Korc M: Actinomycin D inducira apoptozu i inhibira rast stanica raka gušterače. Int J Cancer 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P i Dass CR: Doxorubicin: Ažuriranje molekularnog djelovanja protiv raka, toksičnosti i novih sustava za isporuku lijekova. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS i Kaina B: Od tradicionalne kineske medicine do racionalne terapije raka. Trends Mol Med 13: 353-361, 2007.