Estrogena aktivnost glikozida iz Cistanche Deserticola kao pomoćnog sredstva za estrogenske receptore in vitro

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Hui Song, Wen-Lan Li, Xiang-Ming Sun, Yang Hu, Jing-Xin Ding, Yu-Bin Ji, Jing-Ya Wang

UVOD

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" na kineskom), tradicionalni kineski biljni lijek koji je prvi put zabilježen u ShenNongBenCaoJingu, koristio se za liječenje nedostatka bubrega, impotencije, staračkog zatvora i nedostatka krvi tisućama godina.[1] Uglavnom je rasprostranjen u pustinjskim regijama sjeverozapadne Kine, kao što su Gansu i Xinjiang.[2] Suvremena farmakološka istraživanja pokazala su da C. deserticola može unaprijediti široke medicinske funkcije, poput regulacije hormona, imunomodulatorne, antioksidativne, neuroprotektivne, protuupalne i estrogenske aktivnosti.[3,4] Glikozidi Cistanches (GC) smatrani su jednim od glavne aktivne komponente s različitim biološkim učincima.[5,6]

Estrogenski receptori‑ (ERs‑ ) i ER su podvrste ER-a koji bi mogli regulirati fiziološke funkcije.[7] Ti bi proteini mogli regulirati transkripciju ciljnih gena vezanjem na pridružene regulacijske sekvence DNA u staničnoj jezgri. Oba podtipa izrazito su izražena u kardiovaskularnom i središnjem živčanom sustavu [8,9] ER postoji uglavnom u mliječnoj žlijezdi, maternici, jajniku, kostima, muškom reproduktivnom organu i prostati. ER je prisutan uglavnom u prostati, jajniku i mjehuru. [10,11] Štoviše, postoje neke zajedničke fiziološke uloge za ova dva podtipa, kao što su razvoj i funkcija jajnika i zaštita kardiovaskularnog sustava. [12,13] Prethodno istraživanje u našoj skupini otkrilo je mehanizam GC sličan estrogenima metodom metabolomske analize.[14] U kontinuiranoj studiji analizirali smo mehanizam estrogenske aktivnosti GC-a na MCF-7 staničnih linija povezanih s ER-ima.

MATERIJALI I METODE

instrumenti

Inkubator ECO‑170P‑230 bio je od New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., čitač mikropločica Bio‑Rad 680, a aparati za elektroforezu bili su od Bio‑Rad Laboratories, Inc., mikroskop CX21 bio je od Olympus Co., Ltd. , GIS‑2019 gel sustav za oslikavanje bio je od Tanon Science and Technology Co., Ltd., ploča s ravnim dnom bila je od Corning Inc., EPICS‑XL protočna citometrija bila je od Beckman‑Coulter Inc., a StepOnePlus Real-Time lančana reakcija polimerazom (PCR) sustav bio je od Thermo Fisher Scientific.

Kemikalije i reagensi

GC-ovi su pripremljeni u našem laboratoriju prema prethodno navedenoj metodi [14], a čistoća GC-ova je određena na 52 posto (akteozid je korišten kao marker za određivanje GC-a) ultraljubičastom spektrofotometrijom. Estradiol (E2) je kupljen od Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Šangaj, Kina). Fetalni goveđi serum (FBS) i RPMI‑1640 bili su od Gibco Co., Ltd., ploča s ravnim dnom s 96 jažica bila je od Corning Inc., a dimetil sulfoksid (DMSO) i 3-[4,5-dimetil-2-tiazolil ]-2,5-difeniltetrazolij bromid (MTT) kupljen je od Sigma-Aldrich Corporation. TRIzol reagens, komplet za reverznu transkripciju (RT) i komplet TB Green™ RT‑PCR kupljeni su od TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Kina. Anti-ER zečji pAb, anti-ER zečji pAb i ‑aktinska protutijela kupljena su od Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Sve druge uobičajene kemikalije kupljene su od standardnih komercijalnih dobavljača.

Priprema uzorka

Priprema matične otopine glikozida Cistanches

Ekstrakt GC-a otopljen je u DMSO-u kako bi se dobila osnovna otopina s koncentracijom 0.1051 g/ml i pohranjen na 4 stupnja. RPMI‑1640 bez fenol crvenog korišten je za razrjeđivanje osnovne otopine na različite koncentracije prije upotrebe.

Priprema osnovne otopine estradiola

Ekstrakt E2 otopljen je u DMSO kako bi se dobila osnovna otopina s koncentracijom 0.27 mg/ml i pohranjen na 4 stupnja. RPMI‑1640 bez fenol crvenog korišten je za razrjeđivanje osnovne otopine na različite koncentracije prije upotrebe.

Priprema fetalnog goveđeg seruma tretiranog ugljenom dekstranom

Stotine mililitara FBS-a pomiješano je s 250 mg praha aktivnog ugljena i 25 mg dekstrana. Nakon inkubacije 45 minuta na 55 stupnjeva, smjesa je centrifugirana na 4 stupnja, 1000 okretaja u minuti 15 minuta. Supernatant je filtriran korištenjem Millipore Express PES membrane kako bi se dobio FBS obrađen ugljenom dekstranom (CDT) i pohranjen na -20 stupnjeva.

Kultura stanica

Stanične linije ljudskog raka dojke MCF-7 dobivene su iz američke zbirke tipskih kultura (ATCC). Štoviše, stanice su uzgajane s medijem RPMI‑1640 koji je sadržavao 10 posto FBS-a i 1 posto penicilin-streptomicina na 37 stupnjeva pod vlažnom atmosferom od 5 posto CO2. Stanice su uzgajane u mediju RPMI‑1640 bez fenol crvenog koji je sadržavao 5 posto CDT-FBS 4 dana prije MTT testa kako bi se estrogen u stanicama trebao očistiti.

Analiza stanične proliferacije estradiola na MCF-7 staničnoj liniji

Stanična proliferacija mjerena je pomoću MTT testa za MCF-7 stanice.[15,16] E2 je otopljen u mediju za kulturu RPMI-1640 koji je sadržavao 0.1 posto DMSO u konačnim koncentracijama od {{27 }}.1, 1, 10, 100 i 1000 nM. Stanične linije MCF-7 uzgajane su u mediju RPMI-1640 bez fenol crvenog 4 dana. Nakon ispiranja fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS) tri puta, 100 µL RPMI-1640 medija bez FBS-a dodano je u ploče s 96 jažica pri 1,5 × 104 po jažici i inkubirano na 37 stupnjeva 24 sata. Nakon toga, stanice su tretirane različitim koncentracijama otopine E2 tijekom 72 sata. Zatim je u svaku jažicu dodano 100 uL MTT otopine (0,5 mg/mL). Stanice su inkubirane 4 h. Na kraju je dodano 150 µL DMSO da se otope kristali formazana. Apsorbancija je izmjerena na 570 nm čitačem mikropločica i izračunata je brzina proliferacije (PR).

Analiza stanične proliferacije glikozida Cistanches na staničnim linijama MCF-7

Proliferacija stanica mjerena je pomoću MTT testa za MCF-7 stanice. GC su otopljeni u mediju kulture RPMI‑1640 koji je sadržavao 0.1 posto DMSO u konačnim koncentracijama od 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 i 175 µg /ml. Stanične linije MCF‑7 uzgajane su u mediju RPMI‑1640 bez fenol crvenog koji je sadržavao 5 posto CDT-FBS tijekom 4 dana. Nakon ispiranja PBS-om tri puta, 100 µL RPMI-1640 medija bez FBS-a dodano je u ploče s 96 jažica pri 1,5 × 104 po jažici i inkubirano na 37 stupnjeva 24 sata. Nakon toga, stanice su tretirane različitim koncentracijama GC otopine 24, 48, odnosno 72 sata. Zatim je u svaku jažicu dodano 100 uL MTT otopine (0,5 mg/mL). Stanice su inkubirane 4 h. Na kraju je dodano 150 µL DMSO da se otope kristali formazana. Apsorbancija je izmjerena na 570 nm čitačem mikropločica i izračunat je PR. RPMI‑1640 bez fenol crvenog i medij koji je sadržavao E2 (2,725 × 10-3 µg/ml) bili su negativna, odnosno pozitivna skupina.

Analiza stanične proliferacije glikozida Cistanches s fulvestrantom na MCF-7 staničnim linijama

Proliferacija stanica mjerena je pomoću MTT testa za MCF-7 stanice. GC su otopljeni u mediju kulture RPMI‑1640 koji sadrži 0.1 posto DMSO u konačnim koncentracijama od 1,75, 17,5 i 175 µg/ml. Stanične linije MCF‑7 uzgajane su u mediju RPMI‑1640 bez fenol crvenog koji je sadržavao 5 posto CDT-FBS tijekom 4 dana. Nakon ispiranja PBS-om tri puta, 100 µL RPMI-1640 medija bez FBS-a dodano je u ploče s 96 jažica pri 1,5 × 104 po jažici i inkubirano na 37 stupnjeva 24 sata. Nakon toga, stanice su tretirane različitim koncentracijama GC otopine i inkubirane s fulvestrantom (6,06 × 10-5 µg/ml) 48 h. Zatim je u svaku jažicu dodano 100 uL MTT otopine (0,5 mg/mL). Stanice su inkubirane 4 h. Na kraju je dodano 150 µL DMSO da se otope kristali formazana. Apsorbancija je izmjerena na 570 nm čitačem mikropločica i izračunat je PR. RPMI‑1640 bez fenol crvenog i medij koji je sadržavao E2 (2,725 × 10-3 µg/ml) bili su negativna, odnosno pozitivna skupina.

Ispitivanje staničnog ciklusa

GC su otopljeni u mediju kulture RPMI‑1640 koji sadrži 0.1 posto DMSO u konačnim koncentracijama od 1,75, 17,5 i 175 µg/ml. MCF‑7‑stanične linije uzgajane su u mediju RPMI‑1640 bez fenol crvenog koji je sadržavao 5 posto CDT-FBS tijekom 4 dana. Nakon ispiranja s PBS-om tri puta, 1 mL medija RPMI-1640 bez FBS-a dodan je u ploče sa 6 jažica pri 2,5 × 105 po jažici i inkubiran na 37 stupnjeva 24 sata. Nakon toga, stanice su tretirane različitim koncentracijama GC otopine i inkubirane s fulvestrantom (6,06 × 10-5 µg/ml) 48 h. Nakon toga, stanice su sakupljene i isprane s PBS tri puta, centrifugirane na 4 stupnja, 1000 okretaja u minuti tijekom 10 minuta, i fiksirane sa 70 posto etanola na -20 stupnjeva, preko noći. Nakon dva puta ispiranja s PBS-om, stanice su obojene otopinom PI (50 mg/mL) koja je sadržavala 1 mg/mL RNaze A i 0,1 posto Triton X-100 30 minuta u mraku na 4 stupnja. Stanični ciklus detektiran je protočnom citometrijom, a indeks proliferacije (PI) izračunat je kako slijedi. RPMI‑1640 bez fenol crvenog i medij koji je sadržavao E2 (2,725 × 10-3 µg/ml) bili su negativna, odnosno pozitivna skupina. PI=(S plus G2 M)/(G0 /G1 plus S plus G2 M) × 100 posto

Izolacija RNA i kvantitativna analiza polimerazne lančane reakcije u stvarnom vremenu

Za mjerenje razine mRNA korišten je RT-kvantitativni PCR (qPCR) test. Ukupna stanična RNA ekstrahirana je s TRIzol reagensom. Za qPCR, RNA je obrnuto transkribirana u cDNA iz 4 µg ukupne RNA korištenjem RT kompleta. RT-PCR analize provedene su korištenjem TB Green™ RT-PCR kompleta. Svi protokoli su provedeni prema uputama proizvođača. Par početnica korišten za pojačanje ER bio je 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (naprijed) i 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (nazad); par početnica korišten za pojačanje ER bio je 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (naprijed) i 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (nazad). Uvjeti PCR za ER i ER bili su 94 stupnja tijekom 3 minute, nakon čega slijedi 37 odnosno 40 ciklusa, od 94 stupnja tijekom 30 s, 58 stupnjeva tijekom 2 minute i 72 stupnja tijekom 2 minute. Par početnica korišten za pojačanje GAPDH bio je 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (naprijed) i 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (nazad). Uvjeti PCR za GAPDH bili su 94 stupnja tijekom 3 minute nakon čega je slijedilo 30 ciklusa od 94 stupnja tijekom 30 s, 58 stupnjeva tijekom 2 minute i 72 stupnja tijekom 2 minute. Svaki put kada je eksperiment RT‑qPCR ponovljen više od dva puta. Za to je korišten GAPDH kao interna kontrola. Izračunata je relativna genska ekspresija ER /ER transfektanata u odnosu na kontrolne stanice: 2−(∆∆Ct).

Western blotting

Ekspresija ER i ER proteina otkrivena je Western blot analizom kao prijavljena metoda s manjim modifikacijama. Ukratko, stanice MCF-7 uzgajane su u pločama sa 6 jažica pri 2,5 × 105 stanica po jažici i tretirane GC-om u konačnoj koncentraciji od 1,75, 17,5 i 175 µg/ml tijekom 48 h. Nakon inkubacije, ekstrakti cijelih stanica pripremljeni su korištenjem RIPA pufera koji je sadržavao 1 mM PMSF. Proteini u ekstraktima cijelih stanica odvojeni su elektroforezom na 12-postotnom natrijevom dodecil sulfatu-poliakrilamidnom gelu i zatim prebačeni na membrane od poliviniliden difluorida. Membrana je blokirana s 5 posto (w/v) obranog mlijeka otopljenog u TBST puferu i inkubirana s primarnim i sekundarnim protutijelima naizmjenično. Uočena su vezana antitijela.

Statistička analiza

Rezultati su izraženi kao srednje vrijednosti i standardne devijacije, a statistička značajnost provedena je korištenjem Studentovog t-testa sa softverom SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. Amerika). P<0.05 was="" considered="" statistically="">

REZULTATI

Nakon 24 sata tretmana E2, proliferacija stanica MCF-7 očito je pojačana [Slika 1a]. 10 nM otopine E2 moglo bi očito stimulirati rast stanica (123,89 posto). Međutim, s povećanjem koncentracije E2, sposobnost stanične proliferacije je slabila. Stoga je 10 nM bila optimalna koncentracija E2 u ovom eksperimentu.

Grupa GC u koncentracijama od 1,75, 17,5 i 175 µg/mg mogla je pojačati proliferaciju staničnih linija MCF-7 na način ovisan o vremenu i dozi i pokazala je značajnu razliku u odnosu na negativnu skupinu [Slika 1b]. U usporedbi s negativnom skupinom, skupina E2 pokazala je očitu proliferaciju (120,06 posto).

Skupina kombiniranih lijekova (CMG) (fulvestrant s E2 ili GC) u mediju CDT-FBS inkubirana je sa stanicama MCF-4. Nakon 72 sata inkubacije, CMG je mogao dovesti do nagiba PR-a u usporedbi s pojedinačnom skupinom lijekova (IMG) (P < 0.01)="" [slika="">

Analiza protočne citometrije pokazala je da GC mogu neznatno povećati vrijednost PI što sugerira da GC mogu unaprijediti stanice G{{0}}/G1 faze u S i G2/M faze [Slika 2 i Tablica 1] i promovirati staničnu DNK sinteza. Rezultat koji pokazuje da je mehanizam GC-a na MCF-7 bio sličan onom za E2. U CMG-u (fulvestrant s GC-ima), vrijednost PI stanične PI lagano je pala u odnosu na IMG (P <>

RT-PCR analiza pokazala je da su ekspresije ER i ER mRNA povećane u usporedbi s kontrolnom skupinom (P < 0.01) na način ovisan o dozi nakon liječenja različitim koncentracijama GC tijekom 48 h [Slika 3a i b].

Western blot rezultat pokazuje da se nakon tretmana s različitim koncentracijama GC-a tijekom 48 sati, sadržaj ER i ER proteina u MCF-7 povećava s povećanjem GC-a na način ovisan o dozi [Slika 3c-e]

ZAKLJUČAK

U ovom istraživanju učinak GC-a na proliferaciju i stanični ciklus MCF‑7 ispitan je metodom MTT, odnosno protočnom citometrijom. GC bi mogli povećati proliferaciju MCF-7 stanica u koncentracijama od 1,75, 17,5 i 175 µg/ml nakon inkubacije tijekom 72 sata. Međutim, povećanje ima tendenciju usporavanja kada su CCs i fulvestrant korišteni zajedno. GC bi mogli povećati vrijednost PI stanica MCF-7, smanjiti ćeliju G1 faze i povećati ćeliju S i G2 faze.

Fulvestrant je ER-specifični antagonist, koji blokira nuklearnu lokalizaciju ER-a ometanjem dimerizacije receptora i nuklearnog transporta ovisnog o energiji.[17] U ovom je istraživanju zaključak potvrdio da fulvestrant može oslabiti proliferaciju GC-a na stanicama MCF‑7 te može utjecati na transformaciju staničnog ciklusa. Stoga je ova studija ukazala na estrogensku aktivnost GC-a, a također je ER meta GC-a. U RT‑PCR i Western blot eksperimentu, ekspresija mRNA i proteina ER i ER u stanicama MCF‑7 porasla je s povećanjem koncentracije GC. Dakle, GC mogu igrati ulogu u estrogenskoj aktivnosti prema pojačanoj mRNA i proteinima ER i ER.