Morfofukcionalna studija o učincima pasivnog pušenja u bubrezima štakora
Feb 19, 2022
UVODPrema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji (WHO), pušenje je vodeći uzrok smrti koja se može spriječiti u svijetu, pogađajući 8 milijuna pojedinaca godišnje, a otprilike 1,2 milijuna tih smrtnih slučajeva rezultat je pojedinaca izloženih pasivnom pušenju. (1) Cigarete se sastoje od tisuća kemijskih komponenti, za koje se nedavno procjenjuje da ih je 5600. Među njima, 158 ima toksikološka svojstva koja mogu zagaditi okoliš dimom, (2) koji, kada ga udiše pasivni pušač, sadrži šest puta više nikotina, četiri puta više katrana, sedam puta više ugljičnog monoksida i 73 puta više amonijaka od onog koji udiše aktivni pušač. (3)
Pokazala je usporedna studija koju je proveo Dülger i sur., (4) među skupinom članova obitelji pušača i volontera koji nisu bili izloženi dimu cigaretabubrežne funkcije ugroženi su aktivnim pušenjem. Međutim, Elihimas Júnior i sur., (5) istaknuo je da izloženost dimu cigareta također može biti moćnabubregtoksično sredstvo. Jain i sur., (6) pokazali su da je nikotin snažan poticaj za proliferaciju ljudskih mesangial stanica i proizvodnju fibronektina, pogoršavajući glomerularnu ozljedu.
Dakle, pušenje i cirkulirajući nikotin negativno utječu na strukture odgovorne za glomerularnu filtraciju, ali povezanost pasivnog pušenja i morfofunkcijskih promjena tih struktura, zbog te izloženosti, još nije u potpunosti razjašnjena u literaturi, a to je glavni cilj ove studije.
Ključne riječi:Zagađenje duhanskim dimom; Bubrežni korteks; Bubrežni glomerulus; Mesangijalne stanice; Dijabetičke nefropatije; Glomerularna brzina filtracije; Štakori, Wistar
CILJAnalizirati morfološke, strukturne i funkcionalne aspekte ububrezištakora nakon pasivnog udisanja dima cigarete.
METODESkrb i stanovanje životinja bili su u skladu s Nacionalnim i institucionalnim smjernicama za dobrobit životinja, koje su uspostavili životinja Colégio Brasileiro de E xperimentação (COBEA) [Brazilski koledž za eksperimentiranje na životinjama] i conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) [Nacionalna škola za eksperimentiranje na životinjama) [Nacionalna škola za eksperimentiranje na životinjama] i životinja Conselho Nacional de Controle de Experimenteção (CONCEA) [National National NationalVijeće za kontrolu eksperimentiranja na životinjama]. Svu uporabu životinja pregledalo je i odobrilo Etičko povjerenstvo za eksperimentiranje na životinjama (postupak 286/2015). Stoga su uloženi napori kako bi se smanjila patnja, nelagoda i broj korištenih životinja, tretirajući ih humano.
Dizajn studijaEksperimentalna studija sastavljena od muških štakora (Rattus norvegicus albinus), starih 8 tjedana, težine prosječno 260 g, podijeljena je na Kontrolnu skupinu (CG) i Skupinu pasivnih pušača (SG). CG i SG podijeljeni su na CG 7 dana (n =10), SG 7 dana (n = 10), CG 28 dana (n = 10) i GT 28 dana (n = 10). Životinje obiju skupina držane su u vivariju Faculdade de Medicina de Jundiaí (FMJ), od studenoga 2015. do siječnja 2016., u odvojenim prostorijama, dvije po kutiji, pod sobnom temperaturom između 22±2 °C i svjetlosnim/tamnim ciklusom od 12 sati. Tijekom eksperimenta praćeno je povećanje tjelesne težine životinja (g) i unos filtrirane vode (mL) i hrane za životinje (g) ad libitum (Nuvilab ®; energetska vrijednost: 339kcal =1418kJ 100,0%; ugljikohidrati 54g ili 63,4%; proteini 22g ili 25,9%; i lipidi 4g ili 10,6% - količine na 100 g porcije i postotak ukupne energetske vrijednosti). Razlike između ponuđenog iznosa i količine koju je životinja zanemarila korištene su za izračunavanje prosječnog unosa.
Kako bi se prilagodile dimu cigareta, životinje SG-a postupno su bile izložene spaljivanju cigareta, koje su se dogodile u dvojkama, do 40 cigareta dnevno (visok prinos; katran: 10 mg; nikotin: 0,8 mg; ugljični monoksid: 10 mg) za razdoblja u rasponu od sedam do 28 dana. Do paljenja je došlo u automatiziranom stroju za pušenje (SM-MC-01), programiranom da počne paliti cigarete svakih 6 sati, sa spaljivanjem 10 cigareta po ciklusu. Dim cigarete bio je aspiriran sustavom dotoka ventilacijskog stalka, takozvanom "sobom za pušenje" (slika 1), i homogeno raspoređen unutar zatvorenih kutija životinja. Ugljični dioksid izmjeren je unutar kutija i u okolišu u kojem su držane CG i SG životinje, kalibriranim mjeračem ugljičnog dioksida (AZ Instruments, model AZ 77535, serijski broj 10109975) (certifikat 00948/2016).
Volumen urina i analiza biokemijskih parametara6. i 27. dana životinje su stavljene u metaboličke kaveze za prikupljanje 24-satnog urina. Ubrzo nakon toga, izvagani su, anestezirani, eutanazirani dugotrajnom anestezijom, ibubrezii prikupljena je krv. Mikroalbuminurija je mjerena imunturbidimetrijom spektrofotometrijskom analizom. Jafféovom metodom provedeno je mjerenje klirensa kreatinina u plazmi (referentna vrijednost: 0,58±0,24 mg/dL) (7) i klirensa kreatinina u mokraći (referentna vrijednost: 67,2±12,8 mg/dL) (7). (8) Za analize kreatinina i glukoze (referentna vrijednost: 108±17,4 mg/dL), (7) uzorci su centrifugirani na 3.000 okretaja u minuti, deset minuta, pri 4 °C kako bi se dobio serum. Enzimski setovi zatim su korišteni za mjerenja u Laborlabu za kreatinin, Bioclin za glukozu i Analisa za mikroalbuminuriju.
Utezi, dimenzije i histologija bubregabubrezidobiveni od životinja secirani su i izvagani na analitičkoj skali (model AB204, Mettler Toledo, Barueri, SP, Brazil). bubregdimenzije (duljina, širina i visina) dobivene su pomoću pachymetra, a njihovi radijusi (r) korišteni su za određivanjebubregvolumen u kubičnim centimetrima pomoću formule vol=4/3π (r1.r2.r3), koja se koristi za izračunavanje volumena elipse. (9) Za histološku analizu pravobubreg(RK) je izrezan vodoravno izmeđububrežnistupovi i lijevobubreg(LK) imao presjek, kranijalni, i kaudalni nabubreghilum sekcije, sa središnjim dijelom koji se koristi za analize. Dijelovi tkiva ugrađeni su u parafin, izrezani debljine oko 4μm i obojeni hematoksilinom-eozinom (HE) i periodičnom kiselinom Schiff (PAS).
Morfometrija i stereologija Mjerenjabubrežnikorteks je dobiven kalibriranim milimetarskim ostakom, pričvršćenim na Motic optički mikroskop s 4X objektivnom lećom, na histološkim toboganima RK i LK, obojenim u HE.
Cjelokupno morfantitativno proučavanje tkiva na strukturnoj razini provedeno je pomoću softvera Motic Images Plus 2.0, za analize i digitalizaciju histoloških dijelova. Da biste kvantificirali glomerularnu gustoću skupina, slikebubrežnikorteks je uhvaćen s 4X ciljem, na histološkim toboganima umrljanim u HE. Na slici, u 15 polja LK i 20 polja RK-a, umetnut je sustav ispitivanja, formiran retikulom i upućenim sjecištima, koji su iznosili 100 točaka, računajući one koji su se usredotočili na glomerule i isključujući one koji su se usredotočili na isprekidane linije (slika 2). Glomerularna gustoća u odnosu na ispitni sustav izračunata je na sljedeći način: Vv[glom] =p/P (Vv[glom]), s glomerularnom gustoćom u postocima; p su točke na glomeruli, a P je ukupan broj bodova u testnom sustavu. (10)
Za izračunavanje glomerularnih i kapsularnih promjera na slikama snimljenim s ciljem 40X na slajdovima
obojene PAS-om, linije su povučene između krajeva tih struktura s vrijednošću koju je izračunao program (u μm). Srednji promjer dobiven je nakon prosjeka najvećeg i najmanjeg promjera spomenutih konstrukcija, u 40bubrežnikorpuskule u RK i 30 u LK, u kojima su uočeni vaskularni i/ili mokraćni polovi (slika 3A). Kapsulasti prostori dobiveni su razlikom između njihovih vrijednosti.
U tim istim glomerulima, sada s ciljem 60X, testni sustav je ponovno umetnut, a točke koje su se pojavile na glomerulusu su prebrojane. Odmah nakon toga prebrojane su točke koje su bile incidentne na jezgrama mesangijalne stanice; (9) oni su grupirani unutar mesangial prostora, okruženi mesangial matricom između glomerularnih kapilarnih petlji (11) (slika 3B). Razlomci volumena koje zauzimaju mesangijalne stanice
u odnosu na ispitni sustav (glomerulus) izračunati su na sljedeći način: Vv[mesg] = p/P (Vv[mesg], s gustoćom mesangial volumena navedenom u postocima, p indikativnom za točke na jezgrama mesangial stanica i P koje odgovaraju ukupnom broju točaka u ispitnom sustavu. (8)
Statistička analizaStatistička analiza provedena je s ciljem usporedbe između CG-a i SG-a, kao i usporedbe unutar grupe, za svaku od ispitivanih varijabli, koristeći sredstva i standardne devijacije. Podaci su dostavljeni analizi varijance (ANOVA). Pretpostavka homogenosti varijanaca provjerena je primjenom Tukeyjevog testa višestrukih usporedbi. Razina značajnosti usvojena za sve testove bila je p≤0,05. Softver koji se koristio za analizu bio je Biostat 5.3 (Instituto de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá, Belém, PA, Brazil), a napravljene su usporedbe, kako između CG-a tako i SG-a, tako i unutar grupe.
REZULTATI
Razine ugljičnog dioksida (dio na milijun)Učinkovitost opreme za sobu za pušenje u stvaranju i insufflaing dimu potvrđena je otkrivanjem razine ugljičnog dioksida. Početna srednja vrijednost prije sagorijevanja cigareta iznosila je 620,8 dijelova na milijun (ppm) u SG okruženju, što je bilo blizu srednje vrijednosti dobivene u CG okruženju (571,8ppm). Kako su cigarete bile upaljene i dim se ubacivao u kutije, razina ugljičnog dioksida postupno se povećavala s minimalne srednje vrijednosti od 616,6ppm na maksimalnu srednju vrijednost od 1.267,0ppm (str≤0,01).
Povećanje tjelesne težine i unos SG životinje pokazale su manje povećanje tjelesne težine i manji unos hrane i vode tijekom proučavanih razdoblja (tablica 1.
Morfometrija: utezi i dimenzije bubregaDošlo je do značajnog smanjenja srednjih vrijednosti zabubregtežinabubregdimenzije (duljina, širina i visina),bubregvolumen i kortikalna debljina kod SG životinja tijekom proučavanih razdoblja. Nije bilo razlike u pogledu duljine RK-a u oba razdoblja i visine LK-a u sedmodnevnom razdoblju (tablica 2.).
Morfometrija i stereologija bubrežnih korpusaŠto se tiče glomerularne gustoće volumena i kuglastog i kapsularnog promjera, srednje vrijednosti uočene u SGbubrezibili su znatno niži. Što se tiče kapsularnih prostora, srednje vrijednosti zabilježene u SG-u bile su znatno veće u razdoblju od 28 dana. Što se tiče gustoće mesangial volumena koju zauzimaju mesangial stanica u glomerulima, srednje vrijednosti u SG bile su znatno veće (tablica 3. i slika 4.).
Volumen urina i analiza biokemijskih parametara
Volumen mokraćnog sustava SG životinja bio je znatno niži nakon sedam dana, a nije bilo razlike u 28 dana. Razina glukoze, kreatinina i mikroalbuminurije SG životinja bila je znatno viša, a razina urinarnog kreatinina i klirens kreatinina kod SG životinja bili su znatno niži tijekom ispitivanih razdoblja (tablica 4.).
DISKUSIJA
U ovoj studiji ugljični dioksid korišten je za provjeru stupnja zagađenja okoliša dimom cigareta. Razine tog plina u kutijama SG životinja bile su slične onima koje su pronašli Colli Neto i sur., (12) koji su primijetili razine koncentracije ugljičnog dioksida iznad 999ppm. To ukazuje na to da su komponente prisutne u dimu cigareta cirkulirale i životinje su ih udisale. Nadalje, u radu Robella (13) sličnom metodom izlaganja utvrđene su visoke razine kotinina (nikotinskog metabolita) u serumu životinja iz SG-a.
Zbog te izloženosti, SG životinje su predstavile manji debljanje u proučavanim razdobljima, zbog manjeg unosa vode i hrane za životinje. Nikotinska inhalacija dimom cigareta mijenja metabolizam, potičući povećanu proizvodnju topline i potrošnju kisika, što stimulira hormon koji stimulira štitnjaču (TSH) s posljedično povećanim metabolizmom i višom razinom glukoze i kolesterola u krvi. (14) Također uzrokuje akutno povišenje koncentracije dopamina i serotonina u mozgu, čime inhibira unos hrane. (15) Jedna od hipoteza predloženih za to je umjerena hiperglikemijska razina kod pušača (16) činjenica uočena u ovoj studiji i u studijama sinzata i dr. (17)
U studiji sa štakorima izloženim pušenju kao iz intrauterinog razdoblja, Schiffner (18) je primijetio da je analiza testa tolerancije glukoze pokazala otpornost na djelovanje inzulina i veće vrhunce glukoze u ovoj skupini u usporedbi s kontrolama, što sugerira da pušači imaju veće poteškoće u unosu glukoze zbog manje dostupnosti inzulina, manjeg broja i / ili funkcije inzulinskih receptora, ili manji kapacitet za izazivanje intracelularne signalne kaskade, što olakšava unos glukoze.
Kao rezultat tih čimbenika,bubregpogođeni su utezi i dimenzije u ovoj studiji, što je kulminiralo manjimvolumeni bubrega, što je također uočeno u eksperimentalnoj studiji koju je proveo Dündar i sur. (19) Međutim, iako određene morfološke promjene ne mogu značiti oštećenjebubrežna funkcija, čini se da ova povezanost slijedi na izravno proporcionalan način u pušenju, budući da je pri procjeni kortikalne debljine u SG uočena značajna atrofija. Zapravo, odnos između kortikalne debljine ifunkcija bubregapredloženo je, posebno kada postoji proporcionalno smanjenje glomerulija, (20) također u ovoj studiji, uz značajno smanjenje dimenzijabubrežnipromjer korpuskula. Međutim, kapsularni prostor povećao se u SG-u, s duljim vremenom izlaganja, vjerojatno zbog smanjenja glomerularnog promjera, što je omogućilo posljedično smanjenje brzine glomerularne filtracije (GFR). (19)
U procjeni gustoće mesangial volumena došlo je do značajnog povećanja SG životinja. Mesangial stanica koja pomaže i modulira GFR i površinu glomerulusa, zahvaljujući svojoj sposobnosti
za kontrakciju i opuštanje kao odgovor na vazoaktivne lijekove, može pretrpjeti značajnu proliferaciju, s glomerularnom sklerozom i tubulo-intersticijalnom fibrozom kod životinja kao odgovor na glomerularne endotelne lezije uzrokovane pušenjem. (21,22)
Zbog uočenih morfoloških promjena, kao i manje potrošnje vode od strane SG životinja, koje su također uočene u studijama Gonçalves-Silva etal., (23) biokemijski parametri analize krvi i urina također su se promijenili u SG- u, pružajući subvencije za razumijevanje moguće štete od moguće štetefunkcija bubrega, budući da su razine kreatinina, urinarnog kreatinina i volumena mokraće, koje se koriste za određivanje brzine klirensa kreatinina za procjenu rovinga od rovinga, bile znatno niže. Pušenje potiče značajno povećanje omjera albumina i kreatinina, s promjenama u glomerularnom kapilarnom tlaku i funkciji bubrega (24), a malo je studija koje povezuju nikotin prisutan u krvotoku pasivnih pušača sbolesti bubrega, posebno u pogledu akutne izloženosti. (25)
Dakle, akutno djelovanje cirkulirajućeg nikotina može biti povezano s glomerularnom endotelnom disfunkcijom, budući da trajne razine mikroalbuminurije, značajno povišene u ovoj studiji, određuju i klasificiraju početak i napredovanje nefropatije, te izražavaju faktor rizika za endotelnu disfunkciju i ozljede u makro- i mikrocirkulaciji. (26) Cooper (27) dokazao je da nikotin ubrzava nefropatije, koje se otkrivaju povećanjem mikroalbuminurije s napredovanjem u proteinuriju, zaključujući da su aktivno i pasivno pušenje toksični zafunkcija bubrega.
ZAKLJUČAKIzloženost i pasivno udisanje dima cigareta od strane životinja uzrokovali su morfološke i strukturne promjene u bubrezima. Zajedno s promjenama bikemijskih parametara zbog izloženosti, rezultat je bio smanjena brzina glomerularne filtracije, što pokazuje da izloženost pasivnom dimu može ugrozitifunkcija bubrega, sa sličnim učincima kao i kod aktivnog pušenja.