Studija o mikrobnim enzimima proizvedenim tijekom kombinirane bakterijske fermentacije i njihovih bioloških aktivnosti ⅲ

Poglavlje 3 Studija o antioksidacijskoj aktivnosti enzima

 

Dokazano je da su mnoge ljudske bolesti povezaneaktivni kisik i slobodni radikali, kao što jeupala, arterioskleroza,starenje, dijabetes, Rak, itd.Prekomjerni slobodni radikaliU tijelu može uzrokovati denaturaciju proteina, oštećenje stanica i smrt, pa čak i patološke promjene u tijelu. Stoga mnoge studije u zemlji i inozemstvu traže hranu bogatu prirodnim antioksidacijskim sastojcima kako bi se spriječile i regulirale bolesti uzrokovane slobodnim radikalima kroz prehranu. Danas, s sve većim životnim standardima, ljudi postupno preusmjeravaju svoj fokus na svoja tijela, tako da se sve više zdravstvenih proizvoda pojavljuju u beskrajnom toku. Međutim, nije lako biti uistinu korisno. Enzimi su vrsta hrane koju možete sami napraviti u životu ljudi. Trošak nije vrlo visok i postoje mnoge prednosti.
Mikrobni enzimi imaju različite zdravstvene funkcije kao što su antibakterijski i protuupalni, promičući metabolizam, poboljšavajući imunitet, izbjeljivanje i anti-starenje, detoksikaciju i antikancer. Trenutno je relativno malo studija o antioksidacijskim svojstvima mikrobnih enzima u zemlji i inozemstvu, pa planiramo provesti dubinska istraživanja na njima. Ovaj rad uzima enzim jabuka kao istraživački objekt i koristi ukupni sadržaj fenola, smanjujući snagu, DPPH · Slobodni radikal, · OH slobodni radikal, slobodni radikal superoksida i ABTS sposobnost uklanjanja slobodnih radikala kao indeksa određivanja za provođenje sveobuhvatnog i sustavnog istraživanja enzima Applea nakon 3 mjeseca. Sastav i sadržaj antioksidacijskih aktivnih sastojaka su proučavani, a njegovo antioksidacijsko djelovanje je shvaćeno.

Novo biljke Cistanche s mnogo više snage protiv oksidacije od fermentacije bakterija

Podržavajuća usluga Wecistanche-a-najveći izvoznik Cistanchea u Kini:
E -pošta: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

3.1 Materijali i metode

3.1.1 Materijali

(1) Eksperimentalni materijali
Operite svježe jabuke sterilnom vodom u sterilnim uvjetima, osušite ih prirodno u sterilnom operacijskom stolu, ogulite ih i narežite ih za kasniju upotrebu. Dodajte bijeli šećer i jabuke u steriliziranu staklenu staklenku u omjeru mase 1: 1. Aktivirajte bakterije potrebne za eksperiment i inokulirajte ih u enzim u skladu s optimalnom shemom (ovaj korak je izostavljen u kontrolnoj skupini), zatvorite je i stavite na hladno i suho mjesto. Nakon 3 mjeseca fermentacije sobne temperature, uzmite uzorak da biste dobili cijelu tekućinu od enzima koja sadrži pulpu i filtrirajte je. Uzmite supernatant kao eksperimentalni uzorak, a uzorak centrifugirajte u 10000rpm u trajanju od 15 minuta u centrifugi velike brzine prije nego što odredite relevantne podatke. Vrijedno je napomenuti da se u procesu izrade enzima, kako bi se izbjeglo nepotrebno onečišćenje, sve naše operacije provodile u sterilnim uvjetima.

(2) Glavni instrumenti
Spektrofotometar: v -1100, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory;
Kupka s konstantnom temperaturom: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. Ostali su instrumenti isti kao 2.1.3.

3.1.2 Metode

(1) Određivanje ukupnog sadržaja fenola [53]
① Priprema standardne krivulje:
Točno odmjerite {{{0}}. 123 g galske kiseline, otopite je u maloj količini destilirane vode i prebacite je na 5 0 0 ML volumetrijska tiska da bi se napravila volumen. Uzmite 8 čistog 1 {{1 {0}} Ml Volumetrijske tikvice, dodajte 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 i 1,4 ml standardne otopine galije kiseline, razrijedite i desetnu vodu, dodajte 1 MLENSE, dodajte 1 ML OF FOLGENT. 1 min, hladno i razrijedite na 20 ml, a stavite na sobnu temperaturu 30 minuta. Upotrijebite spektrofotometar za mjerenje apsorpcije A na valnoj duljini od 650 nm i nacrtajte standardnu ​​krivulju s apsorpcijom A kao horizontalnu os i koncentraciju uzorka kao okomita os. ② Otkrivanje
Add distilled water to 100μL, 200μL, 300μL, 400μL, and 500μL sample solutions to 46mL, then add 1mL of Folin-phenol reagent, mix evenly, react for 3min, then add 3mL of 20% NaCO3, shake in a 25 degree constant temperature water bath for 2h, use distilled water as blank control, and measure its absorbance A at a wavelength of 760nm with a spektrofotometar. Ukupni sadržaj fenola izražava se kao ekvivalenti galne kiseline, a ukupni sadržaj fenola izračunava se u skladu s jednadžbom standardne krivulje.

(2) Ispitivanje smanjenja [54]
Dodajte 1 {0 {0 μl, 2 {0 0μl, 300μl, 400 μl i 500 μl uzorka do 2,5 ml fosfatnog pufera s koncentracijom 0,2Mol/L i pHct ANT -a, a zatim dodajte 2,5 ml ATSANS 50 stupnjeva 30 minuta. Zatim dodajte 2,5 ml triklorooctene kiseline (w/v) s masnom koncentracijom od 10%, a centrifugiranje u 3000rpm u trajanju od 10 minuta u centrifugi velike brzine. Odmah nakon izlaska, odvedite 2,5 ml supernatanta u volumetrijsku tikvicu, dodajte 2,5 ml destilirane vode i 0,5 ml željeznog klorida (w/v) s masnom koncentracijom od 0,1%. Koristite destiliranu vodu kao praznu kontrolu i izmjerite apsorbanciju A na valnoj duljini 700Nm pomoću spektrofotometra. Snaga smanjenja moći može se prosuđivati ​​po vrijednosti apsorpcije. Što je veća vrijednost apsorpcije, to je jača smanjenje snage.

 

(3) Određivanje efekta čišćenja slobodnih radikala superoksida aniona [55]

Uzmite 4,5 ml 0. 0 5 mol/l pH 8,2 Tris-HCl međuspremnika i zagrijte ga u vodenoj kupki od 25 stupnjeva za 2 0 min. Dodajte 1 ml otopine uzorka enzima s koncentracijama od 10%, 20%, 30%, 40%i 50%i 0,4 ml otopine pirogalola od 25 mmol/l. Dobro promiješajte i reagirajte u vodenoj kupelji od 25 stupnjeva 5 minuta. Dodajte 1,0 ml 8 mol/L HCl da biste prekinuli reakciju. Koristite Tris-HCL međuspremnik kao referencu i upotrijebite spektrofotometar za mjerenje apsorpcije A pri valnoj duljini od 299 nm za izračunavanje brzine uklanjanja. Za praznu kontrolnu skupinu korišteno je 1 ml otapala umjesto uzorka. Brzina uklanjanja o 2- izračunata je prema formuli 3.1: o 2- brzina uklanjanja (%)=(a 1- a2)/a1 × 100 (3.1) gdje: a1 je apsorpcija praznog tuba; A2 je apsorbancija uzorka.

(4) Određivanje učinka čišćenja na hidroksilne radikale [56]

1 {0 0 μl, 200 μl, 300μl, 400 μl, 500 μl otopina uzorka dodana je s vodom u 2 ml, a zatim je dodana 1,4 ml vodikovog peroksida s koncentracijom molarne mase od 6mmol/L, a zatim je dodana s 0,6 ml mase sa 2 i molarom u obliku molara i molara s 2 i molarnom frisiranom u obliku molata i molara. 1,5MMOL/L, a zagrijava se u vodenoj kupelji s konstantnom temperaturom na 37 stupnjeva 1h. Podesite na nulu destiliranom vodom i izmjerite apsorbanciju A na valnoj duljini 562nm pomoću spektrofotometra. Izvršite 3 replike za svaki tretman. Izračunajte brzinu uklanjanja hidroksilnog radikala prema formuli 3.2: brzina uklanjanja hidroksilnog radikala (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.2) gdje je: a1 prosječna apsorbancija praznog; A2 je prosječna apsorpcija otopine uzorka. (5) Određivanje učinka uklanjanja slobodnih radikala DPPH [57]

Novo biljke Cistanche s mnogo više snage protiv oksidacije od fermentacije bakterija

 

Točno pipeta 2 ml otopine uzorka enzima s koncentracijama od 1 {0, 20%, 30%, 40%i 50%u volumetrijsku tikvicu od 10 ml, a zatim dodajte 2 ml 80%vodene otopine etanola DPPH u volumetrijsku tikvicu. Koncentracija molarne mase je 2 × 10-4 mol/l. Nakon miješanja, ostavite da stoji na sobnoj temperaturi 30 minuta. Koristeći 80% otopinu etanola kao referencu, izmjerite apsorbanciju uzorka na valnoj duljini od 517 nm, što je zabilježeno kao A1. Pomiješajte 2 ml otopine DPPH i 2 ml otopine etanola s masnom koncentracijom od 80% i izmjerite njihovu apsorbanciju pri istoj valnoj duljini, koja je zabilježena kao A0. Pomiješajte 2 ml otopine enzima i 2 ml otopine etanola s masnom koncentracijom od 80% i izmjerite njihovu apsorbanciju pri istoj valnoj duljini, koja je zabilježena kao A2. Izračunajte brzinu uklanjanja slobodnih radikala DPPH prema formuli 3.3:
DPPH stopa uklanjanja slobodnih radikala (%) {{{0}} [{1- (a 1- a2)/a 0] × 100 (3.3) gdje je: a1 2 ml dpph i etanol 80% ROLONSOUS ROZOMANCE I APRIBANCE APTUBANCE ARTBENCES 2 ml DPPH i Apsorbance Apsorbance Andle DPPH i Apsorbance Apsorbance Andle DPPH i Apsorbance Apsorbance od 2 ml DPPH i Apsorbant Atquous Atquanol ROCISME i Apsorbant Atquous Ap ili ML DPH A2 je apsorbancija miješane otopine 2 ml enzimske otopine i 2 ml 80% etanola masnom koncentracijom; A0 je apsorbancija miješane otopine 2 ml DPPH otopine i 2 ml 80% etanola masnom koncentracijom.

(6) ABTS sposobnost čišćenja slobodnih radikala [58]
Dodajte određenu količinu kalijevog sulfata u otopinu 7 mmol/L ABTS sve dok konačna koncentracija miješane otopine iznosi 2,45 mmol/L. Pomiješanu otopinu stavite na hladno i suho mjesto na sobnoj temperaturi 12 do 16 sati. 1 μl, 3 μl, 5μL, 7μL i 9 μl otopine uzorka nadopunjeni su u 10 μl s fosfatnim puferom od 5 mmol/L pH7.4, a zatim se ravnomjerno miješali s 10 ml gornjeg kalijevog sulfata i ABTS miješane otopine i omogućili da reagiraju na reakcijsku temperaturu od 30 stupnjeva i reakcijskog vremena. Nula s destiliranom vodom i izmjerite apsorbanciju A na valnoj duljini 734nm pomoću spektrofotometra. Izračunajte brzinu čišćenja slobodnih radikala ABTS prema formuli 3.4:
ABTS brzina uklanjanja slobodnih radikala (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.4) gdje: a1 je apsorbancija prazne kontrolne skupine; A2 je apsorbancija eksperimentalne skupine

 

3.2 Rezultati i analiza

3.2.1 Ukupni sadržaj fenola

(1) Standardna krivulja
Standardna krivulja ukupnog sadržaja fenola izvučena je koncentracijom galne kiseline kao vodoravne osi i vrijednost apsorpcije A kao okomita os, kao što je prikazano na slici 3.1.

 

Sl.3.1 Standardna krivulja ukupnog sadržaja fenola

Sa slike.3.1, možemo vidjeti da je standardna jednadžba krivulje y =11. 375x +0. 2593 (x je koncentracija uzorka, y je apsorbancija), r 2=0. 9981.

(2) Određivanje uzoraka

Rezultati ukupnog određivanja sadržaja fenola jabučnih enzima u kontrolnoj skupini i eksperimentalne skupine u različitim koncentracijama prikazani su na slici.3.2.

 

 

 

Sl.3.2 Krivulja ukupnog fenolnog sadržaja

Kao što je prikazano na slici.3.2, jabučni enzimi i u kontrolnoj skupini i u eksperimentalnoj skupini imaju visok ukupni fenolni sadržaj, a oba se povećavaju s povećanjem količine dodane otopine uzorka. U istom gradijentu koncentracije, ukupni fenolni sadržaj jabučnog enzima u kontrolnoj skupini povećao se s 0. 673mg na 2,8 0 7 mg, a ukupni fenolni sadržaj eksperimentalne skupine porastao je s 0,961 mg na 4,185 mg. Ukupni fenolni sadržaj eksperimentalne skupine mnogo je veći od kontrolne skupine, a trend uzlaznih je očigledniji. Prema ukupnom fenolnom sadržaju, cjelokupna antioksidativna aktivnost eksperimentalne skupine veća je od one u kontrolnoj skupini.

 

3.2.2 Smanjenje snage

Rezultati smanjenja određivanja snage enzima jabuka u kontrolnoj skupini i eksperimentalnoj skupini u različitim koncentracijama prikazani su na slici 3.3.

 

Kao što je prikazano na slici 3.3, promjenjivi trend smanjenja snage jabučnih enzima sličan je promjenjivom trendu ukupnog sadržaja fenola. Smanjenje snage eksperimentalne skupine veća je od one u kontrolnoj skupini, a bilo da se radi o eksperimentalnoj skupini ili kontrolnoj skupini, unutar raspona koncentracije prikazanog u eksperimentu, smanjena snaga pokazuje porast trenda s povećanjem količine dodane otopine uzorka. Eksperimentalni podaci također su potvrdili da je u smislu smanjenja snage antioksidativna aktivnost eksperimentalne skupine veća od one u kontrolnoj skupini.

 

 

3.2.3 Sposobnost uklanjanja slobodnih radikala superoksida

Rezultati superoksidnih aniona slobodnog radikala sposobnost čišćenja jabučnih enzima u kontrolnoj skupini i eksperimentalne skupine u različitim koncentracijama prikazani su na slici 3.4.

Kao što je prikazano na slici 3.4, velika je razlika u sposobnosti uklanjanja slobodnih radikala aniona superoksida između eksperimentalne skupine i kontrolne skupine. Unutar raspona koncentracije prikazanog u eksperimentu, sposobnost čišćenja slobodnog radikala superoksida aniona najvažnije mijenja se kada je koncentracija uzorka 10%do 20%, a promjena nije očita nakon što je koncentracija veća od 20%; Kad je koncentracija 50%, sposobnost čišćenja slobodnih radikala superoksida aniona je čak 85,4%. Sposobnost uklanjanja slobodnih radikala superoksida koju je pokazala kontrolna skupina može se jasno vidjeti s tablice trenda. Kako se koncentracija enzima povećava, ta sposobnost uklanjanja slobodnih radikala također se povećava, polako se mijenja i postupno se odnosi na stabilno stanje. Sposobnost uklanjanja doseže najviše 42,6%. Eksperimentalna skupina gotovo je dvostruko veća od kontrolne skupine.

 

 

3.2.4 Sposobnost uklanjanja hidroksilnih slobodnih radikala

Promjene sposobnosti uklanjanja hidroksilnih slobodnih radikala jabučnih enzima u kontrolnoj skupini i eksperimentalne skupine u različitim koncentracijama prikazane su na slici 3.5.

 

 

Sl.3.5 Krivulja uklanjanja hidroksil slobodnog radikala

 

Na slici 3.5 može se vidjeti da se unutar koncentracijskog raspona prikazanog u eksperimentu, sposobnost uklanjanja hidroksilnih slobodnih radikala enzima u eksperimentalnoj skupini i kontrolna skupina povećala s povećanjem dodane količine. Sposobnost uklanjanja hidroksilnih slobodnih radikala eksperimentalne skupine bila je niža od one u kontrolnoj skupini, a izvodila se vrlo loše u niskim koncentracijama. U visokim koncentracijama, sposobnost uklanjanja radikala hidroksilnih slobodnih radikala značajno se povećala. Razlog može biti taj što su tijekom procesa fermentacije tipovi i sadržaji mikroorganizama u jabučnim enzimima u eksperimentalnoj skupini i kontrolnoj skupini bili različiti, a sadržaj sekundarnih metabolita i komponenti svakog proizvoda proizvedenih fermentacijom bio je različit, pa je prikazani antioksidacijski kapacitet bio drugačiji.

 

3.2.5 DPPH · Sposobnost uklanjanja slobodnih radikala

U usporedbi s drugim metodama otkrivanja, DPPH · Sposobnost uklanjanja slobodnih radikala široko se koristi za procjenu antioksidacijske aktivnosti u kratkom vremenskom razdoblju [59]. Sposobnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH · U različitim koncentracijama prikazana je prema rezultatima kontrolne skupine i eksperimentalne skupine Apple enzima, kao što je prikazano na slici 3.6.

Kao što je prikazano na slici 3.6, kada je koncentracija Appleovog enzima u kontrolnoj skupini bila niža od 30%, sposobnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH · bila je manja od 50%, ali eksperimentalna enzim Applea također je pokazala veću sposobnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH · u niskim koncentracijama. Eksperimentalni rezultati pokazuju da je dodavanje Aspergillus oryzae, kvasca, termofilnog streptokoka i bugarskog laktobacilusa korisno za DPPH · Slobodni radikalni čišćenje sposobnosti enzima. Kad je koncentracija enzima 50%, ta je sposobnost čak 91,4%, što je mnogo veće od 69,8%kontrolne skupine u istoj koncentraciji.

 

3.2.6 ABTS kapacitet za uklanjanje radikala

Rezultati ABTS -ovog radikalnog kapaciteta za uklanjanje jabučnih enzima u kontrolnoj skupini i eksperimentalne skupine u različitim koncentracijama prikazani su na slici 3.7.

Sl.3.7 Krivulja ABTS radikalnog kapaciteta za uklanjanje
Na slici 3.7 može se vidjeti da je brzina uklanjanja enzima jabuka u eksperimentalnoj skupini veća kada je količina dodavanja enzima veća od 5 μl. Studija Erel i sur. pokazali su da kapacitet čišćenja radikala ABTS uglavnom ovisi o većoj koncentraciji fenolnih tvari [60]. Rezultati ukupnog određivanja sadržaja fenola pokazali su da je ukupni sadržaj fenola u eksperimentalnoj skupini bio veći od onog u kontrolnoj skupini. Eksperimentalni rezultati na slici 3.7 upravo su potvrdili da je kapacitet čišćenja radikala ABTS veći od one u kontrolnoj skupini.

 

3.3 Sažetak ovog poglavlja

Ovo poglavlje proučava odnos između antioksidacijske aktivnosti jabučnih enzima proizvedenih fermentacijom s četiri odabrana soja jabuka, koncentracije uzoraka enzima i usporedbe aktivnih komponenti antioksidanata i sposobnosti uklanjanja slobodnog radikala između eksperimentalne skupine i kontrolne skupine. Eksperimentalni rezultati pokazuju da je ukupni sadržaj fenola u Apple enzimu u kontrolnoj skupini niži od onog u eksperimentalnoj skupini, a njegova smanjena snaga, superoksidni anion slobodni radikal, DPPH slobodni radikal i ABTS sposobnost uklanjanja slobodnih radikala bolji su od onih u kontrolnoj skupini; Enzim u kontrolnoj skupini ima posebno dobru sposobnost uklanjanja hidroksilnih slobodnih radikala.
Općenito, eksperimentalna skupina pokazala je veću antioksidacijsku aktivnost, što je dodatno potvrdilo izvedivost umjetno dodavanja sojeva za izradu mikrobnih enzima. Na taj način, hrana mikrobnih enzima ima više tvari korisnih za zdravlje ljudi na temelju izvorne prirodne fermentacije i može se bolje razviti u smjeru koji ljudi očekuju.