Visoko-fosforna dijeta izaziva upregulaciju Bmp2 i Spp1 MRNA ekspresije u bubregu štakora

Hiroshi Matsuzaki, Kikue Mori, Shinichi Katsumata 

Kako bismo razjasnili mehanizam razvoja nefrocijalcinoze izazvane prehranom s visokim udjelom fosfora (P), usredotočili smo se na proteine povezane s kostima kao što su koštani morfogenetski protein 2 i osteopontin. Ova studija je istraživala učinke dijete s visokim brojem P na mRNA ekspresiju Bmp2 i Spp1 kod štakorabubreg. Wistar štakori bili su podijeljeni u dvije skupine i hranili su se kontrolnom prehranom (kontrolna skupina) ili dijetom s visokim brojem P (skupina s visokim brojem P).Bubregkoncentracije kalcija i P značajno su povećane u skupini s visokim brojem P u usporedbi s kontrolnom skupinom. MRNA izraz Bmp2 i Spp1 značajno je povećan u skupini s visokim P u usporedbi s kontrolnom skupinom. Ovi rezultati pokazuju da dijeta s visokim udjelom P izaziva upregulaciju Bmp2 i Spp1 mRNA ububreg.

Ključne riječi: dijeta s visokim udjelom fosfora, nefrokacinoza, Bmp2, Spp1,bubregštakor

Za više informacija obratite se na:emily.li@wecistanche.com

cistanche za liječenje bolesti bubrega

Uvod

Nefrocalcinoza je poremećaj karakteriziran naslagama kalcija (Ca) u bubrežnom parenhimu. Prehrambeni fosfor (P), osobito, ključni je čimbenik u razvoju ovog poremećaja. Pokazalo se da primjena visoko-P dijete rezultira povećanom koncentracijom Ca ububregi Ca naslage u bubrežnom parenhimu1-6). Iako je učinak visoko-P dijete na razvoj nefrokacinoze bio u središtu tekućeg istraživanja, malo se zna o mehanizmu odgovornom za razvoj ovog poremećaja. Stoga je potrebno pravovremeno rješavanje ovog pitanja.

Izvijestili smo da su nakon histološkog pregleda pomoću transmisijske elektronske mikroskopija uočeni kristali u obliku hidroksiapatita igle u bubrežnim tubulama štakora hranjenih dijetom visokog P6, 7). Rendgenska mikroanaliza pokazala je da se Naslage Ca izazvane dijetom s visokim brojem P uglavnom sastoje od Ca i P7). Ovi rezultati otkrili su da su Ca naslage izazvane prehranom s visokim brojem P oblik hidroksiapatita. Na temelju tog nalaza utvrđujemo da je razvoj nefrokacinoze kontroliran mehanizmom sličnim onom u formiranju kostiju. Stoga se ova studija usredotočila na proteine povezane s kostima kao što su koštani morfogenetski protein 2 (BMP2). BMP2 je osteogeni faktor koji pokazuje aktivnost izazivanja osteogeneze8, 9).  Važno je napomenuti da je BMP2 identificiran kao čimbenik koji izaziva ektopikukostformacija10, 11）.  Dakle, pretpostavili smo da ako BMP2 igra važnu ulogu u razvoju nefrocijalcinoze, ekspresija ovog proteina ububregbi bila upregulirana dijetom s visokim brojem P. Cilj ove studije bio je utvrditi utječe li prehrana s visokim udjelom P na mRNA ekspresiju Bmp2 ububreg.

U međuvremenu, naša prethodna studija izvijestila je da prehrana s visokim udjelom P podiže ekspresiju osteopontina (OPN) u bubrežnim tubulama pomoću imunohistokemijske analize, što sugerira da OPN može biti uključen u razvoj Ca naslaga izazvanih dijetom s visokim brojem P12).  Stoga smo istražili promjene u izrazu Spp1 mRNA ububregtakođer.

Rezultati ove studije mogu pružiti vrijedan uvid u mehanizam odgovoran za razvoj nefrocijalcinoze izazvane prehranom s visokim brojem P.

Materijali i metode

Životinje i dijete.

Ovu studiju odobrio je Odbor za uporabu životinja Tokijskog sveučilišta u poljoprivredi, a sve su životinje održavane u skladu sa smjernicama sveučilišta za njegu i uporabu laboratorijskih životinja (Odobrenje br. 300049).

Važno je napomenuti da ženski štakori razvijaju nefrokacinozu spremnije od muških štakora13, 14).  Osim toga, izvijestili smo da dijeta s visokim udjelom P povećava ekspresiju OPN-a u bubrežnim tubulama ženskih štakora12). Ova studija tada je koristila ženske štakore kao eksperimentalne životinje. Četverotjedne ženke Wistar štakora (Clea Japan, Tokio, Japan) bile su smještene u pojedinačnim kavezima od žice od nehrđajućeg čelika.  Tijekom eksperimentalnog razdoblja kavezi su se nalazili u prostoriji s kontroliranom rasvjetom pod svjetlom od 12 h: tamni ciklus (svjetlo, 0800-2000 h), temperatura od 22 ± 1 ° C i relativna vlažnost od 60% do 65%.

Sastav eksperimentalne prehrane prikazan je uTable 1. Eksperimentalna prehrana pripremljena je u odnosu na AIN-93G dijetu15). Eksperimentalna prehrana sadržavala je dvije različite koncentracije P (kontrolna prehrana, 0,3%; dijeta s visokim brojem P, 1,5%). Koncentracija P u dijeti s visokim udjelom P postavljena je na 1,5% budući da su naše prethodne studije primijetile da dijetalna koncentracija P od 1,5% izaziva

teška nefrozalcinoza6, 7, 12, 14)i visoka opn ekspresija12). Sve eksperimentalne dijete imale su istu koncentraciju Ca (0,5%). Koncentracije P i Ca, kako je utvrđeno analizom eksperimentalne prehrane, prikazane su uTable 1. Prije početka studije, svi štakori su aklimatizirani 7 dana, a za to vrijeme im je omogućen slobodan pristup kontrolnoj prehrani i deioniziranoj vodi. Nakon razdoblja aklimatizacije, štakori su nasumično podijeljeni u dvije skupine sa sličnim srednjim tjelesnim težinama i hranjeni ili kontrolnom prehranom (kontrolna skupina) ili prehranom s visokim brojem P (skupina s visokim brojem P) tijekom 14 dana. Štakorima je omogućen slobodan pristup dodijeljenoj eksperimentalnoj prehrani i deioniziranoj vodi tijekom eksperimentalnog razdoblja. Na kraju eksperimentalnog razdoblja štakori su eutanazirani intraperitonealnom injekcijom anestetičke smjese (medetomidin, midazolam i butorfanol), te krvi ibubreguzorci su prikupljeni za analizu. Uzorci krvi su centrifugirani, a supernacionalni otrovi korišteni su kao uzorci seruma. Bubrezi su uklonjeni i bubrežna kapsula je odbačena. Serum ibubreguzorci su pohranjeni na -80°C dok nije bilo potrebno za analizu. Desni bubreg korišten je za kvantitativnu analizu Bmp2 i Spp1 mRNA, a lijevibubregkorišten je za analizu koncentracija Ca i P.

Analiza minerala.

Uzorci eksperimentalne prehrane ibubrezipepeo na 550°C za 48 h u prigušnoj peći, a minerali su izvađeni u 1 mol/L HCl za analizu. Ca koncentracije u eksperimentalnim dijetama ibubreziodređeni su atomskom apsorpcijskom spektrofototometrijom16). Koncentracije P u eksperimentalnim dijetama ibubrezianalizirani su metodom Gomori17).

Kvantitativna analiza Bmp2 i Spp1 mRNA.

Ukupna RNA izolirana je iz homogeniziranog bubrega pomoću TRIzol reagensa (Life Technologies, CA, SAD) prema specifikacijama proizvođača. Količina i čistoća RNK procijenjeni su pomoću NanoDropa 2000c (Thermo Fisher Scientific, MA, SAD). cDNA je sintetiziran pomoću SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMixa za qRT-PCR (Life Technologies), a zatim je podvrgnut kvantitativnom RT-PCR-u u stvarnom vremenu pomoću SYBR Select Master Mix (Life Technologies). Specifični prajmeri18-20)korišteni su za analizu Bmp2 (naprijed, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; obrnuto, 5'-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3'), Spp1 (naprijed, 5'-TGAGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3'; obrnuto, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3') i Gapdh (naprijed, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3'; obrnuto, 5'-GCAT-CACCCCATTTTTGATGTTGTT-3'). PCR reakcija u stvarnom vremenu izvedena je pomoću StepOne PCR sustava u stvarnom vremenu (Applied Biosystems, CA, USA), a razine mRNA ekspresije normalizirane su na gapdh mRNA razine. Vrijednost kontrolne skupine smatrana je 1,00.

Statistička analiza.

Rezultati su prikazani kao sredstvo ± SEM za svaku skupinu od 6 štakora. Nakon provedenog F-testa kako bi se utvrdila homogenost varijanca, studentov t-test korišten je za određivanje značajnih razlika između dviju skupina. Ako homogenost varijance nije bila jednaka, umjesto Studentovog t-testa korišten je Welchov t-test. Razlike su se smatrale značajnima pri p <>

Rezultati

Tjelesna težina, unos hrane i analiza seruma.

Konačna tjelesna težina i unos hrane značajno su smanjeni u skupini s visokim brojem P u usporedbi s kontrolnom skupinom (Stol 2).Bubregtežina i koncentracije minerala.Bubregmokri i suhi utezi značajno su povećani u skupini s visokim brojem P u usporedbi s kontrolnom skupinom (Stol 3).BubregKoncentracije Ca i P također su značajno povećane u skupini s visokim P u usporedbi s kontrolnom skupinom.

Bubrežni Bmp2 i Spp1 mRNA izraz.

Razine Bmp2 mRNA u skupini s visokim P znatno su povećane u usporedbi s kontrolnom skupinom (Smokva.1A).  mRNA ekspresija Spp1 također je značajno povećana u skupini s visokim brojem P u usporedbi s kontrolnom skupinom (Smokva. 1B).

Diskusija

Jedan od poznatih fizioloških učinaka visoko-P dijete je razvoj nefrocijalcinoze. U ovoj studiji koncentracije bubrega Ca i P povećane su u skupini s visokim P u usporedbi s kontrolnom skupinom, što je u skladu s rezultatima prethodnih studija1-6).  Prethodna istraživanja izvijestila su da su histološki rezultati nefrocijalcinoze pozitivno povezani s koncentracijama bubrega Ca i P4, 21). Dakle, iako u ovoj studiji nije provedeno histološko promatranje bubrega, povećane koncentracije bubrega Ca i P ukazuju na to da je nefrocijalcinoza izazvana prehranom s visokim udjelom P.

Budući da se ca naslage izazvane prehranom s visokim udjelom P općenito smatraju oblikom hidroksiapatita6, 7), pretpostavili smo da se razvoj nefrocijalcinoze kontrolira mehanizmom sličnim onom osteo geneze. Tako smo ispitali učinke visoko-P dijete na ekspresiju Bmp2 mRNA u bubregu. Rezultati

pokazala je da je bubrežna ekspresija Bmp2 mRNA povećana u skupini s visokim brojem P i da dijeta s visokim brojem P izaziva upregulaciju ekspresije Bmp2 mRNA u bubregu. Ovo otkriće može pomoći u uzimanju u obzir mehanizma razvoja nefrocijalcinoze izazvanog prehranom s visokim brojem P. Iako nedostaju konačni dokazi koji podupiru našu hipotezu, jedna od mogućnosti je da je ekspresija osteogenih transkripcijskih čimbenika povišena u kalcificiranim regijama bubrega. BMP2 izaziva diferencijaciju osteoblasta i stvaranje kostiju reguliranjem osteogenih transkripcijskih čimbenika kao što su Osterix, Runx2 i Msx28, 9); stoga BMP2 može promicati nefrocijalcinozu regulacijom takvih osteogenih transkripcijskih čimbenika.  Trenutno, detaljna uloga BMP2 u razvoju nefrocijalcinoze ostaje nejasna. Osim toga, budući da je u ovoj studiji izmjerena samo ekspresija Bmp2 mRNA, nije poznato postoji li razlika u ekspresiji BMP2 proteina. Međutim, naši rezultati sugeriraju mogući mehanizam kojim promjene u ekspresiji BMP2 igraju snažnu ulogu u patogenezi visoko-P dijete izazvane nefrocijalcinozom.

Ova studija bila je usredotočena na izraz Spp1 mRNA uz izraz Bmp2 mRNA. Naša prethodna studija koja je koristila imunohistokemijsku analizu pokazala je visoku razinu ekspresije OPN-a u bubrežnim tubulama štakora hranjenih dijetom visokog P12). Ova studija je pokazala da je izraz Spp1 mRNA povećan za otprilike 10 puta u skupini s visokim P. Rezultati sadašnjih i prethodnih studija otkrivaju da dijeta s visokim p izaziva ekspresiju OPN-a u bubregu. S druge strane, drugi istraživači su pokazali da je OPN kao kamena matrica važan čimbenik u stvaranju mokraćnog kamenja22, 23);  stoga je prethodno izvješće Suda sugeriralo da OPN može imati ulogu komponente matrice u formiranju Ca naslaga izazvanih prehranom s visokim brojem P12). Međutim, Paloian i sur. nedavno su izvijestili da OPN igra ulogu u prevenciji nefrokacinoze izazvane prehranom visokog P-a kod OPN KO miševa24). Naime, čini se da je fiziološka uloga OPN-a na nefrocijalcinozi izazvanoj prehranom visoko P supresija, a ne promicanje kalcifikacije ububreg. Štoviše, opisana su prethodna izvješća da se razine OPN-a povećavaju kako bi se nadoknadila daljnja patološka ektopična kalcifikacija ububrega vaskulatura kao OPN je upregulirana na mjestu patološke kalcifikacije.

Kao što je već spomenuto, ova studija sugerirala je važnost BMP2 i OPN-a u visoko-P dijeta izazvanoj nefrocijalcinozom. Važno je napomenuti da se smatra da su učinci BMP2 i OPN-a na razvoj nefrokacinoze regulirani različitim mehanizmima.  Ove mehanističke razlike mogu ukazivati na to da je temeljni mehanizam nefrokacinoze kompliciran. 　Sljedeća stvar koju treba uzeti u obzir je da je inhibicija rasta možda utjecala na ekspresiju Bmp2 i Spp1 mRNA ububregjer je ova studija primijetila smanjenje konačne tjelesne težine u skupini s visokim P. Opažanja u našim prethodnim 12) i sadašnjim studijama mogu pomoći u razmatranju ove točke. Prethodno smo izvijestili o povećanoj ekspresiji OPN proteina u bubrežnim tubulama štakora čiji je rast

nije inhibiran prehranom s visokim brojem P12). Štoviše, ova studija pokazala je inhibiciju rasta u skupini s visokim P, ali visoku razinu ekspresije Spp1 mRNA u bubregu. Na temelju tih opažanja, čini se da ova studija ima mali učinak inhibicije rasta ekspresije Bmp2 i Spp1 mRNA. Međutim, detalji odnosa između inhibicije rasta i ekspresije gena Bmp2 i Spp1 ostaju nejasni. Stoga su potrebne daljnje istrage kako bi se razjasnila ta točka.

Zaključno, kako bi se razjasnio mehanizam razvoja nefrocijalcinoze izazvane prehranom s visokim udjelom P, ova studija utvrdila je učinke prehrane s visokim udjelom P na ekspresiju Bmp2 i Spp1 mRNA ububreg.  Koncentracije bubrega Ca i P značajno su povećane u skupini s visokim brojem P u usporedbi s kontrolnom skupinom. Nadalje, mRNA ekspresija Bmp2 i Spp1 značajno je povećana u skupini s visokim P u usporedbi s kontrolnom skupinom. Ovi rezultati pokazuju da prehrana s visokim udjelom P potiče upregulaciju ekspresije Bmp2 i Spp1 mRNA ububreg.

Reference

1) Hitchman AJ, Ima bilo koji SA, Hitchman A, Harrison JE, Tam C: Bubrežna kalcifikacija izazvana fosfatom kod štakora. Može li J Physiol Pharmacol 57: 92-97, 1979

2) Parker HE: Magnezij i fosforni međuodnosi u adekvatnoj do prekomjernoj razini prehrambenog fosfora. Nutr Rep Int 32: 1311-1318, 1985

3) Ritskes-Hoitinga J, Lemmens AG, Danse LHJC, Beynen AC: Fosforom izazvana nefrokalcinoza i funkcija bubrega kod ženskih štakora. J Nutr 119: 1423-1431, 1989

4) Cockell KA, L'Abbe MR, Belonje B: Koncentracije i omjer kalcija i fosfora u prehrani utječu na razvoj nefrokacinoze kod ženskih štakora. J Nutr 132: 252-256, 2002

5) Katsumata S, Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K : Učinci dodatka kalcija u prehrani na metabolizam kostiju, koncentracije minerala u bubrezima i funkciju bubrega kod štakora hranjenih prehranom s visokim udjelom fosfora. J Nutr Sci Vitaminol 61: 195-200, 2015

6) Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K, Liu Q-L, Sato S, Kanke Y, Goto S : Dijeta visokog fosfora brzo in- duces nefrocijalcinoza i proksimalna cjevasta ozljeda kod štakora. J Nutr Sci Vitaminol 43: 627-641, 1997

7) Liu Q-L, Sato S, Kishikawa T, Matsuzaki H, Yamanaka N: Učinkovitost tradicionalne kineske medicine, Wulingsan, u suzbijanju razvoja nefrocijalcinoze izazvane prehranom visokim fosforom kod mladih štakora. Med Electron Microsc 34: 103-114, 2001

8) Sirard C, Kim S, Mirtsos C, Tadićh P, Hoodless PA, Its A, Maxson R, Wrana JL, Mak TW: Ciljana dis- rupcija u stanicama murina otkriva varijabilni zahtjev za Smad4 u transformaciji faktora rasta β signalizacije. J Biol Chem 275: 2063-2070, 2000

9) Matsubara T, Kida K, Yamaguchi A, Hata K, Ichida F, Meguro H, Aburatani H, Nishimura R, Yoneda T: BMP2 regulira Osterix kroz Msx2 i Runx2 tijekom osteoblast diferencijacije. J Biol Chem 283: 29119-29125, 2008

10) Urist MR: Kost: Formiranje autoindukcijom. Znanost 150: 893-899, 1965

11) Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, Hewick RM, Wang EA: Novi regulatori formiranja kostiju: Molekularni klonovi i aktivnosti. Znanost 242: 1528-1534, 1988

12) Matsuzaki H, Katsumata S, Uehara M, Suzuki S, Miwa M: visoko-fosforna dijeta izaziva ekspresiju osteopontina bubrežnih tubula kod štakora. J Clin Biochem Nutr 41: 179-183, 2007

13) Cousins FB, Geary CPM: Spolno određena bubrežna kalcifikacija kod štakora. Priroda 211 : 980-981, 1966

14) Matsuzaki H, Katsumata S, Masuyama R, Uehara M, Nakamura K, Suzuki K: Spolne razlike u koncentracijama minerala u bubrezima i izlučivanju urinarnog albumina kod štakora kojima se daje visoko-fosforna hrana. Biosci biotehnol Biochem 66: 1737-1739, 2002

15) Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr: AIN-93 pročišćena prehrana za laboratorijske glodavce: Završno izvješće ad hoc odbora za pisanje Američkog instituta za prehranu o reformulaciji prehrane glodavaca AIN-76A. J Nutr 123: 1939-1951, 1993

16)Gimblet EG, Marney AF, Bonsnes RW: Određivanje kalcija i magnezija u serumu, urinu, prehrani i stolici spektrofotometrijom atomske apsorpcije. Clin Chem 13 : 204-214, 1967

17)Gomori G: Modifikacija kolorimetrijskog određivanja fosfora za uporabu s fotoelektričnim kolorimetrom. J Lab Clin Med 27: 955-960, 1942

18) Ming LG, Lv X, Ma XN, Ge BF, Zhen P, Song P, Zhou J, Ma HP, Xian CJ, Chen KM: Prenyl skupina doprinosi aktivnostima fitoestrogena 8-prenynaringenin u poboljšanju stvaranja kostiju i inhibiranju resorpcije kostiju in vitro. Endokrinologija 154: 1202-1214, 2013

19)Kreke MR, Huckle WR, Goldstein AS: Protok tekućine potiče ekspresiju osteopontina i koštanog sialoproteina stromalnim stanicama koštane srži na vremenski ovisan način. Kost 36: 1047-1055, 2005

20)Drechsler J, Grotzinger J, Hermanns HM: Karakterizacija kompleksa receptora štakora onkostatin M koji podsjeća na čovjeka, ali se razlikuje od receptora citokina murina. PLoS One 7 : e43155, 2012

21)Hoek AC, Lemmens AG, Mullink JWMA, Beynen AC: Utjecaj kalcija u prehrani: omjer fosfora na izlučivanje minerala i nefrocalcinozu kod ženskih štakora. J Nutr 118: 1210-1216, 1988 

22) Kohri K, Suzuki Y, Yoshida K, Yamamoto K, Amasaki N, Yamate T, Umekawa T, Iguchi M, Shinohara H, Kurita T: Molekularno kloniranje i sekvenciranje cDNA kodiranja proteina mokraćnog kamena, koji je identičan osteopontinu. Biokemijska biofizija Res Commun 184: 859-864, 1992

23)Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, Nagata T, Yoshioka K, Iguchi M, Yamate T, Umekawa T, Suzuki Y, Shinohara H, Kurita T: Struktura i ekspresija mRNA kodiranja proteina mokraćnog kamena (Osteopontin). J Biol Chem 268: 15180-15184, 1993

24)Paloian NJ, Leaf EM, Giachelli CM: Osteopontin pro-testovi protiv visoke fosfat-inducirane nefrocijalcinoze i vaskularne kalcifikacije. Bubrežni int 89: 1027-1036, 2016

25)Giachelli CM, Bae N, Almeida M, Denhardt DT, Alpers CE, Schwartz SM: Osteopontin je povišen tijekom stvaranja neointima u štakorskim arterijama i nova je komponenta ljudskih aterosklerotskih plakova. J Clin Invest 92: 1686-1696, 1993