Echinacoside poništava remodeliranje miokarda i poboljšava rad srca

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang 2

Sažetak

Remodeliranje miokarda važna je patološka osnova srčanog srca, mitohondrijski oksidativni stres je promotor hipertrofije miokarda, fibroze i apoptoze. ECH je glavna aktivna komponenta tradicionalnog kineskog lijeka Cistanches Herba, mnoštvo studija pokazuje da posjeduje snažan antioksidativni kapacitet u živčanim stanicama i tumorima, inhibira mitohondrijski oksidativni stres, štiti funkciju mitohondrija, ali je specifični mehanizam nejasan. SIRT1/FOXO3a/MnSOD je važna antioksidacijska osovina, studija otkriva da se ECH kovalentno veže na SIRT1 kao ligand i regulira ekspresiju SIRT1 u moždanim stanicama. Pretpostavljamo da ECH može preokrenuti remodeliranje miokarda i poboljšati srčanu funkciju HF-a putem regulacije signalne osi SIRT1/FOXO3a/MnSOD i inhibicije mitohondrijskog oksidativnog stresa u kardiomiocitima. Ovdje prvo induciramo stanični model oksidativnog stresa ISO s AC-16 stanicama i prethodno tretiramo s ECH, razinom mitohondrijskog ROS-a, oksidativnom ozljedom mtDNA, MMP-om, karboniliranim proteinom, peroksidacijom lipida, unutarstaničnim ROS-om i apoptoze, potvrđuju učinak ECH-a na mitohondrijski oksidativni stres i funkcioniraju in vitro. Zatim uspostavljamo HF model štakora induciran s ISO i prethodno tretiramo s ECH. Mjere se indeksi srčane funkcije, remodeliranja miokarda, oksidativnog stresa i funkcije mitohondrija, ekspresije signalne osi SIRT1/FOXO3a/MnSOD, podaci pokazuju da ECH poboljšava rad srca, inhibira hipertrofiju miokarda, fibrozu i apoptozu, povećava ekspresiju SIRT1/FOXO3a/ MnSOD signalna os, smanjuje oksidativna oštećenja mitohondrija, štiti funkciju mitohondrija. Zaključujemo da ECH poništava remodeliranje miokarda i poboljšava srčanu funkciju putem pojačane regulacije osi SIRT1/FOXO3a/MnSOD i inhibicije mitohondrijskog oksidativnog stresa u HF štakora.

KLJUČNE RIJEČi sehinakozid, zatajenje srca, mitohondrijski oksidativni stres, remodeliranje miokarda

svježe začinsko bilje cistanchedomitohondrijski oksidativni stres

1|UVOD

Zatajenje srca (ZS) krajnji je ishod većine kardiovaskularnih bolesti s visokom prevalencijom i lošom prognozom, a s otežavajućim trendom starenja stanovništva, hospitalizacija i smrtnost zbog kroničnog zatajenja srca (ZZS) naglo su porasli diljem svijeta.1 Tijekom proteklih 20 godina lijekovi za liječenje srčane insuficijencije postigli su velik napredak, no učinak je vrlo ograničen pa su novi lijekovi hitno potrebni. Remodeliranje miokarda je važna patološka osnova srčanog zastoja i karakterizira ga hipertrofija miokarda, apoptoza, intersticijalna fibroza, miokardijalne stanice su dezorganizirane i dovode do smanjenja ejekcijske frakcije (LVEF), povećanja end-dijastoličkih i sistoličkih dimenzija lijeve klijetke (LVIDd i LVIDs), i smanjenje frakcijskog skraćivanja lijeve klijetke (LVFS).2 Ali mehanizmi koji leže u pozadini još uvijek nisu u potpunosti shvaćeni. Posljednjih su godina brojne studije potvrdile da je oksidativni stres važan promotor remodeliranja miokarda.3-7

Oksidativni stres je stanje u kojem se prekomjerno stvaraju reaktivne kisikove vrste (ROS) ili slobodni radikali i dovode do oksidativnog oštećenja staničnih komponenti, što zauzvrat uzrokuje staničnu disfunkciju.8Mitohondriji su glavni izvor unutarstaničnog ROS-a, kao rezultat curenje iz respiratornog transportnog lanca elektrona, a mitohondriji su najosjetljiviji položaj na učinke ROS-a.9 Studije o HF-u identificirale su povećano stvaranje ROS-a iz kompleksa I respiratornog lanca.8 Povećana proizvodnja ROS-a prvo napada komponente mitohondrija i rezultira prekomjernim oksidativnim stresom , očituje se kao karbonilacija proteina, peroksidacija lipida i oštećenje DNA,10 te disfunkcija mitohondrija, što posljedično dovodi do prekomjernog stvaranja ROS,8 čini začarani krug. Dokazano je da trajni oksidativni stres može uzrokovati hipertrofiju miokarda i fibrozu miokarda11-13 i uzrokovati apoptozu miokardijalnih stanica kroz aktivaciju apoptoze ovisne o mitohondrijima kao rezultat karbonilacije proteina mitohondrijske membrane i gubitka potencijala mitohondrijske membrane.14 Dakle , smatra se da bi inhibicija mitohondrijskog oksidativnog stresa mogla biti nova strategija za sprječavanje remodeliranja miokarda, pa čak i srčanog udara.15-17

Echinacoside (ECH), prirodni feniletanoidni glikozid, glavna je aktivna komponenta Cistanches Herba, tradicionalne kineske medicine. Posljednjih godina, ECH je opsežno proučavan u živčanom sustavu i tumorima, a objavljeno je da posjeduje različite farmakološke učinke, poput antioksidativnih, protuupalnih, anti-apoptoznih i antitumorskih svojstava.18,19In živčanih stanica, ECH značajno pojačava antioksidativni kapacitet, smanjuje proizvodnju ROS-a, poboljšava potencijal mitohondrijske membrane (MMP) i povećava vitalnost stanica,20 pokazuje zaštitne učinke na funkciju mitohondrija i inhibira mitohondrijski oksidativni stres, štiti od oksidativnih ozljeda i poboljšava pamćenje, na kraju sprječava neurodegeneracija.21,22 ECH također povećava aktivnost SOD i igra zaštitnu ulogu u moždanom tkivu i tkivu retine,19,23 ali specifični mehanizam njegovog antioksidativnog učinka nije jasan.

SIRT1 je usko povezan s oksidativnim stresom, a signalna os SIRT1/FOXO3a/MnSOD je najvažnija antioksidacijska os i odgovorna je za suzbijanje mitohondrijskog oksidativnog stresa, MnSOD se široko distribuira u mitohondrijima i primarno je odgovoran za čišćenje mitohondrijskih ROS, stoga inhibirajući oksidativni stres, spojevi koji aktiviraju ovu antioksidacijsku osovinu mogu inhibirati oksidativni stres.24,25 Nedavne studije su pokazale da ECH ispoljava svoje farmakološke učinke putem regulacije višestrukih signalnih putova, kao što su p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads , i signalni put SIRT1.26-29 nova studija otkriva da se ECH kovalentno veže za SIRT1 kao ligand i pojačava ekspresiju SIRT1 u moždanim stanicama.26 Sugerira da ECH može inhibirati mitohondrijski oksidativni stres u kardiomiocitima i preokrenuti miokardiju preuređenje. Međutim, istraživanja o učincima ECH usredotočena su na živčani sustav ili tumor, učinci i mehanizmi ECH na mitohondrijski oksidativni stres u kardiomiocitima i remodeliranje miokarda ostaju nepoznati. Ovdje prvo induciramo stanični model oksidativnog stresa pomoću ISO-a i potvrđujemo učinak ECH na mitohondrijski oksidativni stres i funkciju in vitro. Zatim uspostavljamo model HF štakora izazvan ISO-om i pokazujemo da ECH poništava remodeliranje miokarda i poboljšava srčanu funkciju putem pojačane regulacije signalne osi SIRT1/FOXO3a/MnSOD i inhibicije mitohondrijskog oksidativnog stresa u HF štakora. Rezultati su namijenjeni pružanju eksperimentalnih dokaza za razvoj novih lijekova za sprječavanje zatajenja srca.

2|MATERIJALI I METODE

2.1|Kultura stanica i liječenje

AC16 stanice su kupljene od Bena Culture Collection. Stanice se održavaju u Dulbecco modificiranom Eagleovom mediju (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, SAD) s dodatkom od 10 posto fetalnog goveđeg seruma (10 posto FBS; Gibco) u T-75 tikvicama (Corning Glassworks, Corning, NY, SAD). Uvjeti se održavaju na 37 stupnjeva u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5 posto CO2. Kada stanice dostignu 70 posto -80 posto konfluentnosti, stanice skupine ISO (Sigma, SAD) inkubiraju se s medijem koji sadrži 10 uM ISO (Sigma, SAD) 24 sata, stanice skupine ECH prethodno se tretiraju s 50 uM ECH (MCE , SAD) za 30 minuta prije ISO izlaganja. Kontrolne ćelije (Ctrl) ne tretiraju se ništa.

cistanche na prodajuekstrakt

2.2|Detekcija mitohondrijske razine ROS pomoću luminolske kemiluminiscencije

Mitohondriji su izolirani i pročišćeni iz AC-16 stanica pomoću Mitochondria Isolation Kit (Sigma, SAD) prema uputama proizvođača. Koncentracije proteina određuju se kompletom za analizu proteina BCA (Biotech). Razina mitohondrijskog ROS-a detektira se luminalom (3-aminoftalni hidrazid 5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindion) pomoću kompleta Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, SAD), reagira s ROS-om i uzrokuje emisiju fotona, što je vrpca spektra s vrhom na oko 460 nm, a jedinica relativne svjetlosti (RLU) detektira se instrumentom za mjerenje kemiluminiscencije i pretvara u RLU/ug mitohondrijski protein.

2.3|8-OHdG se koristi za procjenu oksidativnog oštećenja mitohondrijske DNA

Oksidativno oštećenje mitohondrijske DNK procjenjuje se otkrivanjem sadržaja 8-hidroksi-2-deoksigvanozina (8-OHG). Pročišćeni mitohondriji u stanicama izoliraju se korištenjem kompleta za izolaciju mitohondrija kao što je gore navedeno (Sigma). Koncentracije proteina određuju se kompletom za analizu proteina BCA (Biotech). Zatim se odvajaju kako bi se odredila razina 8-OHdG pomoću kompleta Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, SAD) prema uputama proizvođača. Apsorpcija promjene boje mjeri se spektrofotometrom na valnoj duljini od 450 nm. Koncentracija 8-OHdG u uzorcima zatim se određuje usporedbom OD uzoraka sa standardnom krivuljom i pretvara u ng/ml.

2.4|Mjerenje MMP pomoću JC-1

Mitohondriji su izolirani i pročišćeni od AC-16, a koncentracija proteina je određena kao što je gore navedeno. Zatim se mitohondriji resuspendiraju u koncentraciji od 1 mg/ml, MMP se mjeri korištenjem JC-1 kompleta za ispitivanje prema uputama proizvođača. Intenzitet fluorescencije mjeren je na valnoj duljini ekscitacije: 490 nm, prorez 5 nm, valna duljina emisije: 590 nm, prorez 5 nm instrumentom spektrofotometar,30 rezultati su predstavljeni kao FLU/ugP.

2.5|Detekcija apoptotskih stanica protočnom citometrijom u AC-16 stanicama

Protočna citometrija koristi se za procjenu stanične apoptoze. Annexin V-FITC/PI pribor za detekciju apoptoze (CWBIO, Kina) koristi se za detekciju apoptotičnih i nekrotičnih stanica prema uputama dobavljača. Apoptoza u ranom stadiju, apoptoza ili nekroza u kasnom stadiju, stanični ostaci i žive stanice identificiraju se kao aneksin V ( plus )/PI (−), aneksin V ( plus )/PI ( plus ), aneksin V (−)/PI ( plus ) odnosno aneksin V (−)/PI (−). Intenziteti fluorescencije analiziraju se pomoću protočnog citometra (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, SAD). Svaki eksperiment se ponavlja 3 puta.

2.6|Procijenjen unutarstanični ROS protočnim citometrom

Nakon tretmana, stanice su tripsinizirane, isprane dva puta s PBS. Stanice su zatim resuspendirane u PBS-u, obojene s DCFH-DA (Beyotime, Kina) u konačnoj koncentraciji od 1 μM i inkubirane 1 h na 37 stupnjeva u inkubatoru s CO2, a zatim testirane u protočnom citometru pri 488 nm ekscitaciji . Intenzitet fluorescencije predstavlja razinu unutarstaničnog ROS-a.

2.7|Ispitajte sadržaj karbonilnih proteina u mitohondrijima AC-16 stanica

Nakon tretmana, pročišćeni mitohondriji se izoliraju i soniciraju na ledu i tretiraju se s 1 posto streptomicin sulfata da se talože mitohondrijske nukleinske kiseline, određuje se koncentracija proteina. Sadržaj karbonilnih proteina testiran je pomoću kompleta Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, SAD) na temelju derivatizacije karbonilne skupine s dinitrofenilhidrazinom (DNPH), prema uputama kompleta, OD se mjeri čitačem mikropločica i pretvara u nmol/ mg proteina usporedbom sa standardnom krivuljom.

2.8|Određivanje razine peroksidacije lipida u mitohondrijima AC-16 stanica

Nakon tretmana, stanice se skupljaju i liziraju, mitohondriji se izoliraju i pročišćavaju, te razbijaju ultrazvukom, koncentracija proteina se određuje BCA proteinskim testom (Biotech), lipidna peroksidacija se određuje razinom malondialdehida (MDA) putem TBARS testa , korištenjem kompleta (Nan jing Jian cheng, Kina) i razina MDA mjeri se prema protokolu proizvođača. OD se detektira na 586 nm pomoću čitača mikropločica i pretvara u μmol/g proteina usporedbom sa standardnom krivuljom.

2.9|Životinje i liječenje

Mladi mužjaci Sprague-Dawley štakora težine 120-140g nabavljeni su iz Xi'an Jiao tong University Laboratorial Animal Center (Shaanxi, Kina). Istraživanje je u skladu s Vodičem za brigu i korištenje laboratorijskih životinja, koji su objavili Nacionalni instituti za zdravlje SAD-a (NIH publikacija br.85-23, revidirana 1996.), a eksperimentalne protokole odobrile su lokalne vlasti ( Povjerenstvo za biomedicinsku etiku Medicinskog odjela Sveučilišta Xi 'a Jiao tong). Štakorski model HF-a uspostavljen je kako smo prethodno opisali.31 Ukratko, izoproterenol (10 mg/kg) se daje jednom dnevno intraperitonealnom injekcijom tijekom 2 tjedna (definirano kao HF grupa), ECH se primjenjuje s 20 ug/g jednom dnevno intraperitonealnom injekcijom 30 minuta prije liječenja ISO (definirano kao ECH skupina), a primjena traje 2 tjedna. Kontrolnim životinjama davan je 0,9 posto NaCl (definiran kao kontrolna skupina). Ehokardiografska mjerenja izvode se za procjenu rada srca.

2.10|Ehokardiografska mjerenja

Životinje su anestezirane intraperitonealnom injekcijom 300 mg/kg kloralhidrata. Za ehokardiografske pretrage koristi se ultrazvučni sustav SONOS-2500 s ultrazvučnom sondom od 7,5 MHz (HP, USA). Ejekcijska frakcija lijeve klijetke (LVEF), frakcijsko skraćenje lijeve klijetke (LVFS), krajnje dijastoličke dimenzije lijeve klijetke (LVIDd), krajnje sistoličke dimenzije lijeve klijetke (LVID), broj otkucaja srca (HR), debljina interventrikularnog septuma u dijastoli (IVSTd) ), debljina stražnje stijenke lijeve klijetke u dijastoli (LVPWTd) mjere se kako smo prethodno opisali.32

SLIKA 1 50μmol ECH učinkovito inhibira mitohondrijski oksidativni stres AC{1}} stanica izazvan s 10 μmol/L ISO i štiti funkciju mitohondrija i smanjuje apoptozu.

2.11|Mjeri se omjer težine srca i tjelesne težine (TŠ/TM).

Štakor se izvaže prije anestezije, svježe srce se izolira i ispere krv s 0.1mol/L PBS-om, izrežu se žile i drugo suvišno tkivo i srce se izvaže, zatim se HW/TT (mg/100g) proračunati.

2.12|Histološko bojenje

Srca štakora su secirana i fiksirana u 4 posto paraformaldehida, uklopljena u parafin, i izrezana na ploške debljine 5 µm. Bojanje hematoksilin-eozinom (HE) koristi se za promatranje patoloških promjena, a Massonov trikrom koristi se za procjenu kolagenih vlakana tkiva miokarda štakora. Volumni udio srčanog kolagena (CVF) i površina poprečnog presjeka kardiomiocita mjere se s Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, SAD).

2.13|TUNEL bojenje

Prikuplja se tkivo miokarda iz lijeve klijetke i provodi se TUNEL test kako smo prethodno opisali32

2.14|Transmisijski elektronski mikroskop

Svježe srčano tkivo se fiksira u 2,5 posto glutaraldehida na 4 stupnja, tkivo se zatim izreže na 1 mm3 volumena i ponovno fiksira u 2,5 posto glutaraldehida na 4 stupnja 2 sata, zatim se ispere s 0.1mol/L PBS, fiksirano u 1 posto osminske kiseline, dehidrirano acetonom, uklopljeno epoksidnom smolom, izrađuju se ultratanke kriške tanke oko 800nm, boje se uranil acetatom i olovnim citratom, a zatim se promatraju pod prijenosnim elektronskim mikroskopom (H{ {13}}, Hitachi Limited, Japan). Kako bi se kvantificirao zaštitni učinak ECH u morfologiji mitohondrija, srednji opseg mitohondrija, srednja površina poprečnog presjeka mitohondrija, postotak degeneracije i postotak vakuolizacije u mitohondrijima statistički su analizirani s Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, SAD).

2.15|Kvantitativni PCR

Ukupna RNA se priprema iz tkiva lijeve klijetke s Trizol reagensom (Invitrogen, Carlsbad, SAD). cDNA se sintetizira pomoću TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan). Specifične prajmerne sekvence kolagena koje sam koristio za PCR u stvarnom vremenu su sljedeće: naprijed: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, obrnuto: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH naprijed 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', obrnuto 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu (qPCR) izvodi se sa SYBRPremix Ex Taq (Savršeno stvarno vrijeme) (Takara, Japan). Relativna razina mRNA izračunava se normalizacijom na GAPDH, prema 2-ΔΔCT metodi.

2.16|Western blot analiza ekspresije proteina SIRT1, FOXO3a, MnSOD

Ukupni protein tkiva lijeve klijetke ekstrahira se na ledu pomoću hladnog RIPA pufera (BioRad, SAD) s koktelom inhibitora proteaze (Sigma-Aldrich). Koncentracija se određuje BCA metodom. Postupci Western blota prethodno su opisani.33 Ukratko, uzorak proteina je frakcioniran na 15 postotnom natrijevom dodecil sulfatu-poliakrilamidnom gelu, prenesen na PVDF membrane (BioRad, SAD), blokiran 5 postotnim obranim mlijekom i inkubiran s MYH protutijelom iz miša. (razrijeđen 1:200, Santa Cruz, SAD). Zatim inkubirano s kozjim mišjim protutijelom konjugiranim s peroksidazom hrena (razrijeđeno 1:2, 000, Santa Cruz, SAD). Relativna razina proteina izračunava se normalizacijom srednje vrijednosti zraka na -aktin. Proteinske trake detektiraju se kemiluminiscencijskim sustavom (ChemiDoc XRS, BioRad).

2.17|Mjerenje mitohondrijskog oksidativnog stresa u miokardu štakora

Pročišćeni mitohondriji miokarda štakora izolirani su pomoću kompleta za izolaciju mitohondrija (Sigma, SAD) u skladu s uputama proizvođača, mitohondrijski ROS, MMP, oksidativno oštećenje mtDNA, sadržaj karboniliranih proteina i razina lipidne peroksidacije u mitohondrijima detektirani su istim metodama kao stanični pokusi opisani gore. Treba napomenuti da se ROS u tkivu miokarda detektira DCFH-DA fluorescentnim sondama, intenzitet fluorescencije detektira se mjernim instrumentom za označavanje enzima, rezultati se predstavljaju kao RLU/ug mitohondrijskog proteina.

2.18|Statistička analiza

Svi podaci prikazani su kao srednje vrijednosti ± SEM. Jednosmjerna ANOVA koristi se za usporedbu razlika između više skupina, nakon čega slijedi Tukeyjev post hoc test značajnosti. Sve su statistike određene pomoću softvera SPSS15.0 (SPSS Inc, IL, SAD). Vrijednost vjerojatnosti P < 0,05="" smatra="" se="">

3|REZULTATI

3.1|50 μM ECH učinkovito inhibira oksidativno oštećenje mitohondrija i apoptozu u AC-16 stanicama

Netretirane ćelije postavljene su kao Ctrl grupa. Prvo, kao što prikazuje slika 1A, ECH inhibira mitohondrijski ROS induciran ISO. ISO tretirane stanice pokazuju značajno povećanje mitohondrijskog ROS-a u usporedbi s Ctrl-om, a to je povećanje značajno oslabljeno prethodnim tretmanom s 50 µM ECH. Drugo, ECH može inhibirati oksidativno oštećenje mtDNA izazvano ISO-om. 8-Vjeruje se da je OHdG jedna od najzastupljenijih lezija DNK koja je posljedica oksidativnog stresa i biomarker je oksidativnog oštećenja i popravka DNK. Kao što prikazuje slika 1B, otkriven je sadržaj 8-OHdG u pročišćenim mitohondrijima iz AC-16 stanica, rezultati pokazuju da je razina 8-OHdG u mitohondrijima iz ISO tretiranih stanica dramatično porasla, ali je promjena poništena s 50 μM ECH. Treće, ECH je učinkovit za zaštitu MMP-a, koji je oštećen od strane ISO-a. Intenzitet fluorescencije značajno je smanjen u stanicama tretiranim s ISO u usporedbi sa Ctrl stanicama, dok prethodna obrada s 50 µM ECH značajno smanjuje smanjenje MMP, kao što pokazuje slika 1C. Četvrto, ECH štiti od oksidativnog oštećenja mitohondrijskog proteina u AC-16 stanicama. Kao što slika 1D pokazuje, sadržaj karbonilnog proteina u mitohondrijima ISO tretiranih stanica značajno je povećan, a ECH smanjuje učinak. Peto, ECH također inhibira peroksidaciju mitohondrijskih lipida u AC-16 stanicama induciranu ISO. Kao što slika 1E pokazuje, razina lipidnih peroksida u mitohondrijima ISO stanica očito je viša od one u Ctrl stanicama, dok je ovo povećanje značajno smanjeno prethodnim tretmanom od 50 μM ECH. U konačnici, ECH inhibira nakupljanje unutarstaničnog ROS-a. Kao što slika 1F pokazuje, razina unutarstaničnog ROS-a u ISO stanicama značajno je povećana i značajno smanjena u stanicama prethodno tretiranim ECH. Slika 1G pokazuje da je stopa apoptoze AC-16 stanica značajno povećana nakon 24 sata inkubacije s 10 μM ISO, u usporedbi sa Ctrl stanicama, dok stanice prije tretmana s 50 μM ECH značajno smanjuju ISO-induciranu apoptozu.

SLIKA 2 Hipertrofija srca HF štakora izazvana ISO-om je ublažena, a srčana funkcija značajno poboljšana ECH tretmanom.

3.2|ECH poništava remodeliranje miokarda i poboljšava srčanu funkciju ISO-induciranog HF štakora

Kao što je prikazano na slici 2A, srca kod HF štakora imaju očitu hipertrofiju i poništena su tretmanom s ECH. Kao što pokazuju slike 2B-D i L, ECH smanjuje HW/BW. Rezultati ehokardiografije pokazuju da su LVEF i LVFS značajno smanjeni u skupini sa srčanom insuficijencijom, dok su LVIDd, LVIDs i IVSTd značajno povećani u skupini sa srčanom insuficijencijom. Međutim, ECH značajno smanjuje LVIDd, LVIDs, IVSTd i poboljšava LVEF i LVFS, nema značajne razlike u HR između tri skupine, LVPWTd je povećan u HF, ali nema razlike između ECH i Ctrl, ili između ECH i HF, sve kao Slika 2E-K pokazuje. Rezultati bojenja HE pokazuju da hipertrofija miokarda, uređeni poremećaj ili degeneracijska nekroza, infiltracija upalnih stanica i intersticijska hiperemija i edem u HF štakora, a ECH značajno ublažava ta oštećenja, hipertrofija miokarda i uređeni poremećaj su ublaženi, degeneracijska nekroza i upalni infiltrat su smanjeni, kao što je prikazano na slici 3A. Mjeri se površina poprečnog presjeka kardiomiocita, značajno je povećana nakon ISO i smanjena je u skupini liječenoj ECH, kao što prikazuje Slika 3E. Procjene taloženja kolagena bojanjem po Massonu otkrivaju da je sadržaj kolagena u lijevoj klijetki kod HF štakora očito povećan i očito smanjen nakon tretmana s ECH, što očito smanjuje CVF. PCR analiza u stvarnom vremenu otkriva da su transkripti prokolagena tipa Ⅰ regulirani prema gore u ISO štakora i smanjeni kod ECH štakora, ovi su rezultati međusobno usklađeni, kao što pokazuju slike 3B i FG, podaci pokazuju da ECH učinkovito smanjuje taloženje kolagena . Broj TUNEL-pozitivnih stanica u kardiomiocitima značajno je povećan kod HF štakora u usporedbi s Ctrl, ECH značajno smanjuje apoptozu miokardijalnih stanica, a slika 3C-D prikazuje reprezentativnu sliku TUNEL-pozitivnih stanica u poljima niske i visoke snage, a slika 3H prikazuje brzinu apoptoze stanica miokarda. Ovi rezultati pokazuju da ECH učinkovito poništava hipertrofiju miokarda, intersticijalnu fibrozu miokarda i apoptozu, te poboljšava rad srca kod HF štakora izazvan ISO.

SLIKA 3. Rezultati histološkog bojenja pokazuju da ECH poništava remodeliranje lijeve klijetke HF štakora izazvano ISO-om.

3.3|ECH štiti ultrastrukturu miokarda kod HF štakora

Rezultati transmisijskih elektronskih mikrografa pokazuju da se oštećenje ultrastrukture miokarda može ublažiti ECH, kao što prikazuje slika 4A-B. Miofibrile su okomitog rasporeda, struktura sarkomera je očita, miofilamenti su uredno raspoređeni, a Z linija je jasna. Mitohondriji su uredno raspoređeni i struktura je jasna u Ctrl štakora. Međutim, miofibrile su neorganizirane, puknute i otopljene, struktura sarkomera je nejasna, nema Z linije, vidljiva je zona kontrakcije miokarda, broj i volumen mitohondrija je povećan, mitohondriji su različitih oblika i veličina, raspoređeni neuredno, struktura je nejasna, oteklina i fragmentacija kriste, kolaps ili nakupljanje i otopljen u vakuolu u HF štakora. ECH očito ublažava ove promjene, većina vlakana srčanog mišića je uredno raspoređena i filamenti miokarda su čisti, Z linija postoji, iako je vidljivo određeno otapanje filamenata, struktura sarkomera je jasna, gustoća mitohondrija je smanjena, oblici i veličine su olakšane, urednije raspoređene, bubrenje mitohondrija i fragmentacija krista, kolaps ili nakupljanje i vakuolizacija očito su smanjeni ECH u usporedbi sa HF. Oticanje mitohondrija i fragmentacija krista, kolaps ili nakupljanje i djelomična vakuolizacija identificiraju se kao mitohondrijska degeneracija. Rezultati pokazuju da ECH učinkovito štiti ultrastrukturu miokarda, a posebno štiti morfologiju mitohondrija u HF štakora, kao što prikazuje slika 4C-F.

SLIKA 4 ECH štiti ultrastrukturu kardiomiocita i morfologiju mitohondrija HF štakora izazvanu ISO.

3.4|ECH pojačava ekspresiju proteina SIRT1, FOXO3a i MnSOD

Western Blot analiza pokazuje da je razina ekspresije proteina SIRT1, FOXO3a i MnSOD značajno smanjena u HF štakora, međutim, ECH očito pojačava smanjenu ekspresiju proteina. Reprezentativne proteinske vrpce rezultata imunoblotinga i statističke analize prikazane su na slici 5. Dio podataka pokazuje da ECH povećava ekspresiju proteina SIRT1, FOXO3a i MnSOD.

3.5|ECH inhibira mitohondrijski oksidativni stres u tkivu miokarda lijeve klijetke

U ovom dijelu mjere se mitohondrijska ROS, MMP, oksidativno oštećenje mitohondrijske DNA, sadržaj karbonilnih proteina i razina peroksidacije lipida u mitohondrijima u miokardijalnom tkivu lijeve klijetke štakora, a rezultati su u skladu s pokusima na stanicama, tj. ECH smanjuje ROS mitohondrija, štiti MMP, smanjuje stupanj oštećenja mtDNA, smanjuje sadržaj karbonilnih proteina i peroksidaciju lipida u mitohondrijima, kao što je prikazano na slici 6.

SLIKA 5 ECH pojačava razinu ekspresije proteina SIRT1, FOXO3a i MnSOD koja je smanjena u HF štakora.

4|RASPRAVA

Ova studija pokazuje da ECH ima učinkovitu ulogu u prevenciji remodeliranja miokarda i poboljšanju funkcije srca putem pojačane regulacije signalne osi SIRT1/FOXO3a/MnSOD i inhibicije mitohondrijskog oksidativnog stresa.

Mitohondriji su glavno mjesto stvaranja ROS-a kao nusprodukta oksidativne fosforilacije, zbog svoje blizine ROS-u, vjeruje se da su mitohondrijski proteini, lipidi i mtDNA primarni ciljevi oksidativnog oštećenja nakon prekomjerne emisije mitohondrijskih ROS-a,34,35 ovo oštećenje stimulira daljnju proizvodnju ROS-a, začarani krug se nastavlja, ROS i oksidativni stres mogu dovesti do hipertrofije miokarda, apoptoze, intersticijske fibroze i HF-a kroz aktivaciju višestrukih signalnih putova.35 Dakle, čini se da lijekovi koji ciljaju inhibiciju mitohondrijske oksidacije stres učinkoviti su za prevenciju remodeliranja miokarda. ECH je prirodni feniletanoidni glikozid, sastojak tradicionalne kineske biljke Cistanche tubulosa. naširoko je proučavan i dokazano je da posjeduje različite vrste farmakoloških aktivnosti u posljednjih nekoliko godina, kao što su anti-tumor, anti-apoptoza, anti-aging, neuroprotektivno djelovanje, i tako dalje. Studije su dokazale da farmakološka djelovanja ECH uglavnom ovise o njegovom svojstvu antioksidativnog i protuupalnog djelovanja,18,21 a ECH smanjuje ROS mitohondrija i štiti funkciju mitohondrija od oksidativnog oštećenja u živčanim stanicama.20,22 Ovdje smo prvo pokazali da ECH smanjuje ROS mitohondrija kardiomiocita, stoga poboljšava MMP, smanjuje oksidativno oštećenje mtDNA, proteina i lipida, učinkovito inhibira oksidativno oštećenje mitohondrija i smanjuje apoptozu in vitro i in vivo, dakle, poništava remodeliranje miokarda i poboljšava funkciju srca. To znači da je ECH potencijalno novi lijek za prevenciju remodeliranja miokarda i HF-a.

U normalnim uvjetima, mitohondrijski ROS se uglavnom čisti pomoću MnSOD koji se distribuira u mitohondrijima i štiti od oksidativnog oštećenja mitohondrija. Ang II značajno smanjuje ekspresiju MnSOD kardiomiocita i inducira hipertrofiju miokarda, međutim, resveratrol bi mogao povećati ekspresiju MnSOD i inhibirati hipertrofiju miokarda izazvanu Ang II.36 U HF-u, aktivnost MnSOD je značajno smanjena, a stvaranje mitohondrijskih ROS je povišeno .37,38 U srčano-specifičnih MnSOD gen nockout miševa, mitohondrijski ROS nije se mogao očistiti i ROS je povećan u kardiomiocitima, što je dovelo do mitohondrijske disfunkcije i progresivnog povećanja srca, što je na kraju dovelo do zatajenja srca.39 U ovoj studiji potvrđujemo da je ekspresija MnSOD značajno smanjena, što je oslabljeno tretmanom ECH, te je stoga mitohondrijski ROS smanjen i mitohondrijski oksidativni stres inhibiran. To znači da ECH štiti kardiomiocite od oksidativnog oštećenja putem pojačane regulacije ekspresije MnSOD, mi dalje istražujemo molekularne mehanizme koji leže u pozadini ovih učinaka.

Ekspresiju MnSOD regulira FOXO3a, koji je faktor transkripcije i veže se u regiju promotora gena MnSOD i dovodi do promicanja transkripcije gena.40 SIRT1 je uzvodna molekula FOXO3a i može aktivirati FOXO3a deacetilacijom. Signalna os SIRT1/FOXO3a/MnSOD ima ključnu ulogu u zaštiti od oksidativnog stresa u vrstama tipova stanica, aktivacija signalne osi estradiolom inhibira oksidativni stres i djeluje na zaštitu srca24; Aktivacija signalne osi resveratrolom inhibira staničnu smrt izazvanu oksidativnim stresom40; Inače, angiotenzin II inhibira put SIRT1/FoxO3a/MnSOD i izaziva mitohondrijski oksidativni stres, oštećenje mtDNA u osteoblastima,41 adenilil ciklaza tipa 5 povećava oksidativni stres inhibicijom ekspresije MnSOD putem puta Sirt1/FoxO3a.42 Ova studija otkriva da ekspresija SIRT1, FoxO3a i MnSOD značajno je smanjena u HF štakora, a mitohondrijski ROS je povišen i oksidativni stres je pojačan, međutim, ECH poništava promjene. Nova istraživanja pokazuju da ECH izravno veže SIRT1 kao ligand i tvori kompleks s 9 kovalentnih veza i pojačava ekspresiju SIRT1 u živčanim stanicama.26 U skladu s ovom studijom, ova studija pokazuje da ECH također pojačava ekspresiju SIRT1 u kardiomiocitima, zatim pojačava gensku ekspresiju MnSOD kroz FoxO3a i inhibira mitohondrijski ROS i oksidativni stres.

Dugotrajna kronična ishemija može uzrokovati hibernaciju miokarda, te miokardijalne stanice koje hiberniraju obično pokazuju gubitak kontraktilnih filamenata, postoji višak granula glikogena u citosolu, sarkoplazmatski retikulum i poprečni tubuli su izgubljeni,43 također postoje abnormalnosti u veličini i obliku mitohondrija , reaktivna hipertrofija miokarda i intersticijska fibroza, koja je sekundarna zbog gubitka miocita.44 Također smo primijetili gore navedene promjene u HF štakora u našoj studiji, dok ECH značajno ublažava te promjene, budući da je najnovija studija izvijestila da bi oporavak srčane funkcije nakon ishemijskog stresa mogao biti obilježje miokardijalne hibernacije,45 također se mjeri razina miokardijalnog glikogena, rezultati pokazuju da nema značajne razlike između tri skupine, kao što je prikazano na slici 7J.

Prethodna studija je također otkrila hibernaciju miokarda u modelu svinje bez ishemijskog zatajenja srca visokofrekventnim stimuliranjem slobodne stijenke LV,46 jer mikrovaskularna opstrukcija igra važnu ulogu u hibernaciji miokarda i posljedičnoj kontraktilnoj disfunkciji, a to se značajno poboljšava kada mikrovaskularna opstrukcija se poništava lijekom.47 Trenutačno, neke studije zaključuju da je revaskularizacijska terapija učinkovita u hibernaciji miokarda,43 korištenjem HE i Massonovog bojenja, opažamo da je gustoća miokardijalnih kapilara i arteriola očito smanjena u HF štakora i značajno smanjena pomoću ECH, kao što je prikazano na slici 7A-H. Prethodne studije pokazale su da drugi prirodni spojevi, poput ječmenog beta-glukana, imaju kardioprotektivne učinke povećanjem ekspresije MnSOD,48,49, a porast MnSOD povezan je s povećanom gustoćom kapilara miokarda i ekspresijom VEGF. Proveli smo RT-PCR kako bismo otkrili ekspresiju VEGF, podaci su u skladu s nalazom histološkog bojenja, što znači da ECH može potaknuti angiogenezu i povećati gustoću kapilara miokarda putem regulacije ekspresije VEGF, kao što je prikazano na slici 7I. Ova studija otkriva da ECH može zaštititi i povećati kapilare i arteriole miokarda putem pojačane regulacije puta SIRTI/FOXO3a/MnSOD i ekspresije VEGF-a, čime se potiskuje miokard u hibernaciji i pridonosi poboljšanju funkcije srca.

Cistanche doprinosidopoboljšanje rada srca.

Za više informacija kliknite ovdje.

Važno je napomenuti da je dobro poznato da je apoptoza kardiomiocita važna patološka promjena u zatajenju srca, a ova studija doista potvrđuje da velika količina apoptotskih stanica u HF štakora i ECH značajno smanjuje apoptozu putem regulacije puta SIRTI/FOXO3a/MnSOD i inhibicije mitohondrijski oksidativni stres, kao što je gore spomenuto.

Iznad svega, ECH poništava remodeliranje miokarda i poboljšava funkciju srca putem pojačane regulacije signalne osi SIRT1/FoxO3a/MnSOD, čime se inhibira mitohondrijski oksidativni stres i smanjuje hibernirajući miokard. Stoga se sugerira da je ECH potencijalni lijek za prevenciju ili liječenje remodeliranja miokarda i HF-a.