Polisaharidi Cistanche Deserticola imaju neuroprotektivni učinak

za više informacija:Ali.ma@wecistanche.com

Yue Liu, et al

Sažetak:

Ishemijski moždani udar je bolest s visokim morbiditetom i mortalitetom.Cistanchedeserticolapolisaharidi(CDP) posjeduju širok raspon korisnih učinaka, uključujući hepatoprotekciju i imunološku homeostazu. Koliko je nama poznato, zaštitni učinak CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharidi)na neuronima ozlijeđenim deprivacijom/reperfuzijom kisika i glukoze (OGD/RP) nije istražena. U ovoj studiji, OGD/RP je ozlijedio model stanice PC12. Ukratko, CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)({{0}}.05, 0,5 i 5 ug/ml) primijenjeno je prije reperfuzije. Zaštitni učinak CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharidi)zatim je procijenjen na temelju stanične održivosti, curenja laktat dehidrogenaze (LDH), [Ca2 plus ] I, potencijala mitohondrijske membrane (MMP) i stanične apoptoze, andredoks status nakon reperfuzije procijenjen je ispitivanjem reaktivnih vrsta kisika (ROS), katalaze ( CAT), glutation peroksidaza (GSH-Px) i ukupni antioksidativni kapacitet. Na temelju činjenice da protein DJ-1 povezan s Parkinsonovom bolešću sudjeluje u endogenoj antioksidaciji i obavljaneuroprotektivniučinaka nakon ishemijskog moždanog udara, istraživali smo interakciju između CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)i DJ{{0}}. Ekspresija DJ-1 detektirana je ELISA i Western blot analizom, a translokacija DJ-1 procijenjena je imunofluorescencijom. Rezultati su pokazali da je CDP (0.05, 0.5 i 5 ug/ml) oslabio staničnu smrt PC12, sačuvao MMP i homeostazu kalcija; inhibira oksidativni stres i smanjuje apoptozu stanica. Štoviše, CDP (5 ug/ml) značajno je stimulirao izlučivanje i ekspresiju DJ-1. Sve u svemu, rezultati sugeriraju da CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)vrši aneuroprotektivniučinak protiv OGD/RP-induciranih ozljeda inhibicijom oksidativnog stresa i reguliranjem DJ-1 puta

Ključne riječi:Cistanche deserticola, polisaharidi, neuroprotektivni, nedostatak kisika/reperfuzija glukoze, oksidativni stresDJ-1

Kliknite za Cistanche UK proizvode

1. Uvod

Ishemijski moždani udar je drugi vodeći uzrok smrtnosti i primarni uzrok dugotrajne invalidnosti u svijetu [1]. Očekuje se da će smrtnost uslijed moždanog udara porasti na 7,8 milijuna 2030. [2]. U Kini svake godine od moždanog udara umire 58 do 142 na 100000 ljudi. Stoga se moraju razviti učinkovite strategije koje poništavaju ishemijsko-reperfuzijsku ozljedu. Opsežni dokazi podupiru da je oksidativni stres glavni čimbenik koji potiče razvoj i progresiju cerebralnog infarkta tijekom reperfuzije [3,4]. Stoga, otkrivanje učinkoviteneuroprotektivniagensi koji mogu smanjiti ROS i suzbiti oksidativni stres privukli su značajan interes u istraživanju. ProteinDJ-1 povezan s Parkinsonovom bolešću posreduje u neuroprotekciji stimulirajući anti-apoptotičku i antioksidativnu ekspresiju gena [4,5]. DJ-1 se može premjestiti u mitohondrije oksidativnim stresom i stimulacijom mitogenom i može se izlučiti u izvanstanični matriks u patološkim stanjima, kao što su rak dojke, melanom i OGD/RP ozljeda [6]. Štoviše, DJ-1 je koristan u terapijskom ciljanju ishemijske neurodegeneracije zahvaljujući svojoj ključnoj ulozi u antioksidaciji [4,7]. U posljednjih 10 godina, nekoliko je grupa potvrdilo da DJ-1 jestneuroprotektivniučinci na modele in vivo fokalne cerebralne ishemije i in vitro modele OGD/RP [6-9]. U međuvremenu, neki lijekovi, uključujući ciklosporin A i natrijev fenilbutirat, ukidaju smrt neuronskih stanica putem DJ-1 pojačane regulacije u ishemijskom moždanom udaru [9,10 ].

Cistanchedeserticola, integralna osušena biljkaCistanchedeserticolaYCMa i Cistanche tubulosa Wight, proizvodi se uglavnom u pustinjskim područjima sjeverne i sjeverozapadne Kine [11]. C. deserticola je jestiv i čašćen je kao 'Ginseng pustinje'. U propisivanju akupunkturnih točaka koristi se za liječenje kronične bubrežne bolesti, spolne impotencije, ženske neplodnosti, leukoreje, metroragije i senilne konstipacije [12].C. deserticola polisaharidi, glavna aktivna komponenta izolirana izCistanche deserticola. CDP, modulira imunološku funkciju i ravnotežu lipida te pruža zaštitu od starenja, oksidacije i oštećenja jetre. Štoviše, CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)sprječava ishemijsko-reperfuzijsko oštećenje srca i jetre [13,14]. Nedavna istraživanja pokazala su da CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)nisu toksični[12,15,16], a druge fitokemikalije ekstrahirane iz C. Deserticola, uključujući ehinakozid, izoakteozid, akteozid i salidrozid, pokazujuneuroprotektivniučinci [11,12]. Međutim, do sada nije zabilježena potencijalna uporaba CDP-a za poboljšanje oštećenja izazvanih ishemijskim moždanim udarom.

U ovoj studiji pretpostavljamo da CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)inhibira oksidativni stres radi neuroprotekcije. Potencijalni zaštitni učinci CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharidi)oštećenje inishemijskim moždanim udarom ispitano je korištenjem OGD/RP ozlijeđenih PC12 stanica. Zatim su istražene temeljne interakcije povezane s DJ-1.

2. Metode

2.1. Kultura stanica i OGD/RP model

Stanice PC12 uzgajane su u mediju RPMI 1640 koji je sadržavao 10 posto FBS na 37 stupnjeva u normoksičnom inkubatoru koji je sadržavao 5 posto CO2. Medij je zamijenjen svakih 48 h. OGD/RP model je pripremljen. PC12 stanice su isprane i izložene Earleovoj uravnoteženoj otopini soli. Zatim su stanice prebačene u anaerobnu komoru koja je sadržavala 5 posto CO2 i 95 posto N2 na 37 stupnjeva tijekom 4 sata, a zatim su ostavljene da se podvrgnu reoksigenaciji. Tijekom ovog koraka stanicama je dodan isti volumen medija kulture. Nakon reoksigenacije, stanice su stavljene u normoksični inkubator na 24 sata.

2.2. Primjena lijekova

CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)je kupljen od Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, Kina (C23J7Y18405, > 98 posto čistoće). Nimodipin, lijek prve linije za prevenciju ishemijskog moždanog udara, korišten je kao pozitivna kontrola [17-19]. Injekcija nimodipina bila je iz tvrtke Bayer. Stanice su nasumično podijeljene u šest skupina, naime, kontrolna, vehikul (OGD/RP), Nimo (5 ug/ml), CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)(0.05 ug/ml), CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)(0.5 ug/ml) i CDP (5 ug/ml). Nimodipin i CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)dodani su prije reperfuzije. Kontrolna skupina je uzgojena u normalnom mediju i inkubirana u normoksičnim uvjetima.

2.3. Viabilnost stanica: MTT i NRU testovi

Stanice PC12 (6 × 103 po jažici) nasađene su u 96-ploču s kulturom jažica. Stanice su tretirane u skladu sa zahtjevima svake skupine. Stanicama je dodan MTT (Solarbio, Kina) u koncentraciji od 5 mg/ml i inkubiran 4 sata na 37 stupnjeva. Formazan je produkt redukcije sukcinat dehidrogenaze u živim stanicama [20]. DMSO je dodan za otapanje stvorenog plavog formazana. Apsorpcija na valnoj duljini od 490 nm detektirana je čitačem mikropločica (Thermo, SAD) nakon što su stanice mućkane 10 minuta na 25 stupnjeva. Rezultati preživljavanja stanica iskazani su kao postotak kontrolne skupine [21].

Test unosa neutralnog crvenog (NRU) proveden je u skladu s prethodno objavljenim protokolom [22]. Kada su razdoblja reperfuzije završena, stanicama je dodano neutralno crveno (Solarbio, Kina) u koncentraciji od 50 ug /ml. Smjesa je inkubirana 3 h. Zatim su stanice brzo isprane otopinom koja je sadržavala 0,5 posto formaldehida i 1 posto kalcijevog klorida. Stanice su zatim dodane u smjesu koja je sadržavala 1 posto etilne kiseline i 50 posto bezvodnog etanola. Ploče su očitane pri apsorbanciji od 540 nm nakon što su stanice mućkane 20 minuta na 37 stupnjeva. Rezultati stanične vitalnosti očitovali su se u postotku u odnosu na kontrolnu skupinu.

Polisaharidi Cistanche deserticolaimatiNeuroprotektivni učinak

2.4. Procjena citotoksičnosti

LDH je citoplazmatski enzim koji katalizira oksidaciju laktat topiruvata. LDH se brzo otpušta u izvanstaničnu tekućinu kada je stanična membrana oštećena. Stoga se detekcija LDH obično izvodi za procjenu citotoksičnosti. [23]. Eksperimentalni postupak slijedio je upute za komercijalnu opremu isporučenu uz opremu za analizu LDH (Jiancheng, Kina). Apsorpcija svakog uzorka detektirana je pri 440 nm čitačem mikropločica. Postotak stanične smrti izračunat je korištenjem sljedeće formule: Viabilnost (postotak)=(OD Tretman − ODTtretman prazan)/(OD Max LDH aktivnost − OD Max LDH aktivnost prazan) × 100 posto.

2.5. Detekcija unutarstanične koncentracije Ca2 plus

Unutarstanična koncentracija Ca2 plus mjerena je s Fluo-3/AM [15]. Stanice PC12 isprane su s PBS tri puta i zatim inkubirane s 2 μM Fluo-3/AM (Beyotime, Kina) 30 minuta na 37 stupnjeva u mraku. Stanice su zatim isprane s PBS-om tri puta za uklanjanje izvanstanične boje. Intenzitet fluorescencije Fluo-3/AM određen je na laserskom skenirajućem konfokalnom mikroskopu (Olympus, Japan). Programski paket Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer i ImageJ korišteni su za izračun vrijednosti sivih tonova

2.6. Mjerenje MMP

JC-1 (5,5′,6,6′-Tetrakloro-1,1′,3,3′-tetraetil-imidakarbocijanin; Beyotime, Kina) je prikladna sonda osjetljiva na napon koja se općenito koristi za bojenje stanica i procjena MMP [24]. PC12 stanice su isprane dva puta s hladnim PBS-om i zatim inkubirane sa smjesom koja sadrži 50 posto medija i 50 posto radne tekućine 15 minuta na 37 stupnjeva u mraku. Zatim je smjesa odbačena i zamijenjena svježim medijem. Slike crvene i zelene fluorescencije snimljene su laserskom skenirajućom konfokalnom mikroskopijom. Relativni udio crvenog i zelenog fluorescentnog signala korišten je za mjerenje MMP [25]. Za izračun vrijednosti sive skale korišteni su softverski paket Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer i ImageJ.

2.7. Test otkrivanja apoptoze, Hoechest33342 i analiza protočne citometrije

Hoechst33342, boja koja veže DNA, korištena je za ispitivanje stanične apoptoze [26]. Nakon reperfuzije, PC12 stanice su isprane s PBS tri puta i inkubirane s Hoechst33342 (Beyotime, Kina) u koncentraciji od 5 ug/ml tijekom 15 minuta na 37 stupnjeva u mraku. Zatim su stanice promatrane pod laserskim skenirajućim konfokalnim mikroskopom. Teapoptotičke stanice pokazale su intenzivnu plavu fluorescenciju i kondenzaciju jezgre. Za svaki eksperiment bojenja, tri nasumična polja su uhvaćena i kvantificirana. Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer i ImageJ korišteni su za izračun vrijednosti sive skale. Postoci apoptotičkih stanica izračunati su prema sljedećoj formuli: apoptotička količina/ukupna količina × 100 posto [27].

2.8. Mjerenje proizvodnje ROS-a

Fluorescentna sonda 2′,7′- diklorofluorescein-diacetat (DCFH-DA; Jiancheng, Kina) može prodrijeti kroz stanične membrane i može se hidrolizirati u nefluorescentni DCFH. DCFH se oksidira unutarstaničnim ROS u fluorescentni DCF [29]. Nakon reperfuzije, stanice su isprane dva puta s PBS-om i zatim inkubirane s DCFH-DA u konačnoj koncentraciji od 10 µM tijekom 45 minuta na 37 stupnjeva u mraku. Fluorescencija je promatrana fluorescentnim spektrofotometrom s valnom duljinom ekscitacije od 485 nm i valnom duljinom emisije od 535 nm.

Polisaharidi Cistanche deserticolaimatiNeuroprotektivni učinak

2.9. Određivanje pokazatelja oksidativnog stresa: razine CAT, GSH-Px i T-AOC

Stanice su sastrugane i resuspendirane u PBS. Dobivene stanične suspenzije sonikirane su 45 puta na ledu i centrifugirane na 1000 o/min 10 minuta na 4 stupnja. Supernatanti su zadržani i korišteni za detekciju [24]. Ukupni sadržaj proteina u staničnom supernatantu mjeren je kompletom reagensa za analizu proteina BCA (KeyGEN, Kina). Aktivnosti razina CAT, GSH-Px i T-AOC mjerene su prema uputama proizvođača (Jiancheng, Kina). Apsorbancija svakog uzorka detektirana je čitačem mikropločica.

2.10. Mjerenje izvanstanične koncentracije DJ-1

PC12 stanice (6 × 103 po jažici) nasađene su u 96-pločice s kulturom jažica. Nakon reperfuzije, stanični supernatant je sakupljen i analiziran DJ-1/PARK-7 ELISA Kitom (Raybio, SAD ) prema uputama proizvođača [9]. Apsorpcija svakog uzorka detektirana je čitačem mikropločica na dvostrukoj valnoj duljini od 450 nm ili 540 nm.

2.11. Western blot analiza

Stanični proteini ekstrahirani su ledeno hladnim puferom za lizu prema uputama proizvođača (KeyGEN, Kina). Koncentracija proteina određena je kompletom reagensa za analizu proteina BCA. Jednake količine proteinskih lizata (20 ug) iz svake skupine otopljene su u elektroforezi u 12 postotnom natrijevom dodecil sulfatu i poliakrilamidnom gelu i potom prebačene na nitroceluloznu membranu. Membrana je inkubirana s PBS-om koji je sadržavao 5 posto obranog mlijeka 2 sata na sobnoj temperaturi, a zatim testirana anti-PARK7/DJ-1 antitijelima (ab76008, Abcam; razrjeđenje 1:1000) preko noći na 4 stupnja. Zatim je membrana isprana tri puta s PBST i inkubirana sa sekundarnim protutijelima kozjeg anti-zečjeg IgG (SA00001-2, Proteintech Group; razrjeđenje 1:5000) na sobnoj temperaturi 2 sata. Antitijelo anti- -Tubulin (10759-1-AP, Proteintech Group; razrjeđenje 1:1000) smatrano je kontrolom. Proteinske trake vizualizirane su reagensima za pojačanu kemiluminiscenciju (ECL). Gustoće vrpci mjerene su softverom QuantityOne Analysis v.4.6.9.

2.12. Imunocitokemijska analiza

Stanice PC12 fiksirane su u 4 postotnom paraformaldehidu 15 minuta na sobnoj temperaturi nakon reperfuzijskog tretmana [9]. Nakon uklanjanja prekomjerne količine paraformaldehida, stanice su inkubirane u PBS-u koji sadrži 0.3 posto Triton X-100 10 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim su stanice isprane s PBS tri puta prije nego što su inkubirane s 5 posto normalnim kozjim serumom tijekom 1 sata. Stanice su zatim inkubirane s monoklonskim lancem anti-ATP sintaze zeca miša (MABS1304, EMD Millipore, razrjeđenje 1:200) za bojenje mitohondrija i zatim inkubirane s anti-PARK7/DJ-1 antitijelom (razrjeđenje 1: 100) za ispitivanje proteina DJ-1. Stanice su isprane i inkubirane s kozjim anti-zečjim IgG-Alexa 488 (zeleno; A11034, Invitrogen; razrjeđenje 1:1000) i kozjim anti-mišjim IgG-Alexa 594 (crveno; A11032; Invitrogen; razrjeđenje 1:1000) tijekom 90 minuta. min. Na kraju, stanice su isprane tri puta s PBS-om i postavljene na stakalce s medijem za postavljanje koji je sadržavao DAPI. Imunofluorescentne slike vizualizirane su pomoću laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa.

Polisaharidi Cistanche deserticolaimatiNeuroprotektivni učinak

2.13. Podaci/statistička analiza

Sve vrijednosti prikazane su kao srednje vrijednosti ± SD. Značajnost je određena jednosmjernom analizom varijance (ANOVA), praćena Dunnettovim testom više usporedbi. p < .05="" smatra="" se="" statističkom="" značajnošću.="" eksperimentalni="" podaci="" analizirani="" su="" pomoću="" statističkog="" softvera="" spss="">

3. Rezultati

3.1. CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)inhibirao oštećenje stanica izazvano OGD/RP

PC12 stanice izložene OGD/RP-u pokazale su značajno smanjenje broja. Promijenjen je oblik stanice i pukla je stanična membrana. U MTT testu, vijalnost stanica u CDP-u(Cistanchedeserticolapolisaharidi)skupine ({{0}}.05, 0,5 i 5 ug/ml) bile su 58,91 posto ± 5,40 posto, 61,13 posto ± 3,81 posto i 68,57 posto ± 3,24 posto respektivno, p < 0,05="" (slika="" 1a)="" ,="" a="" onaj="" s="" vozilom="" 51,68="" posto="" ±="" 3,89="" posto="" .="" ove="" vrijednosti="" pokazuju="" da="">(Cistanchedeserticolapolisaharidi)zaštitio stanice od OGD/RP ozljeda i smanjio staničnu smrt. Nadalje, vitalnost stanica u skupini Nimo bila je 77,02 posto ± 5,22 posto, što je gotovo jednako onoj u CDP-u od 5 ug/ml(Cistanchedeserticolapolisaharidi)liječena skupina.

U NRU testu, vijalnost stanica u CDP-u(Cistanchedeserticolapolisaharidi)skupine ({{0}}.05, 0,5 i 5 ug/ml) bile su 52,03 posto ± 4,72 posto, 58,49 posto ± 2,50 posto odnosno 69,17 posto ± 3,91 posto (slika 1B) i to s vozilom je imao 47,14 posto ± 2,88 posto. Vrijednosti su pokazale zaštitni učinak CDP-a ovisan o koncentraciji.

Za razliku od nosača (44,73 posto ± 3,30 posto), oslobađanje LDH bilo je značajno smanjeno u CDP-u(Cistanchedeserticolapolisaharidi)skupine. U CDP-u(Cistanchedeserticolapolisaharidi)skupine ({{0}}.05, 0.5 i 5 ug/ml), stope istjecanja LDH bile su 32.41 posto ± 3.70 posto, 27.13 ± 2.79 posto i 23.13 posto ± 4.59 posto respektivno, p < .01="" (slika="" 1c).="" štoviše,="" stope="" istjecanja="" ldh="" u="" nimo="" skupini="" bile="" su="" 21,99="" posto="" ±="" 4,02="" posto,="" što="" je="" bilo="" gotovo="" jednako="" onom="" u="" skupini="" koja="" je="" primala="" 5="" ug/ml="">

3.2. CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)oslabljeno OGD/RP-inducirano povećanje [Ca2 plus ]i

Intracelularne razine Ca2 plus u stanicama PC12 bile su povećane na 4146,60 ± 195,97 nakon OGD/RP ozljede za razliku od kontrolne skupine (373,62 ± 75,69). CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)grupe ({{0}}.05, 0,5 i 5 ug/ml) mogle bi ovisno o dozi smanjiti unutarstaničnu razinu Ca2 plus na 2921,25 ± 222,19, 2015,85 ± 230,53 odnosno 1768,43 ± 426,12 (Slika 2A i C ). Štoviše, razina Ca2 plus u skupini tretiranoj CDP-om od 5 ug/ml smanjila se na razinu usporedivu s onom u Nimo skupini (1591,19 ± 213,21).

3.3. CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)oslabljena disipacija MMP izazvana OGD/RP

U usporedbi s kontrolnom skupinom (1,67 ± 0.89), skupina nositelja (0.48 ± 0.10) pokazala je više zelene FL fluorescencije od crvene FL fluorescencija (sl. 2B i D). Omjeri između crvene i zelene FL fluorescencije smanjeni su na 1,11 ± 0.26 i 1.18 ± 0.16 u CDP-u od 0,5 i 5 ug/ml(Cistanchedeserticolapolisaharidi)liječenih skupina, p < ,01.="" fluorescencija="" zelene="" fl="" je="" značajno="">

3.4. CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)spriječio OGD/RP-induciranu apoptozu stanica

Stanice koje pokazuju kondenzirane kromatine ili fragmentirane jezgre ocijenjene su kao apoptotične stanice [30]. Rezultati testa Hoechst33342 otkrili su pojavu kondenziranih jezgri nakon OGD/RP (sl. 3A i C). Uočen je visok intenzitet fluorescencije FL u jezgrama u skupini nosača. Intenzitet FL fluorescencije jezgri bio je oslabljen u CDP-u od 5 ug/ml(Cistanchedeserticolapolisaharidi)liječena skupina. Analizirali smo stopu apoptoze u PC12 stanicama pomoću citometrije pomoću FITC-Annexin V/PI dvostrukog bojenja (sl. 3B i D). Kontrolna skupina imala je stopu apoptoze stanica od 4,16 posto ± 0.24 posto, dok je skupina s nosačem imala 22,98 posto ± 0.66 posto. U skupini koja je primala 5 ug/ml CDP-a, stopa apoptoze stanica bila je 7.86 posto ± 1,16 posto.

3.5. CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)oslabljeno unutarstanično nakupljanje ROS izazvano OGD/RP-om i očuvan redoks status

Učinci CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharidi)na oksidativni stres dokazani su na temelju stvaranja ROS-a, GSH-Px, CAT aktivnosti i razina T-AOC. Razine ROS-a u PC12 stanicama oštećenim OGD/RP-om porasle su i postale značajno više od one u kontrolnoj skupini (p < 0,01).="" u="" međuvremenu,="" razine="" ros-a="" u="">(Cistanchedeserticolapolisaharidi)skupine ({{0}}.05, 0.5 i 5 ug/ml) smanjio se na način ovisan o dozi (p <.01; slika="" 4a).="" nadalje,="" cdp="" je="" također="" značajno="" povećao="" razine="" t-aoc="" (p="">< 0,05;="" slika="" 4b),="" cat="" (p="">< 0,05;="" slika="" 4c)="" i="" gsh-px="" (p="">< 0,05;="" slika="" 4d)="" u="" usporedbi="" s="" nosačem="" skupina.="" djelovanje="" endogenih="" antioksidansa="" u="">(Cistanchedeserticolapolisaharidi)grupe su se povećale.

3.6. CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)stimulira lučenje DJ-1 i pojačava ekspresiju DJ-1

Otkrivene su promjene koncentracije DJ-1 u staničnom supernatantu i otkrile mogući odnos između DJ-1 i CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharidi). Oslobađanje DJ-1 opaženo je iz OGD/RP-ozlijeđenih PC12 stanica (slika 5). DJ-1 je bio znatno povišen u CDP-u od 5 ug/ml(Cistanchedeserticolapolisaharidi)-tretiranoj skupini (38,66 ± 8,44 pg/ml) i došlo je do značajnog porasta u odnosu na skupinu s nosačem (18,33 ± 3,80 pg/ml, p < 0,01) i kontrolnu skupinu (9,67 ± 3,96 pg/ml, p < 0,01) .

Istražiti učinke CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharidi)na intracelularnoj ekspresiji DJ-1, izmjerili smo razine proteina DJ-1 Western blotingom. Razine ekspresije proteina DJ-1 bile su značajno povećane 24 sata nakon reperfuzije. Nasuprot tome, naknadni tretman CDP-om od 5 ug/ml značajno je pojačao prekomjernu ekspresiju DJ-1 u usporedbi sa skupinom nosača (p < 0,01,="" slika="">

3.7. CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)poboljšana DJ{0}} translokacija u mitohondrije

Stanice PC12 obojene su s anti-PARK7/DJ-1 i anti-ATP sintaza -protutijelima (slike 7 i 8). Anti-ATP sintaza - lanac antitijela povezuje se s mitohondrijskim kompleksom I, a vezni antigen je lokaliziran u unutarnjoj membrani mitohondrija. Rezultati su otkrili da se DJ-1 translocirao na unutarnju membranu mitohondrija nakon insulta OGD/RP (Slika 8). U međuvremenu, rezultati dvostrukog bojenja DJ-1 i mitohondrija otkrili su da CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)olakšana DJ{0}} mitohondrijska translokacija i ko-lokalizacija (slika 8). Ovi rezultati ukazuju na izravnu interakciju između DJ-1 ineuroprotektivniučinak CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharidi)(slika 9).

4. Rasprava

U ovoj smo studiji iz prve ruke izvijestili da CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)učinkovito smanjuje OGD/RP-inducirano oštećenje PC12 stanica putem regulacije DJ-1 proteina. CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)poboljšana održivost stanica, smanjeno oštećenje stanične membrane, održana unutarstanična homeostaza Ca2 plus, spriječen gubitak MMP-a, smanjena apoptoza stanica, potisnut oksidativni stres, pospješena ekspresija DJ-1 i poboljšana translokacija DJ-1 u mitohondrije. DJ-1 je nedavno upleten u regulacijuneuroprotektivniučinak i cjelovitost mitohondrija. Ovi rezultati pružili su uvjerljiv dokazneuroprotektivniučinci CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharidi)protiv ishemije. Nadalje, interakcija između CDP-a i DJ-1 igra aneuroprotektivniulogu u oštećenju PC12 stanica izazvanom OGD/RP. Gornji rezultati mogu razviti naše razumijevanje blagotvornog učinka CDP-a i mogu pružiti korisne informacije za terapiju moždanog udara u budućnosti.

Ishemijski moždani udar pripisuje se složenom nizu biokemijskih i molekularnih mehanizama, uključujući ekscitotoksičnost, preopterećenje kalcijem i oksidativni stres [31]. OGD/RP se široko koristi kao in vitro model ishemije-reperfuzije i koristi se za istraživanje neuroloških i biokemijskih promjena. Stanična linija PC12 osjetljiva je na OGD/RP ozljedu [2]. Pokazuje niz svojstava i karakteristika simpatičkih neurona [32] i stoga se naširoko koristi za neuronske stanične linije za istraživanja u vezi s mehanizmima neuroloških oštećenja uslijed moždanog udara [33,34]. Brojne studije pokazale su da oksidativni stres igra vitalnu ulogu u moždanom udaru i oštećenju ishemijom mozga [35-37]. Protein DJ-1 povezan s Parkinsonovom bolešću može inhibirati ishemijsku neurodegeneraciju i disfunkciju ponašanja smanjujući oštećenje neurona posredovano ROS-om [7]. Stoga smo upotrijebili OGD/RP-injury PC12 stanični model da istražimoneuroprotektivniučinak CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharidi).

Stupanj oštećenja u PC12 stanicama induciranog s OGD/RP procijenjen je MTT, NRU i testovima otpuštanja LDH. Administracija CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharidi)({{0}}.05, 0,5 i 5 ug/ml) poboljšalo je preživljavanje stanica i smanjilo otpuštanje LDH. Korisni učinci liječenja CDP-om također su uključivali smanjenje intracelularnog preopterećenja kalcijem i očuvanje MMP-a. Abnormalnosti intracelularne koncentracije Ca2 plus, osobito mitohondrijsko preopterećenje kalcijem, povezane su s apoptozom neurona i smrću izazvanom ishemijskim moždanim udarom [38]. MMP može odražavati učinkovitost lanca transporta elektrona i naznačen je kao indeks patološkog poremećaja ovog sustava [39]. I porast intracelularne koncentracije Ca2 plus i gubitak MMP-a mogu dovesti do destabilizacije strukture neurona i na kraju dovesti do oštećenja stanice ili stanične smrti [21,40]. U ovoj studiji, rezultati su pokazali da CDP značajno inhibira intracelularno Ca2 plus preopterećenje i povećava razine MMP-a u stanicama PC12 ozljede OGD/RP-om. Apoptoza igra vitalnu ulogu u složenoj patofiziologiji cerebralne ishemije-reperfuzijske ozljede. Sve više podataka ukazuje na to da je apoptoza upletena u disfunkciju mitohondrija; disipacija MMP je rani događaj koji rezultira apoptozom stanice [8,39]. Apoptoza je proces programirane stanične smrti ovisne o energiji radi uklanjanja suvišnih stanica. Mnogi neuroni u ishemijskom moždanom udaru doživjet će apoptozu [41]. U ovoj studiji proveli smo bojenje Hoechst33342 i Annexin V-FITC/PI kako bismo ispitali učinak CDP-a na apoptozu [23,28]. Rezultati su pokazali da CDP održava integritet jezgre i smanjuje stopu apoptoze stanica. Svi ovi rezultati pokazuju da je anti-apoptotička aktivnost CDP-a pridonijela povoljnom učinku kod oštećenja neurona u stanicama PC12.

Stanice koje su podvrgnute ishemijskom oštećenju uzrokovanom prekomjernom akumulacijom ROS-a, što može dovesti do peroksidacije lipida, oštećenja stanične membrane, preopterećenja kalcijem i mitohondrijske disfunkcije, što u konačnici rezultira staničnom apoptozom i smrću [42]. Konzumacija endogenih antioksidansa, kao što su SOD, CAT i GSH-Px, također ukazuje na pojavu Sl. 9. Mogući mehanizmi zaštitnih učinaka CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharidi)protiv OGD/RP-induciranog PC12 oštećenja stanica. Liječenje CDP-a suzbija oksidativni stres, stabilizira Ca2 plus koncentraciju i MMP, pojačava ekspresiju DJ-1 i lokalizaciju u mitohondrijima. Y. Liu i sur. Biomedicine & Pharmacotherapy 99 (2018) 671–680 678oksidativnog stresa tijekom ishemije-reperfuzije. U ovoj studiji, OGD/RP skupina pokazala je značajno povećanje ROS-a i smanjenje CAT-a, GSH-Px i T-AOC u usporedbi sa grupom koja je primala 5 ug/ml CDP-a. Međutim, primijetili smo značajno smanjenje stope stvaranja ROS-a i potrošnje endogenih antioksidansa (CAT, GSH-Px i T-AOC) u CDP skupinama. Korisni učinci u skupini koja je primala CDP od 5 ug/ml bili su slični onima u skupini koja je primala Nimo. Rezultati su pokazali da CDP inhibira stvaranje ROS i obnavlja enzimsku antioksidacijsku obranu.

DJ-1 je ključni redoks-reaktivnineuroprotektivniprotein uključen u regulaciju oksidativnog stresa kod moždanog udara. Korisni učinci prekomjerne ekspresije DJ-1 uključuju preživljavanje stanica od ishemije-reperfuzije i očuvanje mitohondrijske funkcije i morfologije, kao što je ubrzanje propusnosti mitohondrija prijelazno otvaranje pora [39,43]. Prethodne studije pokazale su da je zaštitni učinak DJ-1 u stanicama izloženim OGD/RP povezan s njegovim antioksidativnim svojstvima i translokacijom mitohondrija [43-45]. DJ-1 provodi učinkovitu endogenu neuroprotekciju u ublažavanju mitohondrijskih defekata putem translokacije [46]. Nekoliko je studija pokazalo da translokacija DJ-1 može utjecati na kretanje mitohondrija, poboljšati međustaničnu interakciju i promicati druge procese za preživljavanje stanica.

DJ-1 utječe na nekoliko procesa, kao što su migracija i adhezija stanica, kemotaksija, proliferacija i apoptoza, u in vitro i in vivo modelima [6,9,47,48]. Koristeći OGD/RP model moždanog udara ozlijeđenih stanica PC12, istražili smo potencijalni odnos između CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharidi)i DJ-1. Prekomjerna ekspresija DJ- 1 identificirana je pomoću ELISA i Western blottinga. Uz ovu funkciju, glavno otkriće u eksperimentima pokazalo je da je do značajne prekomjerne ekspresije DJ-1 došlo kada je CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)(5 ug/ml) primijenjeno je prije reperfuzije. Ovo je sugeriralo mogućuneuroprotektivniučinak u odnosu CDP i DJ-1. Štoviše, primijetili smo da DJ-1 koji se nalazi u mitohondrijima u uvjetima OGD/RP i obilne ekspresije DJ-1 smanjuje osjetljivost stanica na ROS i inhibira oksidativni stres [45]. Rezultati su implicirali da CDP regulira i pojačava DJ-1, koji djeluje kao molekularna veza između disfunkcije mitohondrija i oksidativnog stresa i osigurava progresiju sekundarne stanične smrti svojstvene moždanom udaru [5,47,49-51]. U tandemu sa stabilizacijom DJ-1 u mitohondrijima, CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)liječenje je povećalo preživljavanje stanica, stabiliziralo Ca2 plus homeostazu, poboljšalo rasipanje MMP-a i spriječilo apoptozu povezanu s mitohondrijima [43]. Sveukupno, naši rezultati pokazuju da CDP ima nešto novoneuroprotektivnimehanizam u liječenju ishemijskog moždanog udara.

5. Zaključak

Naši rezultati su pokazali da CDP(Cistanchedeserticolapolisaharidi)štiti stanice PC12 od ozljeda izazvanih OGD/RP-om svojim antioksidativnim učincima, koji se djelomično pripisuju DJ-1 posredovanom putu. Ti učinci uključuju smanjenje stope oštećenja stanične membrane, očuvanje homeostaze [Ca2 plus ] I, poboljšanje disipacije MMP-a, inhibiciju stanične apoptoze, slabljenje unutarstaničnog ROS-a i modulaciju razina DJ-1. Rezultati su također pokazali da interakcije između CDP-a i DJ-1 pojačavaju neuroprotekciju i održavaju integritet mitohondrija. Stoga, ranjivi neuroni mogu biti zaštićeni CDP-om(Cistanchedeserticolapolisaharidi)putem poboljšanja ekspresije DJ-1 tijekom ishemijskog moždanog udara.

Priznanja

Ovu studiju podržali su Nacionalna zaklada za prirodne znanosti Kine (potpora 81360649), Nacionalni ključni program za znanost i tehnologiju (potpora 2015BAK45B01) i Program potpore znanosti i tehnologije autonomne regije Ningxia Hui (potpora 2016BZ07).

Polisaharidi Cistanche deserticolaimati Neuroprotektivni učinak

Reference

[1] HD Tsai, JS Wu, MH Kao, JJ Chen, GY Sun, WY Ong, TN Lin, Clinacanthus nutans štiti kortikalne neurone od toksičnosti izazvane hipoksijom tako što smanjuje HDAC1/6, Neuromol. Med. 18 (2016) 274–282.

[2] J. Zhao, R. Liu, Moždani udar 1-2-0: program brzog odgovora na moždani udar u Kini, Lancet Neurol. 16 (2017) 27–28.

[3] PM George, GK Steinberg, Nova terapija moždanog udara: razotkrivanje patofiziologije moždanog udara i njezin utjecaj na kliničke tretmane, Neuron 87 (2015.) 297–309.

[4] H. Yao, T. Ago, T. Kitazono, T. Nabika, Patofiziologija povezana s NADPH oksidazom u eksperimentalnim modelima moždanog udara, Int. J. Mol. Sci. (2017) 18.

[5] J. Cao, M. Ying, N. Xie, G. Lin, R. Dong, J. Zhang, H. Yan, X. Yang, Q. He, B. Yang, The oxidation states of DJ{{ 1}} određuju sudbinu stanice kao odgovor na oksidativni stres izazvan 4-hpr: autofagija ili apoptoza? Antioksidni redoks znak. 21 (2014) 1443–1459.

[6] Y. Kaneko, H. Shojo, J. Burns, M. Staples, N. Tajiri, CV Borlongan, DJ-1 ublažava ishemijsku staničnu smrt in vitro, moguće mitohondrijskim putem, Neurobiol, Dis. 62 (2014) 56–61.

[7] D. Yanagisawa, Y. Kitamura, M. Indian, K. Takata, T. Taniguchi, S. Morikawa, M. Morita, T. Inubushi, I. Tooyama, T. Taira, et al., DJ{{ 1}} štiti od neurodegeneracije uzrokovane fokalnom cerebralnom ishemijom i reperfuzijom u štakora, J. Cereb. Protok krvi. Met. 28 (2008) 563–578.

[8] Y. Kaneko, N. Tajiri, H. Shojo, CV Borlongan, Oxygen-glucose-deprived rat Primarne neuralne stanice pokazuju DJ-1 translokaciju u zdrave mitohondrije: moćna meta za liječenje moždanog udara, CNS Neurosci. Ther. 20 (2014) 275–281.

[9] N. Tajiri, CV Borlongan, Y. Kaneko, Liječenje ciklosporinom A ukida smrt neuronskih stanica izazvanu ishemijom očuvanjem integriteta mitohondrija kroz regulaciju proteina DJ-1 povezanog s Parkinsonovom bolešću, CNS Neurosci. Ther. 22 (2016) 602–610.

[10] RX Yang, J. Lei, BD Wang, DY Feng, L. Huang, YQ Li, T. Li, G. Zhu, C. Li, FF Lu, et al., Predtretman s natrijevim fenilbutiratom ublažava cerebralnu ishemiju/ reperfuzijska ozljeda pojačanom regulacijom proteina DJ-1, naprijed. Neurol. 8 (2017) 256.

[11] C. Gu, X. Yang, L. Huang, Cistanches Herba. Neurofarmakološki pregled, Front. Pharmacol. 7 (2016) 289.

[12] Z. Li, H. Lin, L. Gu, J. Gao, CM Tzeng, Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): Jedan od najboljih farmaceutskih darova tradicionalne kineske medicine, Front. Pharmacol. 7 (2016) 41.

[13] Q. Liu, J. Li, J. Wang, J. Li, JS Janicki, D. Fan, Učinci i mehanizmi kineske biljne medicine u ublažavanju miokardijalne ishemije-reperfuzijske ozljede, Evid.- Based Compl. Alt. (2013) (2013) 925625.

[14] HS Wong, KM Ko, Herba Cistanches stimulira stanični redoks ciklus glutationa pomoću reaktivnih vrsta kisika generiranih mitohondrijskom respiracijom u H9c2 kardiomiocitima, Pharm. Biol. 51 (2013) 64–73.

[15] T. Wang, X. Zhang, W. Xie,Cistanchedeserticola YC Ma, "Pustinjski ginseng": recenzija, Am. J. Chin. Med. 40 (2012) 1123–1141.

[16] L. Gu, WT Xiong, C. Wang, HX Sun, GF Li, X. Liu,Cistanchedeserticoladekocija ublažava toksičnost testisa izazvanu hidroksiureom u muških miševa, azijski J. Androl. 15 (2013) 838–840.

[17] E. Herzfeld, C. Strauss, S. Simmermacher, K. Bork, R. Horstkorte, F. Dehghani, C. Scheller, Istraživanjeneuroprotektivniutjecaj nimodipina na Neuro2a stanice pomoću modela stresa sličnog operaciji, Int. J. Mol. Sci. 15 (2014) 18453–18465.

[18] G. Vahabzadeh, N. Rahbar-Roshandel, SA Ebrahimi, M. Mahmoudian,Neuroprotektivnoučinak noskapina na cerebralnu deprivaciju kisika i glukoze, Pharmacol. Broj 67 (2015) 281–288.

[19] CP Wang, LZ Zhang, GC Li, YW Shi, JL Li, XC Zhang, ZW Wang, F. Ding, XM Liang, Mulberroside A štiti od ishemijskog oštećenja u primarnoj kulturi kortikalnih neurona štakora nakon praćenja deprivacije kisika i glukoze reperfuzijom, J. Neurosci. Res. 92 (2014) 944–954.

[20] X. Qi, R. Zhou, Y. Liu, J. Wang, WN Zhang, HR Tan, Y. Niu, T. Sun, YX Li, JQ Yu, stanice PC12 zaštićene trans-cinamaldehidom protiv nedostatka kisika i glukoze /reperfuzijom (OGD/R)-inducirana ozljeda putem anti-apoptoze i antioksidativnog stresa, Mol. Cell Biochem. 421 (2016) 67–74.

[21] R. Chang, R. Zhou, X. Qi, J. Wang, F. Wu, W. Yang, W. Zhang, T. Sun, Y. Li, J. Yu, Zaštitni učinci aloina na kisik i ozljeda izazvana nedostatkom glukoze u stanicama PC12, Brain Res. Bik. 121 (2016) 75–83.

[22] M. Agrawal, V. Kumar, AK Singh, MP Kashyap, VK Khanna, MA Siddiqui, AB Pant, Trans-resveratrol štiti ishemijske stanice PC12 inhibiranjem faktora transkripcije povezanih s hipoksijom i povećanjem razine antioksidativnih obrambenih enzima, ACS Chem. Neurosci. 4 (2013) 285–294.

[23] KW Zeng, LX Liao, MB Zhao, FJ Song, Q. Yu, Y. Jiang, PF Tu, Protosappanin B štiti stanice PC12 od smrti neurona izazvane nedostatkom kisika i glukoze održavanjem mitohondrijske homeostaze putem indukcije ovisne o ubikvitinu p53 razgradnja proteina, Eur. J. Pharmacol. 751 (2015) 13–23.

[24] NT Ma, R. Zhou, RY Chang, YJ Hao, L. Ma, SJ Jin, J. Du, J. Zheng, CJ Zhao, Y. Niu, et al., Zaštitni učinci aloperina na primarne neonatalne štakore kultivirani hipokampalni neuroni oštećeni nedostatkom kisika i glukoze i reperfuzijom, J. Nat. Med. 69 (2015) 575–583.

[25] Y. Wang, W. Ma, A. Jia, Q. Guo, Parekoksib štiti mišje kortikalne neurone od OGD/R inducirane neurotoksičnosti pojačanom regulacijom Bcl-2, Neurochem. Res. 40 (2015) 1294–1302.

[26] MP Ponnusamy, P. Seshacharyulu, A. Vaz, P. Dey, SK Batra, MUC4 stabilizira ekspresiju HER2 i održava populaciju matičnih stanica raka u stanicama raka jajnika, J. Ovarian Res. 4 (2011) 7.

[27] R. Wang, L. Peng, J. Zhao, L. Zhang, C. Guo, W. Zheng, H. Chen, A. Gardenamide, Štiti RGC-5 stanice od H(2)O( 2) inzultati izazvani oksidativnim stresom aktiviranjem PI3K/Akt/eNOS signalnog puta, Int. J. Mol. Sci. 16 (2015) 22350–22367.

[28] LP Sun, X. Xu, HH Hwang, X. Wang, KY Su, YL Chen, Diklorometanski ekstrakti propolisa štite stanicu od oksidativnog stresa induciranog nedostatkom kisika i glukoze, Y. Liu et al. Biomedicine & Pharmacotherapy 99 (2018) 671–680 679putem smanjenja apoptoze, Food Nutr. Res. 60 (2016) 30081.

[29] L. Wang, Y. Zhang, T. Asakawa, W. Li, S. Han, Q. Li, B. Xiao, H. Namba, C. Lu, Q. Dong,Neuroprotektivnoučinak neuroserpina u astrocitima štakora tretiranim deprivacijom kisika i glukoze i reoksigenacijom in vitro, PLoS One. 10 (2015) e0123932.

[30] Z. Zhiwen, W. Haitao, S. Fu, Z. Lihua, JL Peter, Q. Remi, Z. Wenhua, Litijevi ioni umanjuju apoptozu izazvanu nedostatkom seruma u stanicama PC12 kroz regulaciju signalizacije Akt/FoxO1 putova, Psychopharmacology (Berl) 12 (2015) 625–633.

[31] EJB Dariush Mozaffffarian, S. Alan, et al., Izvršni sažetak ažuriranja statistike o srčanim bolestima i moždanom udaru za 2016. Izvješće American Heart Association, Circulation 133 (2016) 447–454.

[32] JE Jumblatt, TA, Regulacija veznih mjesta muskarinskih liganda faktorom rasta živaca u PC12 stanicama feokromocitoma, Nature 297 (1982) 152-154.

[33] S. Afrazi, S. Esmaeili-Mahani, V. Sheibani, M. Abbasnejad, Neurosteroid allopregnanolone attenuates high glucose-induced apoptosis and spriječi eksperimentalnu dijabetičku neuropatsku bol: in vitro i in vivo studije, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 139 (2014) 98–103.

[34] X. Liu, X. Zhu, M. Chen, Q. Ge, Y. Shen, S. Pan, Resveratrol štiti stanice PC12 od apoptoze izazvane OGD/R putem signalnog puta posredovanog mitohondrijima, Acta Biochem Biophys Sin . 48 (2016) 342–353.

[35] PW Kleikers, K. Wingler, JJ Hermans, I. Diebold, S. Altenhofer, KA Radermacher, B. Janssen, A. Gorlach, HH Schmidt, NADPH oksidaze kao izvor oksidativnog stresa i molekularna meta u ishemiji/reperfuziji ozljeda, J. Mol. Med. (Berl) 90 (2012) 1391–1406.

[36] FC Liu, HI Tsai, HP Yu, Zaštitni učinci ekstrakta crnog vina, resveratrola, kod reperfuzijske ozljede posredovane oksidativnim stresom, Oxid. Med. Cell Longev. (2015) 568634.

[37] LK Seidlmayer, VV Juettner, S. Kettlewell, EV Pavlov, LA Blatter, EN Dedkova, Različiti mehanizmi aktivacije mPTP u ishemiji-reperfuziji: doprinosi Ca2 plus plus, ROS, pH i anorganskog polifosfata, Cardiovasc. Res. 106 (2015) 237–248.

[38] F. Su, AC Guo, WW Li, YL Zhao, ZY Qu, YJ Wang, Q. Wang, YL Zhu, Prekondicioniranje niske doze etanola štiti od deprivacije kisika/glukoze/reoksigenacije izazvane neuronske ozljede aktiviranjem velike vodljivosti , Ca2 plus plus -aktivirani K plus plus kanali In Vitro, Neurosci. Bik. 33 (2017) 28–40.

[39] Y. Li, M. Wang, S. Wang, Učinak inhibicije mitohondrijske fisije na energetski metabolizam u hipokampalnim neuronima štakora tijekom ishemije/reperfuzijske ozljede, Neurol. Res. (2016) 1–8.

[40] C. Rui, L. Yuxiang, H. Yinju, Z. Qingluan, W. Yang, Z. Qipeng, W. Hao, M. Lin, L. Juan, Z. Chengjun, et al., Zaštitni učinci Polisaharid Lycium barbarum na primarno uzgojenim hipokampalnim neuronima novorođenčadi štakora oštećenih nedostatkom kisika i glukoze i reperfuzijom, J. Mol. Histol. 43 (2012) 535–542.

[41] BR Broughton, DC Reutens, CG Sobey, Apoptotski mehanizmi nakon cerebralne ishemije, Moždani udar 40 (2009) e331-339.

[42] Jordan M. Willcox, AJS Summerlee, Relaxin štiti astrocite od hipoksije in vitro, PLoS One. 9 (3) (2014) e90864.

[43] X. Zhang, D. Yuan, Q. Sun, L. Xu, E. Lee, AJ Lewis, BS Zuckerbraun, MR Rosengart, protein kinaza ovisna o kalciju/kalmodulinu regulira PINK1/Parkin i DJ{{3} } putovi mitofagije tijekom sepse, FASEB J. 31 (2017) 4382–4395.

[44] S. Vasseur, S. Afzal, J. Tardivel-Lacombe, DS Park, JL Iovanna, TW Mak, DJ-1/ PARK7 je važan medijator staničnih odgovora izazvanih hipoksijom, Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 106 (2009) 1111–1116.

[45] Z. Xianghong, Y. Du, S. Qian, X. Li, L. Emma, ​​J. Anthony, Brian Lewis, S. Zuckerbraun, Matthew R. Rosengart, Kalcij/kalmodulin-ovisna protein kinaza regulira PINK1/ Parkin i DJ-1 putevi mitofagije tijekom sepse, FASEB J. (2017). [

46] MS Choi, T. Nakamura, SJ Cho, X. Han, EA Holland, J. Qu, GA Petsko, JR Yates 3rd, RC Liddington, SA Lipton, Transnitrosylation from DJ-1 to PTEN attenuates neuronal cell death u modelima Parkinsonove bolesti, J. Neurosci. 34 (2014) 15123–15131.

[47] RK Dongworth, UA Mukherjee, AR Hall, R. Astin, SB Ong, Z. Yao, A. Dyson, G. Szabadkai, SM Davidson, DM Yellon, DJ Hausenloy, DJ-1 štiti od smrti stanica nakon akutne srčane ishemije-reperfuzijske ozljede, Cell Death Dis. 5 (2014) e1082.

[48] ​​A. Di Cello, M. Di Sanzo, FM Perrone, G. Santamaria, E. Rania, E. Angotti, R. Venturella, S. Mancuso, F. Zullo, G. Cuda, F. Costanzo, DJ{ {1}} je pouzdan serumski biomarker za razlikovanje visokorizičnog raka endometrija, Tumor Biol. 39 (2017) 1010428317705746.

[49] H. Aleyasin, MW Rousseaux, PC Marcogliese, SJ Hewitt, I. Irrcher, AP Joselin, M. Parsanejad, RH Kim, P. Rizzo, SM Callaghan, et al., DJ-1 štiti nigrostrijatal osi iz neurotoksina MPTP modulacijom AKT puta, Proc. Natl. Akad. Sci. USA 107 (2010) 3186-3191.

[50] RM Canet-Aviles, MA Wilson, DW Miller, R. Ahmad, C. McLendon, S. Bandyopadhyay, MJ Baptista, D. Ringe, GA Petsko, MR Cookson, Protein Parkinsonove bolesti DJ-1 jeneuroprotektivnizbog mitohondrijske lokalizacije potaknute cistein-sulfinskom kiselinom, Proc. Natl. Akad. Sci. USA 101 (2004) 9103–9108.

[51] M. Liu, B. Zhou, ZY Xia, B. Zhao, SQ Lei, QJ Yang, R. Xue, Y. Leng, JJ Xu, Z. Xia, Hyperglycemia-induced inhibition of DJ-1 ekspresija je ugrozila učinkovitost ishemijske postkondicionirane kardioprotekcije kod štakora, Oxid. Med. Cell Longev. (2013) (2013) 564902.