Cistanche Herba ima antidepresivno djelovanje kod kroničnog nepredvidivog stresa
Mar 20, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
Yang Li, et al
SAŽETAK
Cistanche tubulosa, jedna vrsta Cistanches Herba, nedavno je potvrđeno da ima antidepresivnu učinkovitost kod štakora s kroničnim nepredvidivim stresom (CUS) obnavljanjem homeostaze crijevne mikrobiote. U ovom radu, cilj nam je istražiti metabolički profil C. tubulosa u normalnih i CUS-induciranih depresivnih modela štakora in vitro i in vivo. Upotrebom UPLC-Q-TOF-MS, in vitro gastrointestinalni metabolizamEkstrakt Cistanche tubulosa(CTE) procijenjen je i kod normalnih i kod CUS štakora. U isto vrijeme, in vivo metabolizam CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u normalnih i depresivnih štakora također je ispitan u urinu i izmetu štakora. Ukupno 20 i 26 metabolita karakterizirano je iz metabolizma in vitro i in vivo kod normalnih i CUS štakora. CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)metaboliziran je u aglikone i produkte razgradnje feniletanoidnih glikozida (PhGs) i iridoidnih glikozida bilo pomoću normalne ili depresivne crijevne mikrobiote štakora in vitro. Metaboliti faze II aglikona i produkti razgradnje PhG i iridoidnih glikozida bili su glavni metaboliti u urinu i izmetu štakora. Dodatno, metabolička sposobnost stvaranja sekundarnih glikozida i aglikona u depresivnoj crijevnoj mikrobioti štakora bila je mnogo slabija od one u normalnoj crijevnoj mikrobioti štakora, što se pripisuje poremećenim glikozidnim hidrolazama koje proizvodi crijevna mikrobiota u štakora s CUS depresijom. Rezultati ove studije postavili su temelj za razumijevanje metaboličkog procesa i terapeutskog mehanizma antidepresivnog svojstva CTE-a.
Ključne riječi: Cistanche tubulosa, DepresijaMetabolizam, In vitro, In vivo, Intestinalna mikrobiota
1. Uvod
Cistanches Herba službeno je zabilježena kao osušena sočna stabljika Cistanche deserticola (YC Ma) i C. tubulosa (Schrenk), koja se koristi za liječenje nedostatka bubrega, impotencije, ženske neplodnosti, morbidneukoreje, obilne metroragije i staračkog zatvora [1]. Suvremene farmakološke studije pokazale su da Cistanches Herba posjeduje različite biološke aktivnosti kao što su anti-neurodegeneracija, imunoregulacija i protuupalna [2,3]. Naša prethodna istraživanja su to potvrdilaEkstrakt Cistanche tubulosa(CTE), koji se sastoje od 48,6 posto feniletanoidnih glikozida (PhG), 6,9 posto iridoidnih glikozida i 20.0 posto ukupnih saharida, mogli bi značajno ublažiti simptome depresije depresivnih štakora izazvanih kroničnim nepredvidivim stresom (CUS) obnavljanje homeostaze crijevne mikrobiote [4]. Nedavna istraživanja pokazuju da su promjene u sastavu crijevne mikrobiote povezane s razvojem i napredovanjem depresije [5,6]. Relativna brojnost mikrobnih rodova bila je izrazito poremećena kod štakora s CUS depresivnim modelom u usporedbi s normalnim kontrolama [7]. U pacijenata s depresijom, raznolikost i bogatstvo crijevne mikrobiote također su značajno promijenjeni [8]. Štoviše, različiti spojevi uključujući feniletanoidne glikozide (PhG) i iridoidne glikozide smatrani su glavnim sastojcima Cistanches Herba [2,3], koji su se lako metabolizirali u svoje sekundarne glikozide i aglikone uključujući hidroksitirozol (HT), 3,4-dihidroksifenetil glikozid, deglikozilirana genipozidna kiselina itd. ljudskom crijevnom mikrobiotom. Ovi se metaboliti lakše apsorbiraju kroz crijeva i pokazuju biološku aktivnost u skladu s prototipnom komponentom [9-11]. Stoga vjerujemo da će tijekom nastanka i razvoja depresije poremećaj strukture crijevne mikroflore neizbježno utjecati na metabolizam oralnih tradicionalnih kineskih lijekova (TCM) u probavnom traktu, osim što će utjecati na fiziološko stanje domaćina. Većina postojećih metaboličkih podataka o Cistanches Herba dolazi iz metaboličkih studija na zdravim životinjama [12-15]. Stoga bi klinički značajnije bilo istražiti metabolički profil CTE-a(ekstrakt Cistanche tubulosa)u patološkom stanju u razjašnjavanju njegovih bioaktivnih komponenti i razumijevanju mehanizma djelovanja za njegovu antidepresivnu učinkovitost.
U trenutnoj studiji, cilj nam je karakterizirati metaboličke profile CTE-a(ekstrakt Cistanche tubulosa)kod zdravih i CUS-induciranih depresivnih modela štakora pomoću tekućinske kromatografije ultra-učinkovitosti kvadrupolne masene spektrometrije vremena leta (UPLC-Q-TOF-MS). Želučani sok, crijevna tekućina i mikrobiota normalnih i depresivnih patoloških štakora korišteni su za simulaciju metaboličkog procesa CTE-a(ekstrakt Cistanche tubulosa)u gastrointestinalnom traktu in vitro, neovisno i sekvencijalno. In vivo metaboliti su također razjašnjeni nakon oralne primjene CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u normalnih i CUS štakora. Ova studija pruža nove uvide u metabolizam i aktivne metabolite CTE-a(ekstrakt Cistanche tubulosa)za depresiju.
2. Materijal i metode
2.1. Materijal
Osušene stabljike C. tubulosa sakupljene su iz okruga Hetian (Xinjiang, Kina). Uzorke uzoraka vaučera potvrdio je prof. Xiaobo Li i pohranio ih je u herbarij Farmaceutskog fakulteta šangajskog sveučilišta Jiao Tong (Šangaj, Kina). Korištena je metoda ekstrakcije kako je navedeno u našoj prethodnoj publikaciji [4]. TheEkstrakt Cistanche tubulosa(CTE) uzorci su pohranjeni na 4 stupnja i ponovno otopljeni sa sterilnom vodom prije upotrebe. Sterilne vodene otopine CTE-a(ekstrakt Cistanche tubulosa)uzorci su zatim filtrirani kroz 0.22 μm membranu, a filtrati su sakupljeni u sterilne epruvete.
Ehinakozid je osigurao laboratorij dr. Pengfei Tua, Pekinško sveučilište (Peking, Kina). Akteozid, izoakteozid, 2'-acetilakteozid i cistanozid A kupljeni su od Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). Hidroksitirozol, kafeinska kiselina, 3,4-dihidroksibenzenpropionska kiselina, 3-hidroksifenilpropionska kiselina i 3-fenilpropionska kiselina kupljene su od Aladdin IndustrialInc. (Šangaj, Kina). Pomoću HPLC-UV utvrđeno je da je čistoća svake komponente > 95 posto. HPLC-grade acetonitril je kupljen od Mercka (Darmstadt, Njemačka). Deionizirana voda pripremljena je iz destilirane vode pomoću sustava za pročišćavanje vode Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, SAD). Svi ostali korišteni reagensi i kemikalije bili su analitičkog stupnja.
2.2. Pokusi na životinjama
Muški štakori Sprague-Dawley (200 ± 20 g) nabavljeni su od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Peking, Kina) i smješteni u Laboratory Animal Center Shanghai JiaoTong University (Shanghai, Kina). Životinje su držane u grupnim kućama na kontroliranoj sobnoj temperaturi (25 ± 2 stupnja, 55 ± 10 posto relativne vlažnosti) s ciklusom svjetlo-mrak od 12:12 h. Štakorima je dopušten slobodan pristup redovitoj hrani za laboratorijske štakore i vodi tijekom 1 tjedna. Objekte i protokole za životinje odobrio je Odbor za etiku životinja Šangajskog sveučilišta Jiao Tong (Šangaj, Kina).
Nakon jednotjedne prilagodbe, dvanaest naivnih štakora nasumično je podijeljeno u dvije skupine (n=6), kontrolnu skupinu i skupinu s kroničnim nepredvidivim stresom (CUS). Štakori CUS razvijeni su kao u našem prethodnom izvješću [4], koji su bili podvrgnuti raznim stresorima: bijeli šum (100 dB) tijekom 1 sata, noćno stroboskopsko osvjetljenje niskog intenziteta (120 bljeskova/min), nedostatak vode tijekom 24 sata, prazan boce s vodom 1 h (nakon uskraćivanja vode), uskraćivanje hrane 24 h, fizičko sputavanje (1-2 h), prisilno plivanje (5 min), prljavi kavez 24 h (200 mL vode u 100 g podloge od piljevine), štipanje repa ( 1 min), šok 30 min, nagib kaveza od 45 stupnjeva 24 h i osvjetljenje preko noći (12 h). Stresori su primjenjivani kontinuirano i nasumično 4 tjedna, detaljan raspored opisan je u tablici S1. Nakon 4 tjedna stresa, test preferencije saharoze, test otvorenog polja i test hranjenja suzbijanjem novotarija provedeni su kao što je prethodno opisano [4]. Pregled CUS-a i testa ponašanja prikazan je na slici S1. Nakon testova ponašanja, najmanje 4 fekalne pelete su dobivene od svakog štakora i stavljene u sterilne stožaste epruvete za in vitro analizu CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)metabolizam.
2.3. Gastrointestinalni metabolizam CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)normalnim i CUS štakorom in vitro
2.3.1. Metabolizam CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u simuliranim želučanim i crijevnim sokovima
Pedeset miligrama CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)dodani su u 10 mL simuliranog želučanog soka, odnosno crijevnog soka. Zatim CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)je inkubirana na 37 stupnjeva 4 h u želučanom soku i 6 h u crijevnom soku. Uzgajana smjesa (1 mL) je ugašena s 3 mL n-butanola zasićenog vodom odmah u 0 i 4 h u želučanom soku, te u 0 i 6 h u crijevnom soku. Metoda obrade korištenog uzorka bila je kao što je prethodno opisano [9].
2.3.2. Metabolizam CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)normalnom i CUS crijevnom mikrobiotom štakora
Svježi normalni i CUS uzorci fecesa štakora prvo su pomiješani i homogenizirani s 25 puta većim volumenom GAM bujona. Sedimenti su uklonjeni filtracijom kroz tri komada gaze. Suspenzija je zatim inkubirana na 37 stupnjeva u anaerobnom inkubatoru u kojem je zrak zamijenjen plinskom smjesom (H2 5 posto, CO2 10 posto, N2 85 posto). Pedeset miligrama CTE je dodano u 5 mL normalne i CUS fekalne suspenzije štakora odvojeno, a suspenzija je inkubirana na 37 stupnjeva 48 h. Uzgajana smjesa je uklonjena i ekstrahirana vodom zasićenim n-butanolom na 0, 12, 24 i 48 h. Metoda obrade uzorka opisana je prethodno [9].
2.3.3. Sekvencijalni metabolizam CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)pomoću želučanog soka, crijevnog soka, normalne i CUS crijevne mikrobiote štakora
Prvo, 100 mg CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)je dodan u 1{{10}} mL simuliranog želučanog soka i inkubiran na 37 stupnjeva 4 h. Cijela reakcija je ugašena 3-strukim volumenom n-butanola zasićenog vodom i centrifugirana na 3000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta, nakon čega je uslijedilo isparavanje supernatanta pod strujom dušika plin na 37 stupnjeva. Drugo, ostatak je ponovno otopljen u 0,4 mL sterilne vode, dodan u 8 mL simuliranog crijevnog soka i inkubiran na 37 stupnjeva 6 h. Uzorak sa želučanim sokom je prethodno pripremljen na isti način. Na kraju, ostatak je ponovno otopljen u 0,3 mL sterilne vode, dodan u 6 mL normalne i CUS fekalne suspenzije štakora, te inkubiran na 37 stupnjeva 48 h u anaerobicinubatoru. Jedan mililitar reakcije ugašen je s 3 mL vodom zasićenog n-butanola odmah 0 i 4 h u želučanom soku, 0 i 6 h u crijevnom soku i 0, 12, 24 i 48 h u crijevnoj mikrobioti štakora . Uzorak je obrađen identično CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u simuliranom želučanom soku.
2.4. Metabolizam CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)normalnim i CUS štakorom in vivo
Svaki štakor u dvije skupine potom je smješten u pojedinačni metabolički kavez. Nakon gladovanja preko noći koje je dopuštalo samo slobodan pristup vodi, svim štakorima je oralno davano 2 mL vode putem želudačne sonde. Prazni uzorci urina i fekalija prikupljeni su od svih štakora od 0 h do 12 h. Nadalje, CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)(400 mg/kg) primijenjeno je gavažom. Uzorci urina i fecesa prikupljani su od 0 do 24 sata. Svi uzorci urina i fekalija odmah su pohranjeni na -80 stupnjeva.
Uzorci urina i fekalija normalnih i CUS štakora prethodno su obrađeni kako je prethodno opisano [12]. Svi dobiveni uzorci analizirani su pomoću UPLC-Q-TOF-MS.
2.5. Analitička metoda
UPLC je izveden na Waters ACQUITY UPLC sustavu (WatersCorp., Milford, MA, SAD) s ACQUITY UPLC BEH C18 kolonom (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , SAD) gradijentnom elucijom pomoću {{10}}.1 posto acetonitrila mravlje kiseline (A) i 0.1 posto mravlje kiseline u vodi (B) pri brzini protoka od 0,4 mL/min . Profil gradijenta bio je: 0-5 min (A:5-20 posto), 5-7,5 min (A: 20-30 posto), 7,5-10 min (A: 30-70 posto), 10-11 min (A : 70-100 posto), i držana je 1,5 min. Gradijent je recikliran natrag na 5 posto u 0,5 min i držan 2,5 min za sljedeću rundu. Volumen injekcije bio je 3 μL. Temperatura peći stupca bila je postavljena na 35 stupnjeva.
Masena spektrometrija je provedena pomoću Waters Vion IMS masenog spektrometra (Waters Corp., Milford, MA, SAD). Ionizacija je provedena u negativnom elektrospreju (ESI−). MS parametri bili su sljedeći: kapilarni napon, −2.0 kV; konusni napon, 20 V; temperatura izvora, 120 stupnjeva; temperatura desolvatacije, 500 stupnjeva ; protok plina konusa i desolvatacije, 50 odnosno 1000 L/h. Za točno mjerenje mase, leucin-enkefalin je korišten kao masa zaključavanja za generiranje [M–H]- iona (m/z 554,2615). Eksperiment MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) u dvije funkcije skeniranja proveden je kako slijedi: funkcija 1 (niska energija): m/z 50–1000, 0,25 s vrijeme skeniranja, 0,02 s kašnjenje između skeniranja, 6 eV energija sudara; funkcija 2 (visoka energija): m/z50–1000, 0,25 s vrijeme skeniranja, 0,02 s kašnjenje između skeniranja, rampa energije sudara od 20–45 eV.
2.6. Obrada podataka
Podaci su obrađeni pomoću softvera UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, SAD) za identifikaciju metabolita unutar točnih masovnih neobrađenih podataka prikupljenih putem MSE. Spojevi su identificirani na temelju točne mase, fragmenata u visokoenergetskoj masenoj spektrometriji. Prag intenziteta postavljen je na 100,0 brojača. Identifikacija cilja, tolerancija podudaranja fragmenata i drugi parametri automatski su postavljeni.
3. Rezultati
3.1. Promjene u ponašanju kod štakora s depresijom izazvanom CUS-om
Štakori sa depresivnim simptomima izazvanim CUS-om procijenjeni su bihevioralnim testovima uključujući test sklonosti saharozi, test otvorenog polja i test hranjenja s potiskivanjem novosti. Studentov t-test otkrio je da su preferencija saharoze u testu sklonosti saharozi (p < 0,001),="" ukupna="" prijeđena="" udaljenost="" u="" testu="" otvorenog="" polja="" (p="">< 0,001)="" i="" kašnjenje="" pri="" jelu="" u="" testu="" hranjenja="" sa="" suzbijanjem="" novotarija="" (p="">< 0,01)="" bili="" značajno="" razlikuje="" se="" u="" usporedbi="" s="" kontrolnom="" skupinom="" nakon="" 4-tjednog="" liječenja="" cus-om="" (slika="" 1).="" ovi="" nalazi="" pokazuju="" da="" je="" model="" kroničnog="" nepredvidivog="" stresa="" uspješno="">
3.2. Karakterizacija kemijskih sastojaka CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)
Sveobuhvatna analiza prototipskih sastojaka CTE-a(ekstrakt Cistanche tubulosa)je provedeno pomoću UPLC-Q-TOF-MS. Ukupno 27 sastavnica iz CTE-a(ekstrakt Cistanche tubulosa)otkriveni su i provizorno karakterizirani, uključujući 20 PhG, 5 iridoida i iridoidnih glikozida i 2 oligosaharida. Detaljne informacije uključujući vrijeme zadržavanja, točnu MS i MS/MS fragmente iona navedene su u Dodatnim informacijama (Tablica S2) kako bi se pružio uvid u strukturu ovih kemijskih sastojaka. UPLC-Q-TOF-MS ukupni ionkromatogram (TIC) CTE prikazan je na slici S2.
3.3. Gastrointestinalni metabolizam CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)normalnim i CUS štakorom in vitro
U ovoj studiji potencijalni metaboliti CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)normalnim i CUS štakorima in vitro su detektirani iz TIC-ova i identificirani kombinacijom elementarnih sastava i MS/MS fragmenata spektra mase nakon njihove usporedbe s kontrolnim uzorcima. Svi metaboliti iz CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u simuliranim želučanim i crijevnim sokovima, normalna i CUS crijevna mikrobiota štakora navedena je u tablici 1.
3.3.1. Metabolizam CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u simuliranim želučanim i crijevnim sokovima
Sedam metabolita CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u simuliranom želučanom soku provizorno su identificirani točnim podacima o masi i MSE fragmentima: M1 (m/z 315,1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12, 2,36 min), M5 (m/z 445,1715, C20H30O11, 2,60 min), M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20, 4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H48O21, 5,73 min) i M18 (m/z 623 .1968, C29H36015, 5,81 min). Deglikozilacija, dehidroksilacija, dehidrogenacija i izomerizacija smatrane su glavnim metaboličkim putevima za CTE u želučanom soku. Utvrđeno je da M4 i M5 imaju molekularnu težinu 2 Da i 16 Da nižu od njihove komponente prototipa, dekafeoilakteozida, te su stoga identificirani kao njegovi dehidrogenirani, odnosno dehidroksilirani proizvodi. M12 je identificiran kao izomer ehinakozida, stvarajući iste ione kao ehinakozid na m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.
Isti metaboliti otkriveni su nakon CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)inkubacija u crijevnom soku. Važno je spomenuti da su kofeoilnu skupinu na položaju C-6' u PhGs lako metabolizirali probavni enzimi u crijevnom soku kako bi se proizveli njeni dekafeilni metaboliti i kafeinska kiselina.
3.3.2. Metabolizam CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)normalnom i CUS crijevnom mikrobiotom štakora
Ukupno 20 metabolita bio-transformiranih iz CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u normalnoj crijevnoj mikrobioti otkriveni su i identificirani (slika 2). Iz tih rezultata uočeno je da su PhG razgrađeni na aglikonski hidroksitirosol (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) i kavenu kiselinu (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min), a zatim su dalje su metabolizirani u M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6 (m/z 181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, 4,35 min) i M11 (m/z 165,0552 , C9H10O3, 4,36 min) dehidroksilacijom, redukcijom i metilacijom. Osim toga, središnji metabolički putovi koji proizvode izravne metabolite PhG prototipa spojeva iz CTE u normalnoj crijevnoj mikrobioti štakora su redukcija, metoksilacija, deglikozilacija, dekafeoil, dehidrogenacija i izomerizacija.
Nakon inkubacije u intestinalnoj mikrobioti štakora s CUS-induciranom depresijom, CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)je pretvoren u 20 metabolita kroz iste metaboličke putove kao normalni štakori.
3.3.3. Sekvencijalni metabolizam CTE pomoću želučanog soka, crijevnog soka, normalne i CUS crijevne mikrobiote štakora
Nakon sekvencijalne inkubacije u želučanom soku, crijevnom soku, normalnoj i CUS crijevnoj mikrobioti štakora, CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)je metaboliziran u 14 metabolita (uključujući 8 sa želučanim sokom, 7 sa crijevnim sokom, 11 sa normalnom i 10 sa CUS crijevnom mikrobiotom štakora). Među njima, M2(HT) i M11 (3-hidroksifenilpropionska kiselina, 3-HPP) bili su konačni metaboliti PhG nakon sekvencijalne inkubacije CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u želučanom soku, crijevnom soku i crijevnoj mikrobioti. Nije bilo značajne razlike u metabolitima između normalnog i CUS štakora.
M8, M9, M14, M17, M19 i M20 otkriveni su samo u neovisnom metabolizmu CTE kod normalne i CUS crijevne mikrobiote štakora. Ovi su metaboliti uglavnom bili metabolički intermedijeri koji su u potpunosti metabolizirani u konačne metabolite u studiji sekvencijalnog metabolizma CTE-a i stoga ih je teško detektirati.
3.3.4. Razlike između brzine metabolizma CTE kod normalne i CUS crijevne mikrobiote
Razjasniti razlike između brzine metabolizma CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)prema normalnoj i CUS crijevnoj mikrobioti štakora, relativni sadržaji 27 prototipskih spojeva i 20 metabolita nakon inkubacije sa želučanim sokom, crijevnim sokom, normalnom i CUS crijevnom mikrobiotom štakora određeni su odvojeno i sekvencijalno (tablice S3 i S4). Rezultati su pokazali da iako nije bilo značajnih razlika između CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)metabolita normalnih i depresivnih štakora, uočena je značajna razlika u njihovim metaboličkim stopama. Na primjer, C2 i C5 su identificirani kao 8-epiloganska kiselina ili njezin izomer. Potpuno su metabolizirani u normalnim uzorcima unutar 12 sati inkubacije. U patološki depresivnoj crijevnoj mikrobioti štakora, međutim, temeljito su metabolizirani nakon 48 sati inkubacije. Bilo je očito da je stopa metabolizma kod normalnog štakora bila brža od one kod CUS štakora. Slični rezultati su otkriveni za C18 (izoakteozid). Štoviše, važno je napomenuti da je područje vrha M12 (izomerizacija ehinakozida) i M16 (izomerizacija tubulozida A) u normalnim uzorcima bilo mnogo veće od onog u CUS uzorcima, što ukazuje da je reakcija izomerizacije CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)bio je prisutniji u normalnoj crijevnoj mikrobioti štakora nego u depresivnoj crijevnoj mikrobioti štakora.
3.4. Metabolizam CTE kod normalnog i CUS štakora in vivo
Usporedbom bioloških uzoraka skupine tretirane CTE sa slijepim biološkim uzorcima, ukupno 26 metabolita (spoj 1-26) CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)otkriveni su innormalni i CUS štakori (Tablica 2). Tipični UPLC kromatogrami normalnih i CUS uzoraka urina štakora prikazani su na slici 3.
3.4.1. Karakterizacija metabolita CTE u normalnom i CUS raturinu
Ukupno 18 in vivo metabolita CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u normalnim uzorcima urina štakora privremeno su identificirani. Metaboliti razgradnje PhG, uključujući HT i CA, i njihova daljnja sulfatizacija (spoj 1, 2, 3, 5, 8 i 16), metilacija (6, 21, 22 i 24) i metoksilacija (13 i 14) bili su metaboliti glavni metaboliti u normalnom urinu štakora. Iridoidni glikozidi lako su se metabolizirali u aglikone (23, 25 i 26) putem deglikozilacije. Važno je napomenuti da nijedna komponenta prototipa nije otkrivena u normalnom uzorku urina štakora.
U uzorku urina depresivnog štakora, 22 metabolita CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)otkriveni su i karakterizirani. Jedan prototip spoja, 8-epiloganska kiselina, otkrivena je u patološkom urinu štakora. Ostali metaboliti bili su u skladu s onima pronađenim u normalnom urinu štakora, uključujući sulfatirane metabolite (1, 2, 3, 8, 10 i 16), metilirane metabolite (6, 11, 19 i 22), metoksilirane metabolite (13 i 14) HT i CA, te aglikoni iridoidnih glikozida (25 i 26).
3.4.2. Karakterizacija metabolita CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u normalnim i CUS ratfecesima
U ovoj studiji, samo jedan metabolit (spoj 20, 3-HPP) CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)je identificiran u normalnom izmetu štakora. Većina PhG-a prvo je razgrađena do CA i posljedično podvrgnuta daljnjem metabolizmu do svog glavnog mikrobnog metabolita, 3-HPP. U fekalnom uzorku štakora CUS, 3 metabolita su uvjetno karakterizirana, uključujući sulfatirani 3-HPP (spoj 16) i sulfatirani HT (spoj 2 i 3).
3.4.3. Razlike između in vivo metabolita CTE u normalnih i CUS štakora
Nakon oralne primjene CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa), in vivo metaboliti pokazali su očite razlike u zdravih i depresivnih model štakora. 21 metabolit (spoj 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 i 19–26) otkriven je u uzorcima zdravih i CUS štakora. Spoj 23 (deglikozilirana genipozidna kiselina) identificiran je samo u uzorcima zdravih štakora, dok su spojevi 4 (HT), 7 (8-epiloganska kiselina), 15 (3, 4-dihidroksibenzenpropionska kiselina) i 18 ({{ 19}}HPP glukuronidna konjugacija) otkriveni su samo u uzorcima štakora CUS modela. Ukratko, sastojci prototipa otkriveni su samo u CUS štakora, dok je više metabolita faze II otkriveno u normalnih štakora.
4. Rasprava
U ovoj studiji, tri modela inkubacije in vitro uključujući želučani sok, crijevni sok, normalnu i CUS crijevnu mikrobiotu štakora korištena su neovisno i uzastopno kako bi se istražio gastrointestinalni metabolički profil CTE-a(ekstrakt Cistanche tubulosa)in vitro. Utvrđeno je da PhG i iridoidni glikozidi u CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)su se lako metabolizirali u svoje sekundarne glikozide i aglikone pomoću CUS-inducirane depresivne crijevne mikrobiote štakora. Nakon toga, in vivo metabolizam CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u normalnih i CUS štakora također je potvrđeno. Predloženi metabolički putevi za CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)u zdravih i depresivnih štakora izazvanih CUS-om prikazani su na slici 4. PhG-ovi, kao što su ehinakozid i akteozid, metabolizirani su u HT i CA, a CA je prošao daljnji metabolizam u svoj glavni mikrobni metabolit, 3-HPP. HT, CA i 3-HPP su zatim metabolizirani u svoje sulfatirane, metilirane i metoksilirane metabolite. Iridoidni glikozidi uključujući genipozidnu kiselinu, kankanozid A i kankanozid N metabolizirani su u svoje aglikone putem deglikozilacije. Ovo je dalje pokazalo da PhG i iridoidni glikozidi u CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)su se lako metabolizirali u sekundarne glikozide i aglikone u CUS štakora. Ti metaboliti obično pokazuju bolju crijevnu apsorpciju i bioraspoloživost da bi se dalje apsorbirali u krv kako bi iskazali biološku aktivnost [16-18]. Vrijedno je napomenuti da je izomerizacija prevladavala za PhG u gastrointestinalnom traktu, relevantni metaboliti su identificirani nakon usporedbe s UPLC retencijskim vremenom njihovih prototipnih spojeva na temelju neoptimiziranog profila idealnog UPLC gradijenta.
Kafeinska kiselina bila je primarni produkt razgradnje CTE-a(ekstrakt Cistanche tubulosa)depresivnom patološkom crijevnom mikrobiotom štakora. Prethodne publikacije su izvijestile da kafeinska kiselina proizvodi učinke slične antidepresivima u testu prisilnog plivanja na miševima. I razina mRNA neurotrofnog faktora (BDNF) u frontalnom korteksu i razina TrkB mRNA u amigdali značajno je smanjena nakon testa prisilnog plivanja, a prvo smanjenje je značajno inhibirano kavenom kiselinom [19]. Hidroksitirozol je bio aglikon PhGs, koji štiti neurogenezu i kognitivnu funkciju sprječavanjem stresom izazvane regulacije neuralnog proteina BDNF [20]. Stoga je potrebno više pozornosti posvetiti nekim bioaktivnim metabolitima (tj. HT i CA) koje crijevna mikrobiota transformira nakon oralne primjene.
Osim toga, sadašnji nalazi pružaju dokaze da je kod depresivne crijevne mikrobiote štakora metabolička sposobnost stvaranja sekundarnih glikozida i aglikona bila znatno slabija nego kod normalne crijevne mikrobiote štakora. Razlog se vjerojatno pripisuje depresiji izazvanim strukturnim promjenama crijevne mikrobiote, što dovodi do smanjene aktivnosti metaboličkih enzima koje proizvodi crijevna mikrobiota [21]. Zanimljivo je da je prethodna studija pokazala da vrsta Bacteroidetes kodira najobilnije gene glikozidne hidrolaze i polisaharidne liaze za hidrolizu glikozida i cijepanje složenih ugljikohidrata s mehanizmom eliminacije [22]. Konkretno, Bacteroides spp. uključujući B. caccae, B. dorei, B. finegoldii,B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis iB. xylanisolvens pokazao je dominantan ukupni broj gena koji kodiraju GH i PL. Parabacteroides distasonis također ima ista svojstva [22]. Naše prethodne studije potvrdile su da je 28-dnevna kronična nepredvidljiva stresna stimulacija smanjila relativnu brojnost rodova Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas i Weissella, dok je povećala Ruminococcus i Deinococcus u štakora [4]. Važno je napomenuti da su Bacteroides i Parabacteroides bile dvije najzastupljenije mikrobne taksone koje su činile približno 20 posto relativne količine u normalnih štakora. Nakon tretmana CUS-om, relativne količine Bacteroidesa i Parabacteroidesa naglo su pale na približno 5 posto kod štakora s depresivnim modelom. Stoga će to neizbježno dovesti do smanjenja ukupnog broja enzima GH i PL u CUS štakora, te dodatno remeti reakciju deglikozilacije CUS-om depresivne crijevne mikrobiote nakon oralne primjene CTE-a.(ekstrakt Cistanche tubulosa)u model štakora.
5. Zaključak
U ovoj studiji, tehnika UPLC-Q-TOF-MS uspostavljena je i primijenjena za probir i identifikaciju metabolitaEkstrakt Cistanche tubulosau normalnih i CUS depresivnih štakora in vitro i in vivo. Rezultati su pokazali da CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa)metaboliziran je u aglikone i produkte razgradnje PhG-a i iridoidnih glikozida kod zdrave i depresivne crijevne mikrobiote. Nakon oralne primjene CTE(ekstrakt Cistanche tubulosa), metaboliti faze II aglikona i produkti razgradnje PhG i iridoidglikozida pretežno su pronađeni u urinu štakora. Metabolička sposobnost stvaranja sekundarnih glikozida i aglikona u depresivnoj crijevnoj mikrobioti štakora bila je mnogo slabija od one u normalnoj crijevnoj mikrobioti štakora, što se pripisuje poremećenim glikozidhidrolazama koje proizvodi crijevna mikrobiota kod CUS depresivnih štakora. Ova studija pruža novu perspektivu za kasnije razvoj CTE-a(ekstrakt Cistanche tubulosa)kao potencijalni antidepresiv.
Priznanja
Ovaj rad je podržan bespovratnim sredstvima Kineskog nacionalnog ključnog programa za istraživanje i razvoj (2017YFC1702400).
Dodatak A. Dopunski podaci
Dodatni podaci za ovaj članak mogu se pronaći online na HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728
Iz: 'In vitro i in vivo metabolizamEkstrakt Cistanche tubulosakod normalnih i kroničnih nepredvidljivih depresivnih štakora izazvanih stresom' poYang Li, et al
---Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728
Reference
[1] Komisija kineske farmakopeje, Farmakopeja Narodne Republike Kine, izdanje 2015., China Medical Science Press, Peking, Kina, 2015., str. 135 I dio.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Analiza kemijskih sastojaka u Cistanche vrstama, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: pregled njegovih kemijskih, farmakoloških i farmakokinetičkih svojstava, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Učinci slični antidepresivimaEkstrakt Cistanche tubulosana štakorima kroničnog nepredvidivog stresa kroz obnovu homeostaze crijevne mikrobiote, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Os crijevo-mozak: kako mikrobiom utječe na anksioznost i depresiju, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Nedavni razvoj u razumijevanju uloge crijevne mikrobiote u zdravlju i bolesti mozga, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Varijacije u crijevnoj mikrobioti i fekalnom metaboličkom fenotipu povezanom s depresijom sekvenciranjem gena 16S rRNA i LC/ MS-based metabolomics, J. Pharm. Biomed. analno 138 (2017) 231–239.
[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transferring the blues: depression-associated gut microbiota induces neurobihevioralne promjene kod štakora, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Ljudski gastrointestinalni metabolizam vodenog ekstrakta biljke Cistanches Herba in vitro: razjašnjenje metaboličkog profila na temelju sveobuhvatne identifikacije metabolita u želučanom soku, intestinalnom sok, ljudske crijevne bakterije i crijevni mikrosomi, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Identifikacija metabolita ehinakozida koje proizvode ljudske crijevne bakterije pomoću tekućinske kromatografije ultraučinkovitosti/kvadrupolne time-of-flight masene spektrometrije, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Probir i identifikacija tri tipična metabolita feniletanoidnih glikozida iz Cistanches Herba ljudskim crijevnim bakterijama pomoću UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. analno 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Brzi pregled i identifikacija razlika između metabolita vodenog ekstrakta Cistanche deserticola i C. tubulosa u štakora pomoću UPLC-a Q-TOF-MS kombinirana analiza prepoznavanja uzoraka, J. Pharm. Biomed. analno 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Sustavno karakterizirajte metabolite ehinakozida i akteozida iz Cistanche tubulosa u plazmi, žuči, urinu i izmetu štakora na temelju UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Pristup identificiranju sekvencijalnih metabolita tipični feniletanoidni glikozid, ehinakozid, temeljen na tekućinskoj kromatografiji - vrijeme zamke iona od
analiza masene spektrometrije leta, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolizam ehinakozida, dobrog antioksidansa, u štakora: izolacija i identifikacija njegovih bilijarnih metabolita, Lijek Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Razumijevanje molekularnih mehanizama međudjelovanja između biljnih lijekova i crijevne mikrobiote, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Apsorpcija i dispozicija ginsenozida nakon oralne primjene primjena ekstrakta Panax notoginseng štakorima, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interakcije crijevne mikrobiote s funkcionalnim komponentama hrane i nutraceuticima, Pharmacol. Res. 61 (2010.) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Caffeic acid smanjuje smanjenje ekspresije kortikalne BDNF mRNA izazvano izlaganjem prisilnom plivački stres kod miševa, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Primjena hidroksitirozola kod majke poboljšava neurogenezu i kognitivnu funkciju kod prenatalno stresnih potomstvo, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Utjecaj crijevne mikrobiote na metabolizam i toksičnost lijekova, Expert Opin. Lijek Metab. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Obilje i raznolikost enzima koji djeluju na ugljikohidrate u mikrobioti ljudskog crijeva, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.
