Otkriće novih STING inhibitora temeljenih na strukturi mišjeg STING agonista DMXAA
Nov 27, 2023
Sažetak:
Protein gena stimulatora interferona (STING) uključen je u urođeni imunitet. Lijek DMXAA (5,6-dimetilksantenon-4-octena kiselina) pokazao se snažnim agonistom mišjeg STING-a (mSTING), ali je imao mali učinak na ljudski STING (hSTING). U ovom se radu oslanjamo na usporedbu različitih kristalnih struktura i analizu odnosa interakcija protein-ligand kako bismo se usuđivali s hipotezom da dizajn lijekova varijanti DMXAA ima potencijal pretvoriti STING agoniste u inhibitore. Na temelju našeg prethodnog otkrića dva DMXAA analoga, 3 i 4 (oba bi se mogla vezati za STING), strukturno smo ih optimizirali i sintetizirali nove derivate. U testovima vezanja, otkrili smo da spojevi 11 i 27 predstavljaju STING veziva koja su bila bolja od izvornih struktura i raspravljali o odnosima strukture i aktivnosti. Svi ciljani spojevi bili su neaktivni u staničnom ispitivanju za probir STING agonističke aktivnosti. Zadovoljno, identificirali smo 11 i 27 kao inhibitore STING-a s mikromolarnom aktivnošću u oba puta hSTING i mSTING. Uz to, 11 i 27 inhibirali su indukciju interferona i upalnih citokina aktiviranih 20 3 0 -cGAMP-om bez vidljive citotoksičnosti. Ova otkrića razbijaju kruto mišljenje da DMXAA pruža strukturnu osnovu posebno za STING agoniste i otvara više mogućnosti za razvoj novih STING agonista ili inhibitora.
cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav
Ključne riječi:
UBOSTI; DMXAA; selektivnost vrste; STING agonist; STING inhibitor
1. Uvod
Gen stimulator interferona (STING) bitna je signalna molekula za intrinzični imunitet, primarno posredujući prirodnim imunološkim odgovorima izazvanim citoplazmatskom DNA [1]. Kada DNA receptor ciklička gvanozin-adenozin fosfat sintaza (cGAS) detektira unutarstaničnu dvolančanu DNA, cGAS katalizira sintezu 2 0,30 -cGAMP (Slika 1), cikličkog dinukleotida (CDN) sposobnog izravnog vezanja i aktiviranja STING-a na endoplazmatskom retikulumu [2-4]. Nakon aktivacije, STING formira agregate koji se regrutiraju nizvodno do kinaze 1 (TBK1) koja veže TANK i veže regulatorni faktor interferona 3 (IRF3), koji fosforilira IRF3, aktivira dimere IRF3 u jezgri, inducira ekspresiju interferona tipa I (IFN) i inicira imunološki odgovor na interferon [1]. Mnoge studije su pokazale da je STING uključen u patogenezu višestrukih bolesti i da stimulacija STING-a izaziva učinkovite imunološke odgovore na patogene infekcije i karcinome; međutim, neuspjeh u modulaciji kroničnog upalnog signaliziranja dovodi do autoimunih i upalnih bolesti [5-8]. Zbog temeljne uloge STING-a u regulaciji urođenog imuniteta, veliki broj timova je počeo razvijati STING agoniste ili inhibitore.
Slika 1. Reprezentativni STING modulatori
Istraživanje STING agonista prve generacije usmjereno je na strukturnu modifikaciju analoga CDN-a kako bi se zaobišla neka ograničenja endogenih CDN-ova, kao što je slaba propusnost membrane i osjetljivost na hidrolizu fosfatazama [9,10]. Mala molekula STING agonista 5,6-dimetilksantenon-4-octene kiseline (DMXAA), koja je pokazala terapeutsko obećanje protiv solidnih tumora na mišjim modelima, mogla bi se suprotstaviti nedostacima CDN derivata [11]. Međutim, lijek nije uspio u kliničkim ispitivanjima na ljudima [12]. Nadalje je potvrđeno da se DMXAA selektivno veže na mišji STING (mSTING), a ne na ljudski STING (hSTING) [13,14], što sprječava terapeutski potencijal DMXAA kod ljudi. 10-Karboksimetil-9-akridinon (CMA) još je jedan reprezentativni STING agonist specifičan za mišje koji se ranih 1970-ih koristio kao snažan induktor IFN tipa I za antivirusnu terapiju [15]. Stoga je selektivnost vrsta vitalni čimbenik u razvoju STING agonista malih molekula. Neumornim naporima istraživača, uključujući diABZI, SR717, MSA02 i druge, otkriveni su značajni novi skeletni agonisti hSTING-a [16-19].
koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav
Sve više dokaza pokazuje da je hiperaktivacija STING-a povezana s autoupalnim i autoimunim bolestima. Potrebno je ograničiti pretjeranu aktivaciju STING signalnog puta, što naglašava potencijalnu vrijednost STING inhibitora. Za razliku od agonista STING-a, razvoj inhibitora STING-a još je u povojima i nijedan kandidat za lijek još nije ušao u kliničke studije. Poznati STING inhibitori uključuju dvije vrste spojeva: kompetitivne antagoniste (SN-011 i Merck-18) i kovalentne inhibitore (H151) [20-22]. Ranije identificirani kovalentni inhibitori STING-a stupaju u interakciju s Cys88/91 ili Cys91 koji se nalazi u N-terminalnoj transmembranskoj domeni STING-a izvan CDN-veznog džepa [22]. Nedavno su dva tima sukcesivno izvijestila o dva strukturna tipa STING antagonista koji zauzimaju 20 3 0 -cGAMP vezni džep kako bi inhibirali aktivaciju 20 3 0 -cGAMP-a, što ukazuje na učinak s dvije oštrice u CDN-vezujućem džepu [20 ,21].
Ovdje nudimo novu perspektivu. Predlažemo da donji džep gdje se nalaze DMXAA i CMA olakšava razvoj inhibitora STING-a na temelju našeg dubinskog rudarenja podataka i usporedbe informacija o ko-kristalnoj strukturi identificiranih STING proteina. Naša prethodna studija izvijestila je o nizu CMA i DMXAA analoga i identificirala spojeve 3 i 4 koji se vežu na hSTING, ali imaju slabu staničnu moć [23] (Slika 2).
Slika 2. Kemijske strukture spojeva 3 i 4 s podacima o njihovim biološkim aktivnostima. Vrijednosti EC50 spojeva 1-4 izmjerene su STING reporterskim stanicama, a IC50 vezanja izmjereni su STING kompetitivnim kompletima za vezanje.
U ovom radu, što se tiče dizajna STING inhibitora za otkrivanje snažnijih vezivnih sredstava s više kontakata u donjem džepu, izvršili smo strukturne optimizacije za 3, odnosno 4. Nakon toga proveli smo SAR studiju na temelju testova vezanja na natjecanje. U procjeni bioaktivnosti, spojevi 11 i 27 djelovali su kao veziva širokog spektra i pokazali su mikromolarne razine STING inhibitorne aktivnosti u više prijavljenih stanica. Što se tiče docking strukture, dvije molekule spoja 11 drže hSTING u neaktivnoj "otvorenoj" konformaciji, kompetitivno inhibirajući endogeno 20 3 0 -cGAMP vezanje, koje je slično kristalnoj strukturi Mercka-18 i docking strukturi od SN-011 [20,21].
2. Rezultati
2.1. Strategija dizajna DMXAA derivata kao STING inhibitora
2.1.1. Identifikacija mjesta dizajna za STING inhibitore usporedbom različitih kristalnih struktura
Apo-protein domene vezanja liganda STING (LBD) kristalizirao je kao simetrični dimer u ne-ligandu, za što je dokazano da nije uzrokovano analizom gel filtracije i analitičke ultracentrifugacije [24-26]. STING dimer ima konformaciju sličnu leptiru s mjestom vezanja liganda smještenim na granici između dva monomera. Prvo, ovaj rad ispituje infrastrukturne i aktivacijske mehanizme proteina hSTING i mSTING, uspoređujući razlike među njima, kao i otkrivajući neke intrigantne uvide. Za apo strukturu, prirodna konformacija obaju proteina pokazuje da je mSTING koncentriraniji od hSTING-a (Slika 3). Shih i sur. upotrijebili su simulacije molekularne dinamike (MD) za proučavanje razlika između hSTING i mSTING, pokazujući da hSTING preferira otvorenu-neaktivnu konformaciju, a mSTING preferira zatvorenu-aktivnu konformaciju čak i bez vezanja liganda [27].
Kada je vezan za 20,30 -cGAMP, konformacijski prijelaz hSTING-a je iz otvorenog (apo-protein, lateralna udaljenost ~57 Å) u zatvoreni (cGAMP-vezan protein, lateralna udaljenost ~40 Å), dok je suprotno vrijedi za mSTING (29 Å do 40 Å). Struktura apo-hSTING-a dramatično se razlikuje od strukture apo-mSTING-a, ali se strukture STING-a kompleksiranog s 20,30 -cGAMP preklapaju. DMXAA, CMA i cGAMP su agonisti STING-a s različitim strukturnim skelama, ali njihove aktivacijske konformacije nakon vezanja na mSTING proteine također su u osnovi iste (Slika 3). Gore opisani scenariji svjedoče da su mehanizmi stimulacije hSTING-a i mSTING-a izrazito različiti; konformacije koje aktivira STING su, međutim, relativno konstantne, neovisne o selektivnosti vrste i vrsti okosnice agonista (iako su ograničene na STING agoniste koji dovode do konformacijskih promjena). Volumeni veznih džepova različitih kristalnih kompleksa općenito su konvergentni (~300 Å3, tablica S1), što je dodatni dokaz stabilnosti aktivacijske konformacije proteina STING.
Slika 3. Usporedba apo- i vezanih spojeva STING kristalnih struktura. Protein mSTING je pšenica (udaljenost testirana crvenom linijom), PDB kod: 4KC0 (apo), 4LOJ (vezani-cGAMP), 4LOL (vezani-DMXAA) i 4JC5 (vezani-CMA)
Drugo, na temelju gornjih nalaza aktivacijske konformacijske stabilnosti, superponirali smo kokristalne strukture cGAMP-a, DMXAA, CMA, SR717 i MSA02, koji su STING agonisti zatvorene konformacije, kako bismo istražili položaj različitih strukturnih agonista u Vezna mjesta STING proteina. Proteinski džep može se podijeliti u dvije regije: donji džep i gornji džep, prateći distribuciju STING agonista u proteinskom džepu (Slika 4a). Osim mSTING agonista DMXAA i CMA koji su potpuno u donjem džepu, drugi agonisti mogu aktivirati hSTING put i ležati u gornjoj regiji. Zatim smo mapirali interakcije pet STING agonista s aminokiselinskim ostacima vezanim za STING protein (unutar 5 Å od liganda; slika S1), pokazujući da primarne aminokiseline uključuju R238, Y167, R232, S162, T263 i T267 (mSTING odgovarajući redni broj ostataka minus jedan). Usporedba ostataka uzastopno s džepovima pokazala je da T267, T263 i S162 leže u donjem džepu; gornji džep sadrži R238, R232 i Y167 (Slika 4b). Kao što je objavljeno, R238, Y167 i R232 ključni su za vezanje agonista na STING, posebno R238 (protein mSTING odgovara R237), čija bi mutacija rezultirala potpunim gubitkom stabilizacije (vezivanje liganda) [28-30]. Che i sur. također je otkrio da ključni ostatak R238 dominira vezanjem DMXAA, a točkaste mutacije (S162A/E260I) mogu poboljšati interakciju R238 s DMXAA pomoću MD simulacija [31].
cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav
Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta
【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Kako bi zauzeli mSTING proteinski džep, DMXAA ili CMA usvojili su jedinstveni način vezanja u kojem se dva agonista malih molekula vežu za jedan mSTING homodimer. DMXAA se čvrsto postavljaju na donji džep pomoću vodikovih veza između keto skupine i bočnog lanca T266 (hSTING odgovara 267), dok karboksilatna skupina stupa u interakciju s bočnim lancima R237 i T262 (Slika 5a). Interakcija DMXAA s R237 (jedina ključna aminokiselina u gornjem džepu) ključna je za mSTING aktivnost. Detalj koji se često zanemaruje je da DMXAA može djelovati samo na R237 simetričnih monomernih proteina, na primjer, DMXAA (molekula A) koja utječe na R237B (Slika 5a). Budući da se DMXAA nalazi na dnu, udaljenost između molekule A i R237B je 3,06 Å, dok je udaljenost do R237A veća od 5 Å (Slika 5b). Koristeći prednosti kompaktnijeg džepa proteina mSTING, DMXAA bez napora stupa u interakciju s R237 simetričnog monomera mSTING, ali ne postoji način da se DMXAA poveže s bilo kojim od R238 u konformacijsko otvorenom proteinu apo-hSTING (Slika 3). Stoga položaj DMXAA u džepu smanjuje stimulaciju hSTING puta. Nedavno je Merck, inspiriran 2:1 omjerom vezanja DMXAA, otkrio STING antagoniste koji mogu zauzeti vezni džep [21]. Kristalni kompleks Merck 18 i hSTING proteina pokazuje da je spoj uglavnom smješten ispod proteinskog džepa i da je u interakciji sa S162, T263 i T267, od kojih svi odgovaraju svojstvima DMXAA (Slika 5c). Iz ovoga su generirane hipoteze: gornji džep izvrsna je šupljina za dizajniranje STING agonista; donji džep je prikladnije gnijezdo za inhibitore, a struktura DMXAA ili CMA je optimizirana da ima potencijal da postane STING antagonist.
Slika 4. Podjela STING veznih mjesta i distribucija s ključnim aminokiselinama. (a) Lokacija dviju regija u STING monomeru. Donji džep je magenta boje, a gornji džep zelene boje. PDB kodovi za preklapajuće kristalne komplekse su sljedeći: 4LOH (cGAMP, zeleno), 6UKV (MSA-02, žuto), 6XNP (SR717, narančasto), 4LOL (DMXAA, magenta) i 4JC5 (CMA, ljubičasta). (b) Distribucija ključnih aminokiselina u gornjim i donjim regijama. Ostaci u donjem džepu prikazani su magenta bojom, a zeleni su u gornjem dijelu.
Slika 5. Kristalni kompleksi DMXAA i Merck 18. (a) Međumolekularni kontakti u kompleksu DMXAA i mSTING. Vezani DMXAA prikazan je sivom bojom, s pojedinačnim STING podjedinicama u simetričnom dimeru prikazanim zelenom i ljubičastom bojom. Superskripti A i B označavaju identitet monomera proteina ili pojedinačnog liganda. (b) Udaljenosti između ključnih ostataka R237A i R237B, odnosno DMXAA (molekula A). R237A prema karboksilu DMXAA je 6,02 Å, R237B prema karboksilu DMXAA je 3,06 Å. (c) Kristalna struktura Merck 18 vezanog na hSTING protein (PDB 6MXE) i detalji njegovih međumolekularnih kontakata. Vezani ligand prikazan je sivom bojom, a pojedinačne STING podjedinice u simetričnom dimeru prikazane su zelenom i ljubičastom bojom. Superskripti A i B označavaju identitet monomera proteina ili pojedinačnog liganda
Slika 6. Osnova istraživanja i naše optimizirane vruće točke za DMXAA i CMA derivate. (a) Superpozicija strukture DMXAA vezanog na mSTING (PDB: 4LOL, prikazano kao tamnoplavo) sa strukturom DMXAA vezanog na hSTING S162A/G230I/Q266I (PDB: 4QXR, prikazano kao narančasto). (b) Pojedinosti o DMXAA vezanom na mutirani hSTING (PDB: 4QXR). Isprekidani okviri predstavljaju potencijalna mjesta modifikacije. Amino ostaci prikazani zeleno su mutirani ostaci (S162A/Q266I).
Otkrili smo da je nemogućnost DMXAA da aktivira stazu domaćina povezana s lokacijom DMXAA u donjem džepu (prema odjeljku 2.1.1), što nam je također dalo ideju dizajna STING inhibitora: povećanje kontakata DMXAA derivata s donjim područjem kroz strukturne izmjene kako bi STING ostao u neaktiviranoj konformaciji. S162 i Q266 prikladno leže na dnu veznog mjesta, tako da DMXAA mogu biti dobro pozicionirani u izravnom kontaktu s oba, olakšavajući istraživanje učinka aminokiselina donjeg džepa na ligande. Analiza odnosa strukture i aktivnosti (SAR) otkrila je da su 5,6-dimetilni dio i C7-položaj metoksi ključni za biološku aktivnost 3 i 4. Kao što je prikazano na slici 6b, 5 ,6-dimetilna skupina stvorila je hidrofobne interakcije s više aminokiselina u donjem džepu; zbog blizine položaja C7 DMXAA u odnosu na aminokiselinu Q266, odgovarajuća metoksi modifikacija omogućila je 3 i 4 da se vežu za domaćin. Stoga su naše strukturne elaboracije pretpostavile zaključavanje 5,6-dimetila i C7 metoksi, te dizajn novih derivata usmjerenih na modificiranje polarne skupine na položaju C1/C2 (utječući na S162) i promjenu skupine karboksilne kiseline ( proširenje strukturne raznolikosti). Dizajnirali smo i sintetizirali niz derivata koristeći spojeve 3 i 4 kao skele, čime smo potvrdili našu predloženu pretpostavku o inhibitoru.
2.2. Kemija
Priprava svih intermedijarnih i ciljanih spojeva prikazana je u Shemi 1. 1-metoksi-2, 3-dimetil-4-nitrobenzen (5) i 2-brombenzojeva kiselina ( 7) bili komercijalno dostupni. U početku je 1-metoksi-2,3-dimetil-4-nitrobenzen pretvoren u 4-metoksi- 2,3-dimetilanilin (6) redukcijom željeznim prahom. Zatim su 6 i 7 podvrgnuti Ullmannovoj reakciji s kalijevim karbonatom uz katalizu bakrom i bakrovim (I) oksidom u N,N-dimetilformamidu da se dobije odgovarajući međuprodukt 8. Reakcija intramolekularne kondenzacije 8 izvedena je s Eatonovim reagensom da se dobije međuprodukt 2-metoksi-3,4-dimetilakridin-9(10H)-on (9). Naknadna supstitucija 9 izvedena je s etil bromoacetatom, a gubitak 1 ekvivalenta HBr dao je etil 2-(2-metoksi-3,4-dimetil-9- oksoakridin-10(9H)-il)acetat (10). Konačno, etil acetat u 10 hidroliziran je u karboksilnu kiselinu natrijevim hidroksidom dajući 2-(2-metoksi-3,4- dimetil-9-oksoakridin-10 (9H)-il)octena kiselina (11).
Shema 1. a. EtOH, Fe, NH4Cl; b. DMF, Cu, Cu2O, K2CO3; c. Eatonov reagens; d. BrCH2COOC2H5, NaH; e. NaOH; f. CC13CH(OH)2, NH2OH; g. H2SO4; h. EtOH, H2O2, NaOH.
Za kasniju sintezu više ciljanih spojeva, prvo moramo sintetizirati spoj 2-amino-5-metoksi-3,4-dimetilbenzojeva kiselina (14). 6 je reagirao s kloral hidratom i hidroksilaminom, formirajući acetamid i hidroksiamino, s međuproduktom (E)-2-(hidroksilamin)-N-(4-metoksi-2,3-dimetilfenil )acetamid (12). Naknadna Beckmannova reakcija preraspodjele hidroksiamino spoja 12 izvedena je sa sumpornom kiselinom da se dobije laktamski derivat 13. Konačno, međuprodukt 13 je hidroliziran s vodikovim peroksidom i natrijevim hidroksidom u otopini etanola dajući 14. Koristeći 14 kao početni materijal za reakciju, mi smo dalje sintetizirao niz 8-metoksi-9,10-dimetil-6Hpirolo[3,2,1-de]akridina-1,6( 2H)-dionski derivati sa supstituentima na R1 i R2. U početku su 14 i 15-19 podvrgnuti Ullmannovoj reakciji s kalijevim karbonatom uz katalizu bakrom i bakrovim(I) oksidom u N,N-dimetilformamidu da bi se dobili odgovarajući međuprodukti 20-24. Reakcije intramolekularne kondenzacije 20-24 izvedene su s Eatonovim reagensom da se dobije 8-metoksi-9,10-dimetil-6H-pirolo[3,2,{{46} }de]akridin-1,6(2H)- dionski derivati (25-29). Slično, koristeći 14 kao početni materijal za reakciju, dalje smo sintetizirali niz 7-metoksi-5,6-dimetil-9-okso-9,{{ 59}}dihidroakridin-4- derivati karboksilne kiseline sa supstituentima na R. U početku su 14 i 7 ili 30 podvrgnuti Ullmannovoj reakciji s kalijevim karbonatom uz katalizu bakrom i bakrovim(I) oksidom u N,N-dimetilformamidu da se dobije odgovarajući međuprodukti 31 i 32. Reakcije intramolekularne kondenzacije 31 i 32 izvedene su s Eatonovim reagensom da se dobije 7-metoksi-5,6-dimetil-9-okso-9 ,10-dihidroakridin-4-derivati karboksilne kiseline (33,34). Stoga smo dizajnirali, sintetizirali i pregledali 16 analoga akridona, čije su strukture sažete u tablici 1.
Tablica 1. Strukture novih analoga ove studije.
2.3. Sposobnosti vezanja novih spojeva na STING i njihove SAR-ove
Sposobnosti vezanja novih spojeva za STING i njihove SAR-ove Kako bismo izravno potvrdili učinkovitost strukturne modifikacije, prvo smo pregledali sve sintetizirane spojeve pomoću cGAMP testova istiskivanja. Osim selektivnosti vrste, postoji pet varijanti STING-a koje su polimorfne kod ljudi, R232 (WT, 58% populacije), HAQ (20%), H232 (13%), AQ (7%) i Q ( 2%) [32]. Stoga smo upotrijebili komercijalne kompetitivne komplete za ispitivanje pomoću tehnologije homogene vremenski razlučne fluorescencije (HTRF) za testiranje biokemijske moći novih spojeva na mSTING i različite hSTING izoforme (WT, H232 i AQ) i usporedili ih s kontrolom. Kao što se očekivalo, svi kontrolni spojevi 1-4 bili su vezani za mSTING; iz hSTING ekrana, spojevi 3 i 4 su imali IC50 vrijednosti na mikromolarnoj razini.
Tablica 2. Rezultati spojeva s različitim hSTING izoformama i mSTING kompetitivnim testovima vezanja.
Prvo je, na temelju spoja 3, atom halogena ili metoksi skupina uvedena na mjesto C1/C2 (Tablica 1). Spoj 27, kao optimalni derivat spoja 3 (C1 položaj supstituiran s F), ima bolju ukupnu aktivnost od spoja 3 (jednoznamenkasta mikromolarna aktivnost u svim biokemijskim testovima, tablica 2). R1-modificirani spoj 25 ima učinak vezanja širokog spektra, ali nije toliko aktivan kao F-supstituirana ili nesupstituirana verzija. U usporedbi sa spojem 3, svi spojevi (26, 28 i 29) s uvedenom skupinom C2-mjesta pokazali su različite stupnjeve smanjenja afiniteta vezanja, posebno spoj 29. Drugo, zadržavanje okosnice spoja 4 i zamjena atoma halogena naspram C1/C2 mjesta, dobili smo spojeve 35-38 (Tablica 1). Ovi spojevi su bili neaktivni u sva četiri testa istiskivanja pri koncentracijama do 100 µM, pokazujući da se supstitucija s atomom halogena na C1/C2 mjestu ne tolerira. Zatim smo acetatnu skupinu na spoju 4 pretvorili u karboksilnu skupinu (33) i uveli metoksi na C2 mjesto (34). Nažalost, ova promjena nije uspjela jer su oba spoja ostala neaktivna. Učeći na našem neuspjehu, dodatno smo istražili SAR-ove derivata spoja 4 pomicanjem acetatne skupine na položaj N i ostavljanjem položaja C1/C2 nepromijenjenima. Spoj 11 pokazuje vezanje na širok raspon STING varijanti, sve s IC50 ispod 20 µM; aktivnost je bolja od spoja 4 i usporediva sa spojem 27. Osim toga, spoj 9 (nema karboksilne skupine na N mjestu) i spoj 10 (N-acetat etil) sintetski su prekursori spoja 11 koji se ne mogu vezati na STING, neizravno pokazujući važnost grupe karboksilnih kiselina.
2.4. Stanična biološka evaluacija
2.4.1. In vitro probir novih analoga sa STING agonističkim aktivnostima
Sustavno smo pregledali sve spojeve na aktivnost agonista STING-a koristeći 293T hSTING-WT, 293T-mSTING i THP1-KO-STING reporterske stanične linije (osigurane od Invivo Gen). Koristeći stanice 293T-hSTING-R232 i stanice 293T-mSTING, pokazali smo aktivaciju IRF puta kao neizravnu mjeru indukcije IFN tipa I praćenjem aktivnosti sekretorne embrionalne alkalne fosfataze (SEAP), pridonoseći našem proučavanju selektivnosti vrste spojevi. THP1-KO-STING stanice stvorene su iz THP1-dualnih stanica stabilnim nokautom STING gena, a mi smo upotrijebili THP1-KO-STING stanice kako bismo potvrdili pokazuje li spoj funkciju indukcije citokina ovisne o STING-u. Usporedili smo STING agonističke aktivnosti svih ciljanih derivata s onima referentnih agonista za mišji (DMXAA) i ljudski (20,30 -cGAMP) STING. Iznenađujuće, niti jedan od sintetiziranih spojeva nije mogao aktivirati ni hSTING ni mSTING put (maksimalna koncentracija pri 200 µM), što je ozbiljno nedosljedno s rezultatima testova vezanja. Stoga naši ispitani STING vezivni agensi mogu imati potencijalne obrasce vezanja kao novi STING antagonisti.
2.4.2. In vitro skrining STING veziva sa STING inhibitorskim aktivnostima
Prvo smo proveli predeksperimente: s 1 µM kovalentnim inhibitorom H151 kao pozitivnom referencom, istražili smo njegove inhibicijske razine u mSTING i hSTING reporterskim staničnim linijama ko-kultiviranim s različitim koncentracijama 20 3 0 -cGAMP-a kako bismo odredili optimalne uvjete za probir inhibitora (pogledajte odjeljak 4.2.3 za detalje protokola). Drugo, inicijalno smo ispitali inhibicijski potencijal novih spojeva tretiranjem predeksperimentalnim metodama u koncentraciji od 100 µM. Otkrili smo da spojevi 11 i 27 koji vežu STING širokog spektra pokazuju odličnu inhibiciju u mišjim i ljudskim STING reporterskim stanicama, pri čemu spojevi 3 i 4 i ostali spojevi nisu tako učinkoviti. Treće, postavili smo koncentracijske gradijente za spojeve 11 i 27 kako bismo testirali obje vrijednosti IC50 i usporedili ih s H151. Spojevi 11 i 27 bili su aktivni u mikromolarnim koncentracijama inhibirajući 20 3 0 -cGAMP-induciranu ekspresiju IFN-a u oba puta hSTING i mSTING.
cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav
S IC50 vrijednostima, spoj 11 (hSTING 19,93 µM i mSTING 15,47 µM) nadmašio je spoj 27 (hSTING 38,75 µM i mSTING 30,81 µM) (Slika 7a). Za usporedbu, IC50 vrijednosti H-151 u 293T-hSTING i 293T-mSTING stanicama bile su 1,04 i 0,82 µM (Slika 7a), što ukazuje da kovalentni inhibitor H-151 pokazuje bolji inhibitorni učinak na STING -ovisna signalizacija u analizama na bazi stanica. Kako bismo dodatno potvrdili inhibitorsko svojstvo spojeva 11 i 27, upotrijebili smo drugu THP-1 humanu monocitnu reportersku staničnu liniju THP1-Dual-hSTING-R232, koja koristi dvostruki reporterski sustav za izvještavanje o aktivaciji IRF-a kao neizravna mjera indukcije IFN tipa I i na aktivaciju NF-κB kao neizravna mjera indukcije proupalnih citokina. Nakon stimulacije THP-1 reporterske stanične linije s 20,30 -cGAMP, dodali smo STING inhibitore u odgovarajućim koncentracijama za inhibiciju indukcije I IFN i proupalnog citokina. Kao što se očekivalo, spojevi 11, 27 i H151 značajno su inhibirali aktivacije IRF i NF-κB puta izazvane STING-om (Slika 7b). Osim toga, kako bismo isključili učinak citotoksičnosti spojeva na inhibitornu aktivnost, upotrijebili smo komplet CellTiter-Glo za analizu stanične aktivnosti. Zadovoljavajuće, spojevi 11 i 27 nisu pokazali dokaze citotoksičnosti za 293T i THP-1 stanice testom stanične viabilnosti kada su dodani u koncentracijama (5 do 100 µM) koje inhibiraju STING, za razliku od H151, koji je već pokazao značajnu citotoksičnost na 10 µM (Slika 7c). Ove studije identificirale su spojeve 11 i 27 kao umjerene inhibitore STING-a, koji razbijaju osjetljivost vrste i inhibiraju IRF i NF-κB dualne puteve bez očite citotoksičnosti.
2.5. Strukturna osnova aktivnosti spoja 11 istražena je spajanjem
Mehanizam kompetitivnih STING antagonista je zauzimanje mjesta vezivanja i remećenje aktivacijske konformacije STING proteina [20,21]. Specifično za hSTING, antagonisti ostavljaju hSTING dimer u "otvorenoj" konformaciji. Koristili smo Glide docking kako bismo odredili interakciju između ljudskog STING CTD (PDB ID kod 6MXE) i najboljeg aktivnog spoja 11. U strukturi dockinga, dva spoja 11 su djelomično paralelna jedna s drugom i leže na dnu pukotine dimer hSTING (Slika 8a), zaključavajući hSTING u neaktivnoj otvorenoj konformaciji (Slika S2). Spoj 11 proizvodi uglavnom hidrofobne interakcije, s tricikličkom strukturom liganda koji omogućuje veći kontakt sa sučeljem u donjem džepu. Kao i kod DMXAA ili CMA, karboksilna skupina tvori vodikovu vezu s bočnim lancem T263, dok keto skupina tvori vodikovu vezu s bočnim lancem T267. Metoksi na položaju C2 intimno međudjeluje sa S162, što rezultira međusobnom blizinom ligand-ligand. Bis-metilni supstituenti ne samo da generiraju interakcije ligand-ligand, već su i prikladno smješteni na ulazu u gornji džep, što sprječava vezanje prirodnih STING agonista na ključne ostatke (Slika 8b).
Slika 7. STING-vezivači širokog spektra 11 i 27 su STING antagonisti. (a) Kemijske strukture spojeva 11 i 27 i inhibitorna aktivnost STING inhibitora protiv m- i h-STING putova. 293T stanice (mSTING ili hSTING), prethodno tretirane različitim koncentracijama spojeva stimulirane su s 20,30 -cGAMP; inhibicija aktivnosti IRF puta neizravno je mjerena vrijednostima optičke gustoće (OD). Inhibicijska krivulja ovisna o dozi postavljena je za izračunavanje IC50s spojeva. (b) Spojevi 11 i 27 mogu inhibirati aktivaciju dvostrukih puteva hSTING. THP1-hSTING-R232 reporterske stanične linije stimulirane su s 20,30 -cGAMP i tretirane sa spojevima, inhibirajući indukciju IFN-a (procjena aktivnosti prema relativnim svjetlosnim jedinicama (RLU) Lucia luciferaze ) i indukcija proupalnih citokina (praćenje aktivnosti SEAP-a mjereno OD vrijednostima). (c) Novi analozi pokazuju nisku citotoksičnost u usporedbi s kovalentnim inhibitorom. 293T (ili THP-1 stanice) inkubirane su s naznačenom koncentracijom inhibitora tijekom naznačenih vremenskih razdoblja. Viabilnost stanica mjerena je CellTiter-Glo priborom. Prikazani podaci su srednja vrijednost iz tri neovisna eksperimenta. NS (bez značajnosti) p > 0,05, *** p < 0,001. p vrijednosti izračunate su dvostranim t-testom.
Slika 8. Docking struktura spoja 11 vezanog za STING protein. (a) Način vezanja spoja 11. Vezani ligand prikazan je sivom bojom, s pojedinačnim STING podjedinicama u simetričnom dimeru prikazanim zelenom i ljubičastom bojom. U džepovima za vezivanje STING monomera, dno je obojeno magenta, a vrh je zeleno. (b) Međumolekularni kontakti spoja 11 vezani su za STING. Spoj 11 i STING aminokiseline u kontaktu prikazane su kao štapni model. Međumolekularni kontakti i vodikove veze prikazani su žutom isprekidanom linijom. Superskripti A i B označavaju identitet monomera proteina ili pojedinačnog liganda.
3. Rasprava
U svjetlu opsežnih izvješća o mehanizmu i kristalnoj strukturi STING-a, imamo priliku objasniti znanstveni problem zašto DMXAA nema STING agonističku aktivnost kod ljudi. U ovoj studiji, usporedbom različitih kristalnih struktura STING-a, dobili smo neke zanimljive nalaze: 1. STING aktivacijska konformacija je stabilna; 2. Postoje različiti mehanizmi aktivacije za hSTING i mSTING; 3. DMXAA i CMA su na dnu veznog mjesta što ih razlikuje od ostalih agonista. S obzirom na različite mehanizme aktivacije mSTING-a i hSTING-a, agonisti mSTING-a DMXAA ili CMA smješteni u donjem džepu ne mogu izvršiti aktivaciju u hSTING-u jer apo-hSTING ima veću veznu šupljinu koja sprječava povezivanje liganda s R238.
Gao i sur. izvijestio je da pojedinačne mutacije (G230I, S162A i Q266I) daju hSTING-u istu DMXAA osjetljivost kao mSTING [33]. MD simulacije su otkrile da je bočni lanac mutacije regije poklopca G230I dovoljan za stvaranje steričke barijere za sprječavanje izlučivanja DMXAA, dok DMXAA lako izlazi u hSTING WT [27]. Na temelju strukturne modifikacije koja odgovara hSTING točkastim mutacijama (S162A/Q266I) na veznom mjestu, značajni DMXAA i CMA analozi su bili dostupni, ali ne i snažni hSTING agonisti. Razlog tome mogao bi biti taj što bi suptilna strukturna razlika između "prirodnih" i "mutiranih" hSTING-ova mogla igrati ključnu ulogu u procesu prepoznavanja. Putem MD simulacija, Che et al. otkrili su da neprirodno mutirani hSTING-ovi ometaju koordinirana kretanja molekula vode i mijenjaju količinu vode izbačene nakon vezanja liganda, što je pogodnije za obnavljanje DMXAA aktivacije hSTING-a [31].
Potaknuti studijskim otkrićem STING inhibitora na donjem mjestu vezanja [21], usuđujemo se predvidjeti da DMXAA, smješten u istoj regiji, ima potencijal da se transformira u nove STING inhibitore. U prethodnoj studiji spojili smo strukture DMXAA i CMA sa suptilnim strukturnim modifikacijama i uspješno otkrili 3 i 4 koji se mogu vezati na hSTING, ali njihova slaba STING agonistička aktivnost ne odgovara njihovoj snazi vezanja. U ovom je radu ideja dizajna dodatno poboljšati kontakte DMXAA analoga s donjim džepom kako bi se kompetitivno oduprlo vezanju 20,30 -cGAMP, pa smo dizajnirali i sintetizirali optimizirane strukture spojeva 3 i 4.
cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav
Prvi korak probira bio je testiranje biokemijske aktivnosti korištenjem kompleta za vezanje više varijanti STING-a kako bi se karakterizirala moć vezivanja novih derivata. Rezultati testova vezanja dokazali su ispravnost naših smjernica dizajna; identificirali smo 11 i 27 kao STING veziva širokog spektra (superiorniji od 3 i 4) i raspravljali o SAR-ovima. Za analoge spoja 3, modifikacije na položaju C1 značajno su poboljšale vezanje na različite STING varijante, dok C2-modificirani spojevi nisu imali učinka. Međutim, spoj 4 nije dobro toleriran za strukturne modifikacije u C1/C2. Nakon premještanja položaja karboksilne kiseline (C4 u N), pronašli smo bolje vezivo STING 11 i utvrdili da je skupina karboksilne kiseline neophodna za aktivnost. Zatim smo pregledali sve spojeve na aktivnost na staničnoj razini koristeći tri reporterske stanične linije, i nijedan od ciljnih spojeva nije bio aktivan. Zatim smo uspostavili metodu probira za STING inhibitore i ponovno pregledali sve nove analoge. STING vezivni agensi 11 i 27 pokazali su mikromolarne inhibitorne aktivnosti, s podacima usporedivim s kompetitivnim testom vezanja. Kovalentni inhibitor H151 pokazao je nešto bolju STING inhibitornu aktivnost od 11 i 27 in vitro. Osim toga, dodatno smo potvrdili da 11 i 27 mogu učinkovito inhibirati 20,30 -cGAMP-induciranu aktivaciju STING dvostrukih puteva. Što je najimpresivnije, 11 i 27 održavaju visoku razinu održivosti stanica pri visokim koncentracijama, što nije moguće s H151. Citotoksičnost je čest problem s kovalentnim inhibitorima i ograničava primjenu H151.
Docking analizom stekli smo uvid u strukturnu osnovu djelovanja najboljeg aktivnog spoja 11. Spoj 11 savršeno zauzima donji džep, držeći hSTING u neaktivnoj otvorenoj konformaciji i tako kompetitivno inhibirajući 20,30 -cGAMP vezanje. Struktura tricikličkog prstena akridina ključna je za stvaranje hidrofobnih interakcija, sa skupinom karboksilne kiseline i ketonskim ostatkom koji pričvršćuje spoj na dnu džepa. Nagađamo da metoksi stvara intimne veze sa S162, povlačeći konformaciju proteina marginalno zatvorenu, ali nedovoljno da je pretvori u agonističku konformaciju. Bis-metil struktura stvara prostorno blokiranje mjesta koje pojačava interakcije ligand-ligand i odvraća od ulaska agonista u gornji džep. Trenutačno nema prijavljenih kokristalnih struktura mSTING-a i antagonista STING-a, tako da ne možemo objasniti mehanizam djelovanja spoja 11 s mSTING-om pomoću pristupa spajanja. Međutim, pretpostavljamo da postoje dvije mogućnosti: jedna je da je princip djelovanja identičan principu hSTING-a; drugi je da spoj 11 održava mSTING u agregiranijoj apo konformaciji, a 20,30 -cGAMP ne može ući u džep kako bi izvršio agonistički učinak. Ukratko, naše suptilne strukturne optimizacije slabijih STING agonista uspješno su preokrenule biološku funkciju kako bi otkrile STING inhibitore. Ovi nalazi ilustriraju složenost STING veznih džepova i daju nove istraživačke uvide za razvoj lijekova STING agonista ili inhibitora.
4. Materijali i metode
4.1. Kemija
Otapala i reagensi korišteni u sintezi dobiveni su od Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Peking, Kina). Strukture produkata identificirane su 1H i 13C-NMR spektroskopijom (JNM-ECA-400, Japan). Molekulske težine proizvoda mjerene su masenom spektrometrijom visoke rezolucije (HRMS) s elektrosprej ionizacijom (ESI) kao načinom ionizacije (Agilent 1260-G6230A, Njemačka). NMR i maseni spektri spojeva navedeni su u Dodatnim materijalima. Mi smo sintetizirali i identificirali spojeve 35-38; pojedinosti potražite u prethodno objavljenom članku [23].
Etil {{0}}(2-metoksi-3,4-dimetil-9-oksoakridin-10 (9H)-il)acetat (1{ {25}}): Otopini 4-metoksi{{10}},3-dimetilanilina (6) (0.97 g, 6.4 mmol) i 2-brom-benzojeva kiselina (7) (1,29 g, 6,4 mmol) u DMF-u (6 mL) na sobnoj temperaturi, zatim smo dodali Cu u prahu (0.05 g), Cu2O ({{60}}.05 g) i K2CO3 ({{186}}.71 g, 5,1 mmol). Reakcijska smjesa je zagrijavana na 110 ◦C 12 h. Nakon uklanjanja otapala pod vakuumom, ostatak je otopljen u 1 N otopini NaOH (25 mL). Sirovi produkt je dobiven taloženjem nakon zakiseljavanja filtrata s konc. HCl. Nakon sušenja, sirovi produkt je dodan Eatonovom reagensu (5 mL) na sobnoj temperaturi, zatim je smjesa zagrijavana na 90 ◦C 1 h. Ohlađena reakcijska smjesa je ukapana u zasićenu vodenu otopinu NaHC03. Talog je filtriran da se sakupi grubi produkt. Pročišćavanje ostatka kromatografijom na stupcu silika gela daje 9, blijedo žutu krutinu (0,61 g, 37,7% prinos). Otopina NaH (1,43 mmol) i 9 (0,33 g, 1,3 mmol) u DMF-u (5 mL) na sobnoj temperaturi je miješana 1 sat i zatim ohlađena na 5-7 ◦C. Etil bromoacetat (0,43 g, 2,6 mmol) dodan je dobivenoj smjesi i kontinuirano miješana na sobnoj temperaturi 20 h. Nakon završetka reakcije (TLC), reakcijska smjesa je izlivena u ledenu vodu (15 mL). Rezultirajući precipitati su odfiltrirani, osušeni i zatim ekstrahirani kloroformom. Isparavanje otapala dalo je sirovi ester koji je pročišćen rekristalizacijom da se dobije 10, žuta krutina (0,33 g, 76% donos). 'H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 8,30 (d, J=8,4 Hz, 1H), 8,08 (d, J=8,6 Hz, 1H), 7,75-7,67 (m , 1H), 7,57-7,50 (m, 1H), 7,48 (s, 1H), 5,02 (s, 2H), 4,22 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H) 2,77 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,21 (t, J=7. 1 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) 8 (ppm): 169.25, 157.87, 155.96, 147.46, 146.72, 135.46, 132.15, 130.17, 129.51, 125.88, 122.48, 119.80, 119.46, 95.26, 72.06, 61.28, 56.06, 14.59 , 14.34, 13.77. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C20H21NO4: 339,3910 nađeno: 340,1546. 2-(2-metoksi-3,4-dimetil-9-oksoakridin-10(9H)-il)octena kiselina (11): otopina 10 (0,37 g, 1,1 mmol) i NaOH (0,05 g, 1,3 mmol) u etanolu (20 mL) i vodi (2 mL) zagrijava se na 60 °C 1 h. Nakon uklanjanja otapala, dobiveni ostatak je otopljen u vodi i filtriran. Nakon neutralizacije filtrata s konc. HCl, smjesa je filtrirana da se dobije sirova krutina, zatim rekristalizirana u metanolu da se dobije 11, blijedožuti prah (0,29 g, 85,7% donos). 'H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 10,51 (s, 1H), 8,33 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.04 (d, J=8.5 Hz, 1H , 7,69 (s, 1H), 7,67-7,62 (m, 1H), 7,45 (t, J=6.8 Hz, 1H), 4,52 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 2,75 (s, 3H), 2,31 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) 8 (ppm): 159.04, 155.63, 147.47, 146.64, 134.86, 131.52, 129.56, 128.98, 125.15, 122.85, 120.53, 119.69, 101.77, 96.02, 74.81, 55.69, 14.42, 13.33 . HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C18H17NO4: 311,3370 nađeno: 312,1229.
{{0}}kloro-8-metoksi-9,10-dimetil-6H-pirolo [3,2,1-de]akridin{ {9}},6(2H)-dion (25): u otopinu 6-karboksi-4-metoksi-2,3-dimetilbenzenaminija (14) (1,3 g, 6,4 mmol) i 2-(2-bromo-4-klorofenil)octena kiselina (15) (1,6 g, 6,4 mmol) u DMF-u (6 mL) na sobnoj temperaturi, naknadno smo dodali Cu u prahu (0.05 g), Cu2O (0.{05 g) i K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). Reakcijska smjesa je zagrijavana na 110 ◦C 12 h. Nakon uklanjanja otapala pod vakuumom, ostatak je otopljen u 1 N otopini NaOH (25 mL). Sirovi produkt je dobiven taloženjem nakon zakiseljavanja filtrata s konc. HCl. Nakon sušenja, sirovi produkt je dodan Eatonovom reagensu (5 mL) na sobnoj temperaturi, zatim je smjesa zagrijavana na 90 ◦C 1 h. Ohlađena reakcijska smjesa je ukapana u zasićenu vodenu otopinu NaHC03. Talog je filtriran da se sakupi grubi produkt. Pročišćavanjem ostatka kromatografijom na stupcu silika gela dobije se 25, žuta krutina (0,80 g, 38,6% donos). 'H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 8,17 (d, J =8.1, 1.5 Hz, 1H), 7.86 (d, J=6.9 Hz, IH), 7,51 (s, IH), 3,84 (s, 3H), 3,78 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C18H14ClNO3: 327,7640 nađeno: 328,0734. 4-kloro-8-metoksi-9,10-dimetil-6H-pirolo[3,2,1-de]akridin-1 ,6(2H)-dion (26): Sinteza ovog spoja bila je slična sintezi 25. 15 je zamijenjen s 2-(2-bromo{{114}klorofenil)octenom kiselinom (16). Dobili smo 0,82 g 26 kao blijedožutu krutinu s prinosom od 38,7%. 'H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 7,73 (s, IH), 7,52 (s, IH), 7,38 (s, IH), 3,71 (s, 3H), 3,64 (s, 2H), 2,36 (s, 3H), 2,13 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C18H14ClNO3: 327,7640 nađeno: 328,0734.
{{0}}fluoro-8-metoksi-9,10-dimetil-6H-pirolo[3,2,1-de]akridin{ {9}},6(2H)-dion (27): Sinteza ovog spoja bila je slična 25. 15 je zamijenjen s 2-(2-brom-4-fluorofenil)octenom kiselinom (17). Dobili smo tamnožutu krutinu 27 s 0.84 g (prinos 42,1%). 'H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 8,21 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,23 (d, J {{39} }.5 Hz, IH), 3,88 (s, 3H), 3,81 (s, 2H), 2,53 (s, 3H), 2,30 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C18H14FNO3: 311,3124 nađeno: 312,1030. 4-fluoro-8-metoksi-9,10-dimetil-6H-pirolo[3,2,1-de]akridin-1 ,6(2H)-dion (28): Sinteza ovog spoja bila je slična sintezi 25. 15 je zamijenjen s 2-(2-brom-5-fluorofenil)octenom kiselinom (18). Dobiveno je 0,81 g tamnožute krutine (prinos 40,5%). 'H NMR (400 MHz, DMSOD6) 5 786 (s, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,77 (s, 2H), 2,49 (s, 3H); 2,26 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C18H14FNO3: 311,3124 nađeno: 312,1030.
4,8-dimetoksi-9,10-dimetil-6H-pirolo[3,2,1-de]akridin-1,6(2H )-dion (29): Sinteza ovog spoja bila je slična sintezi 25. 15 je zamijenjen s 2-(2-brom-5-metoksifenil)octenom kiselinom (19). {{20}}.73 g žute krutine dobiveno je s prinosom od 35,2%. 'H NMR (400 MHz, DMSO D6) 8 7,93 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,81 (s, 1H). s, 3H), 3,67 (s, 2H), 2,44 (s, 3H), 2,28 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C19H17NO4: 323,3480 nađeno: 324,1230. 7-metoksi-5,6-dimetil-9-okso-9,10-dihidroakridin-4-karboksilna kiselina (33): u otopinu 6-karboksi-4-metoksi-2,3-dimetilbenzenaminija (14) (1,30 g, 6,4 mmol) i 2-brom-benzojeve kiseline (7) (1,29 g, 6,4 mmol) u DMF (6 mL) na sobnoj temperaturi, zatim smo dodali Cu u prahu (0,05 g), Cu2O (0,05 g) i K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). Reakcijska smjesa je zagrijavana na 110 ◦C 12 h. Nakon uklanjanja otapala pod vakuumom, ostatak je otopljen u 1 N otopini NaOH (25 mL). Sirovi produkt je dobiven taloženjem nakon zakiseljavanja filtrata s konc. HCl. Nakon sušenja, sirovi produkt je dodan Eatonovom reagensu (5 mL) na sobnoj temperaturi, zatim je smjesa zagrijavana na 90 ◦C 1 h. Ohlađena reakcijska smjesa je ukapana u zasićenu vodenu otopinu NaHC03. Talog je filtriran da se sakupi grubi produkt. Pročišćavanjem ostatka kromatografijom na stupcu silikagela dobije se 33, blijedožuta krutina (100 g, 52,7% prinos). 'H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 13,00 (s, 1H), 10,28 (s, 1H), 8,01 (d, J=9,7 Hz, 1H), 7,69 (d , J=8,5 Hz, 1H), 7,48 (t, J=9,0 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H), 3,67 (s, 3H), 2,32 (s, 3H 2,10 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C17H15NO4: 297,3100 nađeno: 298,1073. 2,7-dimetoksi-5,6-dimetil-9-okso-9,10-dihidroakridin-4-karboksilna kiselina (34): sinteza ovog spoja bila je slična 33. 7 je zamijenjen 2-brom-5- metoksibenzojevom kiselinom (30). Žuta krutina je dala 1,05 g s 50,2% prinosom. 'H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 12,96 (s, 1H), 10,45 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 3,84 (s, 1H). 3H), 3,81 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ izračunato za C18H17NO5: 327,3360 nađeno: 328,1179.
4.2. Biološki test
Mišji kompleti za vezanje STING, kompleti za vezanje STING WT za ljude, kompleti za vezanje za ljudski AQ STING i kompleti za vezanje za ljudski H232 STING kupljeni su od Cisbioa. Od Invivogen. 293T mSTING stanice i 293T hSTING-R232 stanice uzgajane su pomoću DMEM (Gibco, Waltham, MA, SAD), 2 mM L-glutamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), 4,5 g/L glukoze (Sigma- Aldrich), 10% FBS (Gibco), Pen-Strep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen, San Diego, CA, SAD) i nadopunjen selektivnim antibioticima (Invivogen ) blasticidin (10 uM), higromicin (100 uM) i zeocin (100 uM). THP1-KO-STING stanice i THP1-KI-hSTING-R232 stanice uzgajane su pomoću RPMI-1640 (Gibco), 2 mM L-glutamina (Sigma-Aldrich), 25 mM HEPES (Sigma-Aldrich), 10% FBS inaktiviran toplinom (Gibco), PenStrep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen) i nadopunjen selektivnim antibioticima (Invivogen) blasticidin ( 10 uM) i zeocin (100 uM). QUANTI-Blue otopina, QUANTI-Luc, 20,30 -cGAMP kupljeni su od Invivogena. H151 je dobiven od Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Peking, Kina). CellTiter-Glo kit za ispitivanje vijabilnosti luminiscentnih stanica nabavljen je od Promege.
4.2.1. HTRF STING kompetitivni test vezivanja
Prema uputama STING kompleta za vezanje, sljedeće otopine su uzastopno dodane u svaku jažicu u 384-ploči s jažicama: 5 µL spojeva za detekciju ili 2 0,30 -cGAMP (pozitivna kontrola ) s različitim koncentracijama ili razrjeđivačem (negativna kontrola); 5 µL ljudskog STING 6His-označenog proteina (jažica negativne kontrole dodana je puferu za detekciju); 10 µL prethodno pomiješane radne otopine STING liganda d2 i Anti 6His-Tb3+. Nakon zatvaranja ploče i inkubacije na sobnoj temperaturi tijekom 3 sata, očitane su vrijednosti fluorescencije na 665 nm i 620 nm. Omjer dvaju intenziteta fluorescencije (665 nm/620 nm) korišten je za procjenu moći vezanja spojeva. Vrijednosti IC50 (50% inhibicijske koncentracije) izračunate su pomoću softvera GraphPad Prism.
4.2.2. Stanični test za probir spojeva za agonističku aktivnost
Količine od 180 µL 293T mSTING stanica, 293T hSTING-R232 stanica i suspenzije THP1-KOSTING stanica raspoređene su u 96-jažičaste ploče s ravnim dnom gustoće od ~50,000 stanica /jažici (293T) ili ~100,000 stanica/jažici (THP1). Dodana je količina od 20 µL fiziološke otopine ili slane otopine ispitivanog spoja, ili 20,30 -cGAMP kao pozitivne reference, a stanice su inkubirane na 37 ◦C s 5% CO2 tijekom 48 sati. Nakon toga, količina od 20 µL supernatanta dodana je u 96-ploču ravnog dna s jažicom, nakon čega je u svaku jažicu dodano 180 µL otopine QUANTI-Blue. Ploča je inkubirana na 37 ◦C 3 sata, a SEAP razine (aktivnost IRF puta) određene su pomoću spektrofotometra na 620-655 nm.
4.2.3. Stanični test za ispitivanje inhibitorne aktivnosti spojeva
Prije eksperimenta: 180 µL 293T mSTING stanica, 293T hSTING-R232 stanica (~50,000 stanica/jažici) stimulirano je 48 h na 37 ◦C u 5% CO2 inkubator s 10 µL 20,30 -cGAMP (3,125 µM, 6,25 µM) i 10 µL H151 (1.0 µM ). Nakon toga, količina od 20 µL supernatanta dodana je u 96-ploču ravnog dna s jažicom, nakon čega je u svaku jažicu dodano 180 µL otopine QUANTI-Blue. Ploča je inkubirana na 37 ◦C 3 sata, a SEAP razine (aktivnost IRF puta) određene su pomoću spektrofotometra na 620-655 nm. 180 µL 293T mSTING stanica, suspenzija 293T hSTING-R232 stanica raspoređeno je u 96-pločice s ravnim dnom s jažicom gustoće od ~50,000 stanica/jažici. Količina od 10 µL 2 0,30 -cGAMP (3.125 µM) i spoj 11 ili spoj 27 (0.78 µM, 1.56 µM, 3.13 µM, 6.25 µM, 12.5 µM, 25 µM, 50 µM, 100 µM) ili H151 (0,08 µM, 0,16 µM, 0,31 µM, 0,63 µM, 1,25 µM, 2,5 µM, 5 µM) su dodani, a stanice su inkubirane na 37 ◦C s 5% CO2 48 h. Nakon toga, količina od 20 µL supernatanta dodana je u 96-ploču ravnog dna s jažicom, nakon čega je u svaku jažicu dodano 180 µL otopine QUANTI-Blue. Ploča je inkubirana na 37 ◦C 3 sata, a SEAP razine (aktivnost IRF puta) određene su pomoću spektrofotometra na 620-655 nm. Vrijednosti IC50 izračunate su softverom GraphPad.
4.2.4. Stanični test za inhibiciju STING dvojnih putova
180 µL stanične suspenzije THP1-KI-hSTING-R232 raspoređeno je u 96-pločice s ravnim dnom s gustoćom od ~100,000 stanica/jažici. Dodana je količina od 10 µL 20,30 -cGAMP i 10 µL spoja 11 (20 µM) ili spoja 27 (33 µM) ili H151 (2 µM), a stanice su inkubirane na 37 ◦C s 5% CO2 tijekom 24 h. Zatim je dodana količina supernatanta u 96-bijelu (neprozirnu) ploču s jažicom, nakon čega je dodana otopina QUANTI-Luc ili QUANTI-Blue u svaku jažicu, a razine luminiscencije ili razine SEAP-a očitane su prema uputama proizvođača. To omogućuje istovremeno proučavanje puta IFN regulatornog faktora (IRF), procjenom aktivnosti Lucia luciferaze i puta NF-κB, praćenjem aktivnosti SEAP.
4.2.5. CellTiter-Glo ispitivanje luminescentne održivosti stanica
Preživljavanje stanica mjereno je CellTiter-Glo kompletom za ispitivanje luminiscentne preživljavanja stanica prema uputama proizvođača. Ukratko, stanice su inkubirane s tri različite koncentracije (5 µM, 10 µM, 100 µM) spoja 11 i spoja 27, ili H-151 tijekom 48 h. 100 µL CellTiter-Glo reagensa dodano je u 96-pločicu za ispitivanje jažica na 10 minuta, a zatim je zabilježena luminiscencija.
4.3. Molekularno spajanje spoja 11
Kristalna struktura kompleksa STING (PDB ID: 6MXE) preuzeta je iz unosa Protein Data Bank i korištena je kao početna točka. Protein je pripremljen korištenjem Maestro preparata proteina i podijeljen na lanac A i lanac B. Generirali smo vezno mjesto u LBD-u STING monomera na temelju izvornog liganda (Merck-18) korištenjem Generation Receptor Grid. Koristili smo SP preciznost Glide-dockinga za dio molekularnog spajanja, dopuštajući spoju 11 da generira najviše 20 poza. U konačnici smo proizveli 16 vezanih konformacija (sve u donjem džepu) i testirali slobodnu energiju vezanja kompleksa koristeći Prime MM-GBSA modul u Schrödingerovom softveru. Nadalje, na temelju rezultata pristajanja, rezultata modela klizanja i rezultata MMGBSA dG Bind, odabrali smo optimalnu konformaciju koja je postigla prvu ocjenu u dva i zauzela treće mjesto u jednom (vidi tablicu S2). Konačno, spojili smo najbolje konformacije A i B lanaca kako bismo dobili potpunu strukturu spajanja.
Reference
1. Abe, T.; Harashima, A.; Xia, T.; Konno, H.; Konno, K.; Morales, A.; Ahn, J.; Gutman, D.; Barber, GN STING Prepoznavanje citoplazmatske DNA potiče staničnu obranu. Mol. Ćelija 2013, 50, 5–15. [CrossRef]
2. Wu, J.; Sun, L.; Chen, X.; Du, F.; Shi, H.; Chen, C.; Chen, ZJ Ciklički GMP-AMP je endogeni sekundarni glasnik u urođenom imunološkom signaliziranju putem citosolne DNA. Znanost 2013, 339, 826–830. [CrossRef]
3. Abe, T.; Barber, GN Indukcija proupalnog gena posredovana citosolnom DNA, ovisna o STING-u zahtijeva kanoničku aktivaciju NF-κB putem TBK1. J. Virol. 2014, 88, 5328–5341. [CrossRef]
4. Cai, X.; Chiu, Y.-H.; Chen, ZJ Put cGAS-cGAMP-STING senzora i signalizacije citosolne DNA. Mol. Ćelija 2014, 54, 289–296. [CrossRef] [PubMed]
5. Gao, D.; Li, T.; Li, X.-D.; Chen, X.; Li, Q.-Z.; Wight-Carter, M.; Chen, ZJ Aktivacija cikličke GMP-AMP sintaze vlastitom DNA uzrokuje autoimune bolesti. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 2015, 112, E5699–E5705. [CrossRef] [PubMed]
6. Li, TJ; Cheng, H.; Yuan, H.; Xu, QM; Shu, C.; Zhang, YF; Xu, P.; Tan, J.; Rui, Y.; Li, PJSR Antitumorska aktivnost cGAMP-a putem stimulacije urođenog imunološkog odgovora posredovanog cGAS-cGAMP-STING-IRF3. Sci. Rep. 2016, 6, 19049. [CrossRef] [PubMed]
7. Motwani, M.; Pesiridis, S.; Fitzgerald, KA Osjećaj DNA putem cGAS-STING puta u zdravlju i bolesti. Nat. Velečasni Genet. 2019, 20, 657–674. [CrossRef]
8. Zhang, H.; Ti, QD; Xu, XL Ciljni stimulator gena interferona (STING): perspektiva medicinske kemije. J. Med. Chem. 2020, 63, 3785–3816. [CrossRef]
9. Gao, J.; Tao, J.; Liang, W.; Zhao, M.; Du, X.; Cui, S.; Duan, H.; Kan, B.; Su, X.; Jiang, Z. Identifikacija i karakterizacija fosfodiesteraza koje specifično razgrađuju 30 3 0 -ciklički GMP-AMP. Cell Res. 2015, 25, 539–550. [CrossRef] [PubMed]
10. Corrales, L.; McWhirter, SM; Dubensky, TW; Gajewski, TF Put STING domaćina na granici raka i imuniteta. J. Clin. Istražite. 2016, 126, 2404–2411. [CrossRef] [PubMed]
11. Baguley, BC; Ching, LM DMXAA: Antivaskularno sredstvo s višestrukim odgovorima domaćina. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2002., 54, 1503–1511. [CrossRef]
12. Lara, PN; Douillard, J.-Y.; Nakagawa, K.; von Pawel, J.; McKeage, MJ; Albert, I.; Losonczy, G.; Reck, M.; Heo, D.-S.; Fan, X.; et al. Randomizirano placebom kontrolirano ispitivanje faze III karboplatina i paklitaksela sa ili bez agensa koji remeti krvne žile Vadimezana (ASA404) kod uznapredovalog karcinoma pluća nemalih stanica. J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965–2971. [CrossRef]
13. Conlon, J.; Burdette, DL; Sharma, S.; Bhat, N.; Thompson, M.; Jiang, Z.; Rathinam, VAK; Redovnici, B.; Jin, T.; Xiao, TS; et al. Mišji, ali ne ljudski STING, veže se i signalizira kao odgovor na vaskularni disruptor 5, 6-dimetilksantenon-4-octenu kiselinu. J. Immunol. 2013, 190, 5216–5225. [CrossRef] [PubMed]
14. Kim, S.; Li, L.; Maliga, Z.; Yin, Q.; Wu, H.; Mitchison, TJ Antikancerogeni flavonoidi su miševi selektivni agonisti STING-a. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1396–1401. [CrossRef] [PubMed]
15. Čavlar, T.; Deimling, T.; Ablasser, A.; Hopfner, K.-P.; Hornung, V. Specifična detekcija antivirusnog spoja malih molekula CMA pomoću STING-a. EMBO J. 2013, 32, 1440–1450. [CrossRef]
16. Ramanjulu, JM; Pesiridis, GS; Yang, J.; Concha, N.; Singhaus, R.; Zhang, S.-Y.; Tran, J.-L.; Moore, P.; Lehmann, S.; Eberl, HC; et al. Dizajn agonista amido benzimidazol STING receptora sa sistemskim djelovanjem. Priroda 2018, 564, 439–443. [CrossRef] [PubMed]
17. Chin, EN; Yu, C.; Vartabedijan, VF; Jia, Y.; Kumar, M.; Gamo, AM; Vernier, W.; Ali, SH; Kissai, M.; Lazar, DC; et al. Antitumorsko djelovanje sistemskog nenukleotidnog cGAMP mimetika koji aktivira STING. Znanost 2020, 369, 993–999.
18. Pan, BS; Perera, SA; Piesvaux, JA; Presland, JP; Schroeder, GK; Cumming, JN; Trotter, BW; Altman, MD; Buevich, AV; Gotovina, B.; et al. Oralno dostupan nenukleotidni STING agonist s antitumorskim djelovanjem. Znanost 2020, 369, eaba6098. [CrossRef] [PubMed]
19. Sali, TM; Pryke, KM; Jinu, A.; Andrija, L.; Iris, A.; Rebecca, B.; Staverosky, JA; Smith, JL; Ahmed, AS; Lisi, AJPP Karakterizacija novog ljudskog specifičnog STING agonista koji izaziva antivirusno djelovanje protiv alfavirusa u nastajanju. PloS Pathog. 2015, 11, e1005324. [CrossRef] [PubMed]
20. Hong, Z.; Mei, J.; Li, C.; Bai, G.; Maimaiti, M.; Hu, H.; Yu, W.; Sun, L.; Zhang, L.; Cheng, D.; et al. STING inhibitori ciljaju na vezni džep cikličkog dinukleotida. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 2021, 118, e2105465118. [CrossRef] [PubMed]
21. Siu, T.; Altman, MD; Baltus, GA; Childers, M.; Ellis, JM; Gunaydin, H.; Hatch, H.; Ho, T.; Jewell, J.; Lacey, BM; et al. Otkriće novog cGAMP kompetitivnog liganda neaktivnog oblika STING-a. ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 92–97. [CrossRef] [PubMed]
22. Haag, SM; Gulen, MF; Reymond, L.; Gibelin, A.; Abrami, L.; Decout, A.; Heymann, M.; van der Goot, FG; Turcatti, G.; Behrendt, R.; et al. Ciljanje na STING s kovalentnim inhibitorima malih molekula. Priroda 2018, 559, 269–273. [CrossRef]
23. Hou, S.; Lan, X.-J.; Li, W.; Yan, X.-L.; Chang, J.-J.; Yang, X.-H.; Sun, W.; Xiao, J.-H.; Li, S. Dizajn, sinteza i biološka procjena analoga akridona kao novih agonista STING receptora. Bioorg. Chem. 2020, 95, 103556. [CrossRef] [PubMed]
24. Ouyang, S.; Pjesma, X.; Wang, Y.; Ru, H.; Shaw, N.; Jiang, Y.; Niu, F.; Zhu, Y.; Qiu, W.; Parvatiyar, K.; et al. Strukturna analiza STING adapterskog proteina otkriva hidrofobno dimerno sučelje i način cikličkog di-GMP vezanja. Imunitet 2012, 36, 1073–1086. [CrossRef] [PubMed]
25. Shu, C.; Yi, G.; Watts, T.; Kao, CC; Li, P. Struktura STING-a vezanog za ciklički di-GMP otkriva mehanizam prepoznavanja cikličkih dinukleotida od strane imunološkog sustava. Nat. Struktura Mol. Biol. 2012, 19, 722–724. [CrossRef]
26. Huang, Y.-H.; Liu, X.-Y.; Du, X.-X.; Jiang, Z.-F.; Su, X.-D. Strukturna osnova za otkrivanje i vezanje cikličkog di-GMP pomoću STING-a. Nat. Struktura Mol. Biol. 2012, 19, 728–730. [CrossRef]
27. Shih, AY; Damm-Ganamet, KL; Mirzadegan, T. Dinamičke strukturne razlike između ljudskog i mišjeg STING-a dovode do različite osjetljivosti na DMXAA. Biophys. J. 2018, 114, 32–39. [CrossRef]
28. Gao, P.; Ascano, M.; Zillinger, T.; Wang, W.; Dai, P.; Serganov, AA; Gaffney, BL; Šuman, S.; Jones, RA; Deng, L.; et al. Analiza strukture i funkcije aktivacije STING-a pomoću c[G(20,50 )pA(30,50 )p] i ciljanja pomoću antivirusnog DMXAA. Cell 2013, 154, 748–762. [CrossRef] [PubMed]
29. Zhang, C.; Shang, G.; Gui, X.; Zhang, X.; Bai, X.; Chen, ZJN Strukturna osnova STING vezanja i fosforilacije pomoću TBK1. Priroda 2019, 567, 394–398. [CrossRef]
31. Vavˇrina, Z.; Gutten, O.; Smola, M.; Zavˇrel, M.; Aliakbar Tehrani, Z.; Charvát, V.; Kožíšek, M.; Boura, E.; Birkuš, G.; Rulíšek, L. Interakcije proteina i liganda na STING veznom mjestu ispitanom racionalno dizajniranim jednotočkastim mutacijama: Eksperiment i teorija. Biokemija 2021, 60, 607–620. [CrossRef] [PubMed]
31. Che, X.; Du, X.-X.; Cai, X.; Zhang, J.; Xie, WJ; Dugi, ZR; Ye, Z.-Y.; Zhang, H.; Yang, L.; Su, X.-D.; et al. Pojedinačne mutacije preoblikuju strukturnu korelacijsku mrežu DMXAA-ljudskog STING kompleksa. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 2073–2082. [CrossRef] [PubMed]
32. Diner, EJ; Burdette, DL; Wilson, SC; Monroe, KM; Kellenberger, CA; Hyodo, M.; Hayakawa, Y.; Hammond, MC; Vance, RE. Urođeni imunološki DNA senzor cGAS proizvodi nekanonski ciklički dinukleotid koji aktivira ljudski STING. Cell Rep. 2013, 3, 1355–1361. [CrossRef] [PubMed]
33. Gao, P.; Zillinger, T.; Wang, W.; Ascano, M.; Dai, P.; Hartmann, G.; Tuschl, T.; Deng, L.; Barchet, W.; Patel, DJ Binding-Pocket i Lid-Region Supstitucije čine ljudski STING osjetljivim na lijek specifičan za vrstu DMXAA. Cell Rep. 2014, 8, 1668–1676. [CrossRef] [PubMed]
34. Hwang, J.; Kang, T.; Lee, J.; Choi, B.-S.; Han, S. Dizajn, sinteza i biološka procjena C7-funkcionaliziranih DMXAA derivata kao potencijalnih ljudski-STING agonista. Org. Biomol. Chem. 2019, 17, 1869–1874. [CrossRef] [PubMed]
