CRISPRi-posredovana podesiva kontrola razine ekspresije gena s projektiranom RNA s jednim vodičem u Escherichia Coli

SAŽETAK

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-savijanje). Ove sgRNA također su omogućile modularnu regulaciju s različitim ciljnim sekvencama DNA. Primijenili smo ovaj sustav za redistribuciju metaboličkog toka za proizvodnju derivata violaceina u predvidljivom omjeru i optimizirali proizvodnju likopena. Ovaj bi sustav pomogao ubrzati procese optimizacije toka u metaboličkom inženjerstvu i sintetičkoj biologiji.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

UVOD

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-povezan (Cas) sustav tipa II je RNA-vođen sustav cijepanja DNA koji se sastoji od CRISPR RNA (crRNA), trans-aktivirajuće CRISPR RNA (tracrRNA) i Cas9 proteina (1 ,2). Cas9 iz Streptococcus pyogenes naširoko se koristi u genomskom inženjerstvu zbog svojih dobro opisanih svojstava (3,4). Kompleks proteina spCas9, tracrRNA i crRNA veže se i cijepa ciljni DNA protospacer komplementaran razmakničkoj sekvenci od 20 nukleotida (nt) crRNA u prisutnosti 5'-NGG-3' protospacer susjednog motiva (PAM ) niz (5,6). Kako bi se pojednostavio sustav, može se koristiti himerna jednostruka vodička RNA (sgRNA) gdje su crRNA i tracrRNA spojene umjetnim povezivačem zvanim tetraloop (5). Omogućuje zamjenu dvije odvojene RNA s jednom molekulom RNA, čineći sustav lakšim za upravljanje. Jedan od sustava temeljenih na CRISPR-u, CRISPR interferencija (CRISPRi), koristi katalitički neaktivan Cas9 (dCas9) zamjenom određenih aminokiselina iz svake domene endonukleaze (7). Ova modifikacija čini kompleks ribonukleoproteina (RNP) koji može usmjeravati i vezati se na ciljnu DNA i interferira s RNA polimerazom (RNAP) kako bi inhibirao inicijaciju ili elongaciju transkripcije (7). Za razliku od nokauta sustavom CRISPR/Cas9, CRISPR omogućuje reverzibilno obaranje gena ekspresijom dCas9 ili sgRNA pod inducibilnim promotorom, što omogućuje veću fleksibilnost u regulaciji gena (7). Sustav CRISPRi učinkovito je utišao ciljne gene stotinama puta (7,8). Ciljano specifična genska represija omogućuje fenotipizaciju visoke propusnosti pomoću skupa sgRNA u genomu (9) ili preusmjerava tok ugljika u modificiranim bakterijama prema ciljnoj kemikaliji (10-12). Osim toga, multipleksni CRISPRi je demonstriran u različitim domaćinima korištenjem različitih metoda za stabilnu ekspresiju višestrukih sgRNA, uključujući duge nizove crRNA, integraciju prekidača na prstima i neponovljive ekstraduge nizove sgRNA (13-16). Ove tehnike inhibicije višestrukih gena istodobno su korištene za obavljanje složenijih zadataka, kao što je smanjenje toksičnih intermedijera ili blokiranje konkurentskih putova u bakterijskoj fermentaciji (13,16-19). Međutim, potpuna represija nije uvijek poželjna za metabolički inženjering. Razine ekspresije gena treba precizno kontrolirati kako bi se postigla optimalna aktivnost enzima između putova rasta i proizvodnje, uravnotežujući koncentracije unutarstaničnih prekursora i izbjegavajući nakupljanje toksičnih intermedijera (20-22). Razvijene su različite tehnike za inženjering učinkovitosti represije CRISPRi. Manipulirano je nekoliko čimbenika, poput količine sgRNA i dCas9 proteina ili izbora sgRNA. Kontrola ekspresije dCas9 ili ekspresije dCas9 i sgRNA pomoću inducibilnog promotora regulirala je ekspresiju ciljnog gena više od 30-puta odnosno 300-puta (23,24). Međutim, primijećeno je da moduliranje koncentracije dCas9 može dovesti do nedosljedne učinkovitosti potiskivanja na različitim protorazmaknicama (23). Ograničen broj dostupnih inducibilnih promotora također čini izazove dizajna unatoč mnogim naporima (25). Druga strategija je umetanje ligand-specifičnog RNA aptamera u sgRNA, gdje mala srodna molekula može izložiti razmaknicu, čime se omogućuje kontrola CRISPRi-ja ovisna o dozi (26). SgRNA specifična za ligand je korisna ako je dostupan odgovarajući par liganda i aptamera. Udaljenost od mjesta početka transkripcije i orijentacija vezanja dCas9 također utječu na učinkovitost CRISPRi (7). Podešavanje udaljenosti između mjesta vezivanja sgRNA i mjesta početka transkripcije može optimizirati put u metaboličkom inženjerstvu (17,27,28). Učinkovitost hibridizacije između sekvenci razmaknice i protospojnice također mijenja učinkovitost vezanja RNP kompleksa (29-31). Stoga su uvedene neusklađenosti dizajnirane izvan regije sjemena kako bi se promijenila slobodna energija kako bi se diverzificirala učinkovitost CRISPRi (31,32). Međutim, dizajniranje sgRNA potrebno je za svaku novu ciljnu sekvencu, a postizanje značajne razlike u slobodnoj energiji samo kroz neusklađenost može biti izazovno. Štoviše, postoji mogućnost povećanog neciljanog vezanja (33). Ipak, još uvijek je ograničeno na precizno potiskivanje ekspresije više gena na modularan način bez obzira na ciljnu sekvencu. U ovoj studiji razvili smo podesivi CRISPRi sustav koji regulira ekspresiju gena s visokom preciznošću i predvidljivošću. Iterativnim fluorescentnim razvrstavanjem stanica sgRNA biblioteke koja cilja tetraloop i njegovu bočnu regiju, postigli smo učinkovitost potiskivanja transkripcije do 45-puta čak i kada se ciljna DNK promijeni. Ovaj sustav omogućuje predvidljivu preraspodjelu metaboličkog toka bez manipuliranja genomom domaćina ili sintetskim putovima, pružajući obećavajući alat za optimizaciju metaboličkih putova.

MATERIJALI I METODE

Bakterijski sojevi, plazmidi i reagensi

Sojevi i plazmidi bakterije Escherichia coli korišteni u ovoj studiji navedeni su u Dodatnoj tablici S1. Primeri korišteni u ovoj studiji navedeni su u Dodatnoj tablici S2. Postupci kloniranja opisani su u dopunskim metodama. Ciljni geni i njihove ciljne DNK sekvence za CRISPR sustav prikazani su u Dodatnoj tablici S3. Mach1-T1R korišten je za opće kloniranje. Knjižnica je konstruirana korištenjem NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB). Rutinske kulture za konstruiranje plazmida i sojeva izvedene su na 37°C u Luria-Bertani (LB) bujonu ili na ploči LB agara koja sadrži odgovarajuće antibiotike (34 g/ml kloramfenikola, 50 g/ml spektinomicina). PCR je proveden pomoću Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Plazmidi i PCR proizvodi pročišćeni su korištenjem GeneAll® Exprep™ Plasmid SV kompleta i Gel SV kompleta (GeneAll Biotechnology). Učinkovitost potiskivanja sgRNA mutanata Medij kulture preko noći je osvježen na OD600 od 0.05 i inkubiran dok nije dosegao vrijednost između 0,6 i 0,8. Medij kulture je zatim razrijeđen do OD600 od 0,05 s 20 ng/ml aTc i inkubiran 4 sata. Fluorescencija jedne kolonije izmjerena je na 575 nm/616 nm upotrebom Hidex Sense čitača mikropločica (Hidex), a vrijednost OD600 određena je upotrebom spektrofotometra Jenway 7300 (Jenway). Relativna fluorescencija izračunata je kao jedinice fluorescencije po vrijednosti OD600, s vrijednošću za PC postavljenom na 100%.

Učinci Cistanche tubulosa-liječe zatvor

skrining knjižnice sgRNA

Korištena je ista kulturalna metoda kao ona gore opisana. Medij kulture razrijeđen je do [stanica]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

ekstrakcija RNA

Ukupna RNA ekstrahirana je korištenjem RNeasy Mini Kit (Qiagen) samo kada je miRNeasy Mini Kit (Qiagen) za kvantifikaciju sgRNA, nakon tretmana s RNAprotect Bacteria Reagensom (Qiagen) i skladištenja na –80◦C. Digestija DNA na stupcu korištenjem DNaze bez RNaze (Qiagen) provedena je tijekom procesa ekstrakcije. Kontaminacija DNA potvrđena je PCR-om bez obrnute transkripcije. Koncentracija i čistoća svakog uzorka određene su pomoću NanoDrop One (Thermo Scientific), a kvaliteta je procijenjena pomoću DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) na LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer).

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

RT-qPCR analiza

Primeri za RT-qPCR dobiveni su iz laboratorijskih zaliha ili dizajnirani pomoću alata Primer3Plus (34) i navedeni u Dodatnoj tablici S4. Gen CysG korišten je kao referentni gen (35) za sve pokuse RT-qPCR. Standardna krivulja generirana je 10-razrjeđivanjem predloška s 107 kopija/l na 10−1 kopija/l. Granica kvantifikacije određena je uklapanjem broja kopija i pozitivne stope pojačanja na sigmoidnu funkciju i izračunavanjem vrijednosti broja pozitivnih kopija od 95%. Linearni dinamički raspon definiran je kao najniži broj kopija pri kojem je unazad izračunata Cq varijacija manja od 35%. Provjerene su vrijednosti Cq iznad 30 ili one koje nisu pojačane u kontroli bez uzorka. Podaci standardne krivulje dostupni su u Dodatnoj tablici S5 i Dodatnoj slici S1. Ukupno 2,5 ng ukupne RNA upotrijebljeno je u 10 l RT-qPCR reakcije s Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB). RT-PCR je izveden u triplikatu na StepOnePlus™ RealTime PCR sustavu (Applied Biosystems) sa sljedećim koracima: (i) reverzna transkripcija na 55°C tijekom 10 minuta, nakon čega slijedi denaturacija na 95°C tijekom 1 minute; (ii) 40 toplinskih ciklusa na 95 ◦ C tijekom 10 s i 60 ◦ C tijekom 1 minute; (iii) analiza krivulje taljenja na 95 °C tijekom 15 s i 60 °C tijekom 1 minute, nakon čega slijedi povećanje od 60 °C do 95 °C brzinom od 0,3 °C/min. Relativna kvantifikacija RNA određena je primjenom delta-deltaCt metode (36) i analizirana softverom StepOnePlus™ (Applied Biosystems).

RNA-sekvenciranje (RNA-seq) i analiza podataka

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 na temelju FPKM (fragmenata po kilobazi transkripata po milijunu mapiranih čitanja). Diferencijalno eksprimirani geni dobiveni su od praga od 1,5 (na temelju log2-) i 0,01 (q-vrijednost).

Proizvodnja i uzorkovanje proviolaceina i prodeoksiviolaceina

Za proizvodnju violaceina i prodeoksiviolaceina korišten je sljedeći sastav medija: 10.7 g/l K2HPO4, 5.2 g/l KH2PO4, 1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}}.2 g/l ekstrakta kvasca i 1{{20}} g/l glukoze. Medij kulture preko noći je osvježen do OD600 od 0.1 i uzgajan dok OD600 nije dosegao između 0,6 i 0,8. Medij kulture je zatim razrijeđen do OD600 od 0,1 i dopunjen s 500 ng/ml aTc, 0,05 mM IPTG i 0,1 g/l L-triptofana do konačnog volumena od 5 ml. Uzorkovano je 300 l medija kulture i centrifugirano na 14 000 okretaja u minuti tijekom 5 minuta kako bi se dobio stanični talog za HPLC analizu, a 300 l medija kulture uzorkovano je za ekstrakciju RNA.

HPLC analiza

Za analizu biosintetskog puta violaceina, stanični talog resuspendiran je u {{0}}volume metanola, sonikiran 5 minuta, centrifugiran i filtriran kroz 0.22-m najlonski filter. HPLC analiza slijedila je metodu (42) s Poroshell 120 EC-C18, 4,6 × 150 mm, 4 m kolone (Agilent). Dvije mobilne faze, A s 0,1 % mravlje kiseline u DDW i B s 0,1 % mravlje kiseline u acetonitrilu, korištene su pri brzini protoka od 0,6 ml/min sa sljedećim profilom gradijenta: 95 % A tijekom 1,5 min, povećanje A od 95 % do 2% tijekom 4 minute, održavanje 2% A tijekom 2 minute, povećanje A od 2% do 95% tijekom 30 s i održavanje 95% A tijekom 10 minuta. Uzorci su detektirani korištenjem PDA detektora, a HPLC područje je određeno na 600 nm za violacein i 610 nm za prodeoksiviolacein.

Proizvodnja i uzorkovanje likopena

Za proizvodnju likopena korišten je sljedeći sastav medija: 13,56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1g NaCl, 2 ml 1 M MgSO4, 0.1 ml 1 M CaCl2 i 4 g/l glukoze (22). Korišteno je 27 g/ml kloramfenikola i 50 g/ml spektinomicina. Medij kulture preko noći je osvježen do OD600 od 0.1 do konačnog volumena od 5 ml. Kada je OD600 dosegao između 0,5 i 0,6, aTc je dodan do konačne koncentracije od 500 ng/ml, a kada je OD600 dosegao između 0,9 i 1, dodan je IPTG do konačne koncentracije od 0,02 mM. Likopen je ekstrahiran pomoću acetona, kao što je opisano u referenci (22). Koncentracija likopena je dobivena iz apsorbancije na 475 nm korištenjem Jenway 7300 spektrofotometra korištenjem standardne krivulje. Za ekstrakciju RNA uzorkovano je 300 l medija kulture.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

REZULTATI I RASPRAVA

Učinci mutacija u sgRNA na učinkovitost represije CRISPR sustava

Sustav CRISPRi može potisnuti ekspresiju gena kada se ternarni kompleks dCas9–sgRNA–DNA snažno veže zajedno. Pretpostavili smo da se učinkovitost represije CRISPRi sustava može promijeniti na određenu razinu modulacijom formiranja RNP kompleksa. Kako bismo kvantificirali učinkovitost represije CRISPR sustava, dizajnirali smo sustav izvještavanja o fluorescenciji koji se temelji na genetskom krugu gdje je dCas9 iz S. pyogenes induciran anhidrotetraciklinom (aTc), a oba reporter gena (mCherry) i varijante sgRNA su konstitutivno izražene (Slika 1A). Nakon što se aTc doda u medij, ternarni kompleks dCas9–sgRNA–DNA blokira transkripciju reporterskog gena, a razina fluorescencije obrnuto ukazuje na učinkovitost represije CRISPR sustava. SgRNA sadrži ukupno 96 nukleotida (nts). Razmaknica (prvih 20 nt-a) veže se na ciljnu sekvencu DNA, a ostalih 76 nt-a pridonosi stvaranju i stabilnosti kompleksa. Budući da nepodudarnosti u razmakničkoj regiji mogu izgubiti specifičnost i povećati učinke izvan cilja u sustavu koji se temelji na CRISPR-u (33,43), maksimalna duljina sgRNA koja se može projektirati je 76 nt. U ovom slučaju, trebala bi se dobiti veličina knjižnice od 476 (približno 1045), ali je prevelika da bi se mogla konstruirati. Stoga je potrebno suziti veličinu knjižnice određivanjem specifičnih položaja na sgRNA. Prvo smo istražili kako mutacije u sgRNA u svakoj regiji utječu na potiskivanje u CRISPR sustavu. Prethodna studija objavila je da su mutacije u petlji stabljike 1 (sg mut01 i sg mut02) dovele do značajnog smanjenja aktivnosti nukleaze Cas9, dok su mutacije u petlji stabljike 2 (sg mut03) ili petlji stabljike 3 (sg mut04) nije utjecao na njegovu aktivnost (44). Rekonstruirana sgRNA (sg mut05) koja sadrži mutacije u regiji stem-loop 1 i regijama ponavljanja, tetraloop, anti-repeat i stem-loop 2 također je smanjila aktivnost nukleaze (44). Međutim, u CRISPRi sustavu, svih pet varijanti sgRNA imalo je mali učinak na učinkovitost potiskivanja u usporedbi s divljim tipom sgRNA (sg WT), pri čemu je svaka varijanta pokazala razinu fluorescencije od 2-4% u usporedbi s pozitivnom kontrolom bez regije razmaknice ( sg PC) (Slika 1B). Ovi rezultati sugeriraju da je formiranje kompleksa dCas9–sgRNA manje osjetljivo na modifikaciju sekvence u regiji matične petlje 1 u sustavu CRISPRi, za razliku od sustava CRISPR/Cas9. Pretpostavili smo da uklanjanje regija povezanih sa stabilnošću kompleksa može biti početna točka za daljnju kontrolu ekspresije na više razina. U tu smo svrhu konstruirali skraćenu sgRNA (sg trcSL1) kojoj nedostaje poveznica, stabljika-petlja 2 i stabljika-petlja 3. Ova skraćena sgRNA ima minimalan broj komponenti i pokazalo se da značajno smanjuje aktivnost nukleaze u CRISPR/ Cas9 sustav (5,44). Kada je testiran u sustavu CRISPRi, ovaj defektni mutant pokazao je razinu fluorescencije od 8% u usporedbi s sg PC, što sugerira da se još uvijek može vezati za dCas9 i potisnuti gen od interesa na određenoj razini čak i uz smanjenu stabilnost ternarnog kompleksa (Slika 1B). Strukturna analiza kompleksa RNP sugerira da su regije linkera, stem-loop 2 i stem-loop 3 sgRNA odgovorne za stabilizaciju kompleksa kroz njihove interakcije s domenom nukleaze dCas9, što dovodi do značajnog smanjenja indel učinkovitost u sustavu CRISPR/Cas9 (44). Nasuprot tome, područje ponavljanja: anti-ponavljanje i matična petlja 1 sgRNA uglavnom su u interakciji s domenom prepoznavanja i domenom interakcije s PAM-om dCas9 i ne utječu značajno na učinkovitost indela u sustavu CRISPR/Cas9 (44). Ovaj rezultat podupire zapažanje da je sg trcSL1 pokazao značajno smanjenje aktivnosti nukleaze u CRISPR/Cas9 sustavu dok je samo malo utjecao na afinitet vezanja u CRISPRi sustavu.

Slika 1. Konstrukcija sustava i učinak mutacije sgRNA na učinkovitost represije. (A) Dva plazmidna sustava za kvantifikaciju učinkovitosti potiskivanja. Jedan plazmid s p15A porijeklom sadrži dCas9 gen pod aTc-inducibilnim promotorom i mCherry gen pod konstitutivnim promotorom. Drugi plazmid s cloDF13 podrijetlom sadrži divlji tip ili mutantnu sgRNA pod konstitutivnim promotorom. (B) Relativna fluorescencija svakog mutanta sgRNA (sg mut01 ~ sg mut05 i sg trcSL1) i sg WT u usporedbi sa sg PC. +1 do + 20 su razmaknica koja se veže na mCherry gen. sg PC: sgRNA bez razmaknice kao pozitivne kontrole, sg WT: divlji tip sgRNA. Trake pogrešaka označavaju standardnu ​​devijaciju (n=3). P-vrijednosti određene su neparnim t-testom. ns: nije značajno, **str< 0.01

Variranje učinkovitosti formiranja kompleksa za višestruku kontrolu ekspresije

Tetraloop je umjetni linker koji povezuje crRNA i tracrRNA u sustavu CRISPR-Cas9 (5). Kristalna struktura ternarnog kompleksa, sastavljenog od dCas9, crRNA i tracrRNA, pokazala je da tetraloop i njegova 5 i 3 bočna područja imaju mali kontakt s dCas9 (44). U isto vrijeme, ponavljanje:protiv ponavljanja i regije stabljike-petlje 1 kritične su za funkcionalni kompleks (44). Budući da ne stupa u izravnu interakciju s dCas9, tetrapetlja i njezina bočna područja istražena su kao potencijalna mjesta za inženjering sgRNA s dodatnim komponentama, poput ugradnje sekvenci aptamera za regrutiranje dodatnih proteina u sgRNA (45,46). Vjerojatno je da bi mutacije u ovoj regiji mogle diverzificirati afinitet vezanja između sgRNA i dCas9 bez potpunog ometanja kompleksa. Nasumična biblioteka 12- mer (4 nt tetraloop regije i 4 nt od 5 odnosno 3 bočne regije) konstruirana je korištenjem sg trcSL1 kao predloška za daljnje smanjenje učinkovitosti formiranja kompleksa između sgRNA i dCas9 (Slika 2A ). Primijenili smo strategiju sortiranja u dva koraka kako bismo dobili različite sgRNA mutante koji pokrivaju učinkovitost potiskivanja između sg WT (stanje potpunog potiskivanja) i sg PC (stanje bez potiskivanja). Podijelili smo izvornu biblioteku u manje biblioteke s različitim rasponima intenziteta fluorescencije, a zatim smo pojedinačno identificirali fluorescenciju svake varijante sgRNA iz manje biblioteke. Distribucija fluorescencije izvorne biblioteke dobivene protočnom citometrijom bila je gotovo identična distribuciji sg PC (Slika 2B). Međutim, nakon tri uzastopna koraka razvrstavanja, svaka biblioteka (visoka, srednja i niska) imala je 63%, 24%, odnosno 14% srednje razine fluorescencije u usporedbi sa sg PC-om (Slika 2B). Osamdeset i dvije kolonije izolirane su iz tih manjih biblioteka, s razinama fluorescencije u rasponu od 8% do 104% (Slika 2C). Ovi rezultati sugeriraju da mutirajući tetraloop i njegova bočna regija sgRNA mogu modulirati afinitet vezanja između dCas9 i sgRNA za različite učinkovitosti potiskivanja. Kvantitativna PCR (RT-qPCR) analiza 10 sgRNA mutanata (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10, dodatna tablica S6) s različitim fluorescentnim signalima između sg WT i sg PC među 82 sgRNA kolonije pokazala je da razine fluorescencije linearno rastu s povećanjem mCherry transkripata , što ukazuje da naš CRISPRi sustav kontrolira ekspresiju gena na transkripcijskoj razini (dodatna slika S2). Naš podesivi CRISPRi sustav koristi projektirane sgRNA koje mogu postići do 45-kontrolu potiskivanja, omogućujući fino podešavanje učinkovitosti potiskivanja bez mijenjanja količina dCas9 ili sgRNA. Značajna prednost našeg sustava je da može fino podesiti učinkovitost potiskivanja kroz specifične varijante sgRNA bez potencijala za neželjene posljedice, čak iako je potrebno dodatno kloniranje. Štoviše, krivulja rasta sugerira da naš sustav ne nameće značajan stanični teret (dodatna slika S3). Nadalje, RNA-Seq na tri varijante sg trcSL1 s različitim razinama učinkovitosti potiskivanja pokazala je da je ekspresija 51 do 83 gena promijenjena, za razliku od 262 gena promijenjena u sg WT (dodatna slika S4). Ovi rezultati sugeriraju da su varijante sg trcSL1 imale čak niže efekte izvan cilja nego konvencionalni sustav CRISPRi. Osobito je relevantan u aplikacijama metaboličkog inženjeringa, gdje optimizacija metaboličkih putova često uključuje manipulaciju više gena. Sposobnost finog podešavanja ekspresije gena bez izazivanja negativnih nuspojava može značajno ubrzati proces optimizacije i poboljšati ukupnu učinkovitost i produktivnost sustava.

Slika 2. Struktura biblioteke sgRNA i probir biblioteke. (A) sgRNA skela korištena u ovoj studiji. 12-mer koji sadrži tetraloop i njegovu bočnu sekvencu nasumično je mutiran iz sg trcSL1 da bi se dobila biblioteka sgRNA. (B) Raspodjela fluorescencije dobivena protočnom citometrijom prije (lijevo) i poslije (desno) sortiranja. Svaka distribucija sadrži 100 000 ćelija. (C) Fluorescencija pojedinačnih kolonija dobivenih iz (B). Trake pogrešaka označavaju standardnu ​​devijaciju (n=2).

Učinci količine dCas9 i sgRNA na učinkovitost represije

Budući da moduliranje količine dCas9 ili sgRNA može promijeniti učinkovitost potiskivanja CRISPRi sustava (23,24), bitno je ispitati utjecaj količine dCas9 i sgRNA na učinkovitost potiskivanja. Testirali smo performanse našeg sustava u različitim uvjetima mijenjajući količine dCas9 i sgRNA koristeći deset mutanata sgRNA (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10). Za ekspresiju dCas9 korištene su tri različite koncentracije (20, 100 i 500 ng/ml) induktora. U usporedbi s razinom dCas9 mRNA kada je korišteno 20 ng/ml induktora, ona je dodatno povećana 15-puta (100 ng/ml) i 22-puta (500 ng/ml) (dopunska slika S5A ). Postoji zabrinutost zbog prekomjerne ekspresije dCas9 jer visoka razina dCas9 može biti toksična za stanice (47,48), a ponekad i ne (49). Međutim, stopa rasta smanjena je za manje od 10% kada je korišteno do 500 ng/ml aTc, prema krivuljama rasta pri različitim koncentracijama induktora (dodatna slika S6). To sugerira da količina dCas9 nije imala toksični učinak na E. coli u testiranim uvjetima. Učinkovitost represije bila je neznatno promijenjena kada je izražena različita količina dCas9 (Slika 3A). Bilo je u skladu s prethodnom studijom da je sustav CRISPRi postigao maksimalnu učinkovitost potiskivanja na [aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

Slika 3. Karakterizacija i modularnost podesivog CRISPRi sustava. (A) Relativna fluorescencija pod različitim koncentracijama aTc (20, 100 i 500 ng/ml). (B) Relativna fluorescencija pod različitim promotorima (J23100 i UPJ23119). (C) Relativna fluorescencija ispod različitih protospacera. X-os označava relativnu fluorescenciju mCherry, a y-os označava relativnu fluorescenciju lacI33-mCherry (crveno) i araC33-mCherry (plavo). 33 bp dodatnih sekvenci iz lacI i araC dodano je na 5-kraj mCherry (56). (D) Slobodna energija 12-mera i relativna fluorescencija. Isprekidane linije označavaju interval predviđanja od 95%, a pune linije označavaju regresijsku liniju. dG vrijednost sg trcSL1c2 nije se mogla dobiti pomoću mFolda i stoga je isključena iz analize. (A–D) Sve trake pogrešaka označavaju standardnu ​​devijaciju (n=3).

Modularnost podesivog CRISPRi sustava

Naš pristup koji koristi specifične varijante sgRNA za održavanje određene razine ekspresije za ciljnu DNK ima potencijal da se koristi kao modularni sustav. Kako bismo pokazali izvedivost podesivog CRISPRi sustava za ciljanje različitih protospacera, konstruirali smo dva fuzijska gena (lacI{{0}}mCherry i araC33-mCherry) dodavanjem 33 bps sekvenci iz lacI i araC do 5 -kraja mTrešnje (56). Genom E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) sadrži dvije kopije sekvence protospacera za lacI33- mCherry i jednu kopiju za araC33-mCherry. Međutim, te kromosomske sekvence nemaju PAM sekvence i stoga ne mogu biti ciljane dCas9-sgRNA kompleksom (43). Kada su siRNA dizajnirane da ciljaju svaki protospacer, učinkovitost potiskivanja dosljedno je održavana za sve protospacere iz lacI33, araC33 i mCherry (Slika 3C). Ovi nalazi sugeriraju da naš podesivi CRISPRi sustav može učinkovito regulirati ekspresiju gena na određenoj razini bez obzira na sekvencu protospacera. Jedno potencijalno objašnjenje za promatrani odnos između formiranja RNP kompleksa i učinkovitosti potiskivanja je promjena u slobodnoj energiji kada se kompleks formira. Umjetni tetraloop poveznik i njegova bočna regija sadrže dva para A: U i G: C Watson-Crick baza i A: G ne-Watson-Crickov par baza (44). Kako je vezanje crRNA i tracrRNA ključno za formiranje kompleksa, mutacije usmjerene na tetraloop utjecat će na afinitet vezanja između dCas9 i sgRNA. Taj se afinitet može izračunati iz razlike slobodne energije između vezanog i nevezanog stanja. Međutim, izračunavanje slobodne energije ograničenih stanja je izazovno (57). Pretpostavili smo da se ukupna struktura i stabilnost ograničenog stanja ne mijenjaju budući da sgRNA sortirane iz biblioteke nisu u potpunosti poremetile njegovu funkciju. Štoviše, tetrapetlja i njezino bočno područje imaju mali kontakt s dCas9 (44). Stoga bi na afinitet vezanja između dCas9 i sgRNA uglavnom utjecala stabilnost sekundarne strukture tetrapetlje i njezine bočne sekvence. Na temelju ove ideje izračunali smo slobodnu energiju tetrapetlje i njezinih bočnih nizova pomoću kalupa (58). Razlika u slobodnoj energiji savijanja uslijed mutacija definirana je kao razlika između slobodne energije mutiranog i divljeg tipa sekvenci. Može se izravno izračunati iz slobodne energije savijanja mutanata budući da je energija savijanja divljeg tipa sekvence konstantna na –4,3 kcal/mol. Kako se slobodna energija savijanja povećavala, fluorescentni signal se povećavao (Slika 3D). Učinkovitost potiskivanja bila je najveća kada je energija savijanja regije koja sadrži tetraloop bila blizu ili ispod 0 kcal/mol i linearno se smanjivala kako je energija savijanja prelazila 0 kcal/mol. Ovo opažanje sugerira da je učinkovitost formiranja kompleksa između dCas9 i sgRNA određena sekundarnom strukturom tetraloop regije, što pomaže objasniti modularnost našeg sustava. Učinkovitost potiskivanja dodatnih 85 sgRNA s različitim sekvencama 12-mer iz biblioteke izmjerena je kako bi se dodatno potvrdio ovaj odnos. Također je pokazao korelaciju uočenu iz sg trcSL1 varijanti (Slika 3D i Dodatna tablica S7), sugerirajući da tetraloop poveznica igra ključnu ulogu u formiranju RNP kompleksa i da mutacije u ovoj regiji mogu utjecati na učinkovitost CRISPR sustava. Osim toga, ovaj odnos pokazuje mogućnost računalnog dizajna varijanti sgRNA sa željenom učinkovitošću potiskivanja.

Primjena podesivog CRISPRi sustava za redistribuciju fluksa u biosintetskom putu violaceina u E. coli

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-put) u usporedbi s drugim genima kada se izračuna iz standardnih krivulja. Nasuprot tome, ekspresija drugih nereguliranih enzima u violaceinskom putu (vioA, vioB i vioE) ostala je nepromijenjena. Ovi rezultati sugeriraju da naš sustav može specifično ciljati i modulirati ekspresiju pojedinačnih gena bez utjecaja na druge gene u putu. Izravna kvantifikacija PV i PDV nije bila moguća zbog nedostatka komercijalno dostupnih standarda za HPLC analizu. Stoga smo izmjerili titre u proizvoljnim jedinicama pomoću HPLC površine vrha. Titar proizvoda dosegao je maksimum 8 sati nakon indukcije, a zatim se postupno smanjivao (dopunska slika S8), vjerojatno zbog pretvorbe proizvoda u druge nusprodukte, kao što su kromoviridani, nepoznatim mehanizmom (42,64). Uočeni manji pikovi na HPLC spektru ukazuju na prisutnost dodatnih manjih nusproizvoda. Prethodna istraživanja su pokazala da se logaritam titra svakog proizvoda u proizvoljnim jedinicama može predvidjeti linearnim kombinacijama snage promotora svakog gena uključenog u biosintetski put violaceina (42). Ovaj logaritamski linearni regresijski model također je bio valjan u našem sustavu, a povećani vioD transkripti povezani su s povećanom produkcijom PV (Slika 4B). Poznato je da je inženjering promotora ili 5 -UTR svakog gena uključenog u biosintetski put violaceina omogućio redistribuciju toka i optimizaciju puta (65,66). Naš bi sustav mogao funkcionirati kao alternativna metoda koja ilustrira kontrolu transkripcije bez manipuliranja promotorima uključenim u put pomoću sintetičkih sgRNA, koji su kratki i mogu se sastaviti metodama u jednom koraku. Probir kroz podesivi CRISPRi sustav omogućuje preusmjeravanje puta s predvidljivim protokom prije izravne manipulacije sojevima domaćina ili genskim kasetama, potencijalno ubrzavajući proces.

Primjena podesivog CRISPRi sustava za uravnoteženje protoka ugljika u E. coli koja proizvodi likopen

Učinkovita proizvodnja vrijednih spojeva u metaboličkom inženjerstvu zahtijeva uravnoteženje toka ugljika. Put metileritritol 4-fosfata (MEP) je metabolički put koji koristi jednostavne prekursore kao što su piruvat i gliceraldehid 3-fosfat (GAP) za proizvodnju izoprenoidnih građevnih blokova, dimetilalil pirofosfata i izopentenil pirofosfata (67,68) . Ove molekule sintetiziraju geranil pirofosfat, koji se pretvara u farnezil pirofosfat (FPP) (67,68). Likopen, visoko cijenjeni karotenoid sa snažnim antioksidativnim svojstvima i raznolikom primjenom u raznim industrijama (69), sintetizira se iz FPP nizom enzimskih reakcija iz crtE, crtB i crtI (Slika 4C) (22,70). Prekursor GAP-a neophodan je ne samo za put MEP-a već i za put glikolize (22). Pokazalo se da smanjena ekspresija gena gapA, koji kodira gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH) u putu glikolize, povećava proizvodnju likopena povećanjem skupa GAP (22). Stoga smo ciljali gapA s pet varijanti, uključujući tri varijante sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 i sg trcSL1c6) koje su pokazale različitu učinkovitost potiskivanja, sg PC i sg WT. Međutim, gapA je bitan gen koji se ne može potpuno uništiti (71,72). Pokušaji suzbijanja gapA s konvencionalnim CRISPRi korištenjem sg WT bili su neuspješni čak i uz nisku propusnost dcas9 ispod tet promotora (73). S druge strane, višestruka represija ekspresije gena gapA korištenjem podesivog CRISPRi sustava postignuta je bez defekta u rastu i rezultirala je 2.7-strukim povećanjem proizvodnje likopena sa sg trcSL1c6 u usporedbi sa sojem koji u potpunosti eksprimira gen gapA nakon 15 sati uzgoja (Slika 4D i Dodatna slika S9). Zabilježeno je da samo 10% prirodne ekspresije gena gapA dovodi do povećanog skupa GAP-a bez značajne promjene u nizvodnim metabolitima u putu glikolize, kao što su 2-fosfoglicerat i 3-fosfoglicerat ( 22). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da podesivi CRISPRi može precizno potisnuti ekspresiju gena na više razina bez inženjeringa kromosoma.

Slika 4. Primjena podesivog CRISPRi sustava za biosintetski put violaceina. (A) Biosintetski put violaceina i konstrukcija plazmida. Pet gena (vioA, vioB, vioC, vioD i vioE) odgovornih za proizvodnju violaceina klonirano je u plazmid s ekspresijom dCas9-. Proizvode se četiri glavna proizvoda (violacein, proviolacein, deoksiviolacein i prodeoksiviolacein). sg WT za vioC i pet varijanti sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 i sg trcSL1c9) za vioD, koje pokazuju različite učinkovitosti represije, klonirane su u drugi plazmid. Trp: L-triptofan, V: violacein, PV: proviolacein, PDV: prodeoksiviolacein, DV: deoksiviolacein, PDVA: protodeoksiviolaceinska kiselina, PVA: protoviolaceinska kiselina. (B) Odnos između vioD transkripata, mCherry fluorescencije i titra PDV-a i PV-a. X-os označava relativnu vioD RNA dobivenu RT-qPCR-om, y-os lijevo označava relativnu mCherry fluorescenciju sa slike 3, a y-os desno označava omjer HPLC površine. Uzorci s najvišom vrijednošću vioD RNA postavljeni su na 100% za normalizaciju. (C) Biosintetski put likopena i konstrukcija plazmida. Tri gena (crtE, crtB, crtI) odgovorna za proizvodnju likopena klonirana su u plazmid s ekspresijom dCas9-. gapA je ciljano sa sg trcSL1 varijantama (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) i sg PC je kloniran u drugi plazmid. Glc: glukoza, GAP: gliceraldehid 3-fosfat, 1,3-BPG: 1,3-bisfosfoglicerat, DMAPP: dimetilalil pirofosfat, IPP: izopentenil pirofosfat, FPP: farnezil pirofosfat. (D) Odnos između transkripata gapA, fluorescencije mCherry i proizvodnje likopena. X-os označava relativnu prazninu RNK dobivenu iz RT-qPCR, y-os lijevo označava relativnu mCherry fluorescenciju sa slike 3, a y-os desno označava titar likopena. (B, D) Sve trake pogrešaka označavaju standardnu ​​devijaciju (n=3).

ZAKLJUČAK

Dizajnirali smo podesivi CRISPRi sustav koji može precizno kontrolirati ekspresiju gena na željenoj razini. Mutacijom tetrapetlje i njezine bočne regije, sintetske sgRNA koje ciljaju različite sekvence protospacera mogle bi regulirati gen na određenoj razini. Uspješno smo primijenili ovaj sustav za preusmjeravanje metaboličkog tijeka od interesa u biosintetskom putu violaceina za proizvodnju derivata indola u predvidljivom omjeru. Osim toga, pokazali smo da je upotreba podesivog CRISPRi dovela do 27-strukog povećanja proizvodnje likopena, naglašavajući svestranost našeg sustava za poboljšanje proizvodnje drugih vrijednih spojeva. Ovaj bi sustav ubrzao procese optimizacije toka prije trajne manipulacije genetskim informacijama domaćina, kao što je zamjena promotora ili 5-UTR sekvenci.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

REFERENCE

1. Sapranauskas,R., Gasiunas,G., Fremaux,C., Barrangou,R., Horvath,P. i Siksnys, V. (2011) Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas sustav osigurava imunitet kod Escherichie coli. Nucleic Acids Res., 39, 9275–9282.

2. Gasiunas,G., Barrangou,R., Horvath,P. i Siksnys, V. (2012) Cas9-crRNA ribonukleoproteinski kompleks posreduje u specifičnom cijepanju DNA za adaptivnu imunost kod bakterija. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD, 109, E2579–E2586.

3. Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, PD, Wu, X., Jiang, W., Marraffini, LA i dr. . (2013) Multiplex genome inženjering korištenjem CRISPR/Cas sustava. Znanost, 339, 819–823.

4. Ran, FA, Hsu, PD, Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA i Zhang, F. (2013) Genomski inženjering pomoću sustava CRISPR-Cas9. Nat. Protoc., 8, 2281–2308.

5. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, JA i Charpentier, E. (2012) Programabilna dual-RNA-vođena DNA endonukleaza u adaptivnom bakterijskom imunitetu. Znanost, 337, 816–821.

6. Anders,C., Niewoehner,O., Duerst,A. i Jinek, M. (2014.) Strukturna osnova prepoznavanja ciljane DNA ovisne o PAM-u pomoću endonukleaze Cas9. Priroda, 513, 569–573.

7. Qi, LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna, JA, Weissman, JS, Arkin, AP i Lim, WA (2013.) Promjena namjene CRISPR-a kao RNA-vođene platforme za kontrolu ekspresije gena specifičnu za sekvencu. Ćelija, 152, 1173–1183.

8. Larson, MH, Gilbert, LA, Wang, X., Lim, WA, Weissman, JS i Qi, LS (2013) CRISPR interferencija (CRISPRi) za kontrolu ekspresije gena specifičnu za sekvencu. Nat. Protoc., 8, 2180–2196.

9. McGlincy, NJ, Meacham, ZA, Reynaud, KK, Muller, R., Baum, R. i Ingolia, NT (2021.) Biblioteka vodiča za interferenciju CRISPR na razini genoma omogućuje sveobuhvatno fenotipsko profiliranje kvasca. BMC Genomics, 22, 205.

10. Yoon, J. i Woo, HM (2018.) CRISPR interferencijom posredovan metabolički inženjering Corynebacterium glutamicum za proizvodnju homo-butirata. biotehnologija. Bioeng., 115, 2067–2074.

11. Cleto, S., Jensen, JV, Wendisch, VF i Lu, TK (2016.) Metabolički inženjering Corynebacterium glutamicum s CRISPR interferencijom (CRISPRi). ACS sint. Biol., 5, 375–385.

12. Zhang,GQ, Ren,XN, Liang,XH, Wang,YQ, Feng,DX, Zhang,YJ, Xian,M. i Zou, HB (2021.) Poboljšanje mikrobne proizvodnje aminokiselina: od konvencionalnih pristupa do nedavnih trendova. biotehnologija. Bioproc. E, 26, 708–727.

13. Kim, SK, Seong, W., Han, GH, Lee, DH i Lee, SG (2017) CRISPR interferencijom vođena multipleksna represija endogenih kompeticijskih gena puta za preusmjeravanje metaboličkog toka u Escherichia coli. Microb. Cell Fact., 16, 188.

14. Ellis, NA, Kim, B., Tung, J. i Machner, MP (2021.) Multiplex CRISPR alat za interferenciju za ispitivanje gena virulencije u Legionella pneumophila. Komun. Biol., 4, 157.

15. Siu, KH i Chen, W. (2019.) Riboregulirana gRNA za programiranje funkcije CRISPR-Cas9. Nat. Chem. Biol., 15, 217–220.

16. Reis,AC, Halper,SM, Vezeau,GE, Cetnar,DP, Hossain,A., Clauer,PR i Salis,HM (2019) Simultana represija višestrukih bakterijskih gena korištenjem neponovljivih ekstra-dugih sgRNA nizova. Nat. Biotechnol., 37, 1294–1301.

17. Tian, ​​T., Kang, JW, Kang, A. i Lee, TS (2019.) Preusmjeravanje metaboličkog toka putem kombinatorne multiplex CRISPRi-posredovane represije za proizvodnju izopentenola u Escherichia coli. ACS sint. Biol., 8, 391–402.

18. Gauttam, R., Seibold, GM, Mueller, P., Weil, T., Weiss, T., Handrick, R. i Eikmanns, BJ (2019.) Jednostavan dvostruki inducibilni interferencijski sustav CRISPR za ciljanje više gena u Corynebacterium glutamicum. Plazmid, 103, 25–35.

19. Yao,L., Čengić,I., Anfelt,J. i Hudson, EP (2016.) Višestruka represija gena u cijanobakterijama pomoću CRISPRi. Acs Synth. Biol., 5, 207–212.

20. Lim, HG, Noh, MH, Jeong, JH, Park, S. i Jung, GY (2016.) Optimalno ponovno balansiranje puta proizvodnje 3-hidroksipropionske kiseline iz glicerola u Escherichia coli. ACS sint. Biol., 5, 1247–1255.

21. Yang, Y., Lin, Y., Li, L., Linhardt, RJ i Yan, Y. (2015) Regulacija metabolizma malonil-CoA putem sintetičkih antisense RNA za poboljšanu biosintezu prirodnih proizvoda. Metab. Eng., 29, 217–226.

22. Jung,J., Lim,JH, Kim,SY, Im,DK, Seok,JY, Lee,SV, Oh,MK i Jung,GY (2016.) Precizno rebalansiranje prekursora za proizvodnju izoprenoida finom kontrolom ekspresije gapA u Escherichia coli. Metab. Eng., 38, 401–408.

23. Li,XT, Jun,Y., Erickstad,MJ, Brown,SD, Parks,A., Court,DL i Jun,S. (2016) tCRISPRi: podesiva i reverzibilna kontrola ekspresije gena u jednom koraku. Sci. Rep., 6, 39076.

24. Fontana,J., Dong,C., Ham,JY, Zalatan,JG i Carothers,JM (2018) Regulirana ekspresija sgRNA usklađuje CRISPRi u E. coli. biotehnologija. J., 13, e1800069.

25. Kim,NM, Sinnott,RW i Sandoval,NR (2020.) Biosenzori temeljeni na transkripcijskim faktorima i inducibilni sustavi u nemodelnim bakterijama: trenutni napredak i budući smjerovi. Curr. Opin. Biotechnol., 64, 39–46.

26. Kundert,K., Lucas,JE, Watters,KE, Fellmann,C., Ng,AH, Heineike,BM, Fitzsimmons,CM, Oakes,BL, Qu,J., Prasad,N. et al. (2019) Kontroliranje CRISPR-Cas9 s ligand-aktiviranim i ligand-deaktiviranim sgRNA. Nat. Commun., 10, 2127.

27. Ferreira, R., Skrekas, C., Hedin, A., Sanchez, BJ, Siewers, V., Nielsen, J. i David,F. (2019) Modelom potpomognuto fino podešavanje središnjeg metabolizma ugljika u kvascu putem regulacije temeljene na dCas9-. ACS sint. Biol., 8, 2457–2463.

28. Su, T., Guo, Q., Zheng, Y., Liang, Q., Wang, Q. i Qi,Q. (2019) Fino podešavanje hemB pomoću CRISPRi za povećanje proizvodnje 5-aminolevulinske kiseline u Escherichia coli. Ispred. Microbiol., 10, 1731.

29. Zheng, T., Hou, Y., Zhang, P., Zhang, Z., Xu, Y., Zhang, L., Niu, L., Yang, Y., Liang, D., Yi, F . et al. (2017) Profiliranje specifičnosti RNK s jednim vodičem otkriva sekvencu jezgre osjetljivu na nepodudaranje. Sci. Rep., 7, 40638.

30. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. i Marraffini, LA (2013.) RNA-vođeno uređivanje bakterijskih genoma korištenjem CRISPR-Cas sustava. Nat. Biotehnologija,

31, 233–239. 31. van Gestel,J., Hawkins,JS, Todor,H. i Gross, CA (2021.) Računalni cjevovod za dizajniranje vodiča RNA za mismatch-CRISPRi. STAR Protoc, 2, 100521.

32. Hawkins, JS, Silvis, MR, Koo, BM, Peters, JM, Osadnik, H., Jost, M., Hearne, CC, Weissman, JS, Todor, H. i Gross, CA (2020.) Mismatch-CRISPRi otkriva kovarijantne odnose ekspresije i prikladnosti esencijalnih gena u Escherichia coli i Bacillus subtilis. Cell Syst., 11, 523–535.

33. Fortin, J.-P., Tan, J., Gascoigne, KE, Haverty, PM, Forrest, WF, Costa, MR i Martin, SE (2019) Višestruko ciljanje gena i tolerancija na neusklađenost mogu zbuniti analizu genoma široki združeni CRISPR ekrani. Genome Biol., 20, 21.

34. Rožen,S. i Skaletsky,H. (2000) Primer3 na WWW-u za opće korisnike i programere biologe. Metode Mol. Biol., 132, 365–386.

35. Zhou, K., Zhou, L., Lim, Q., Zou, R., Stephanopoulos, G. i Too, HP (2011.) Novi referentni geni za kvantificiranje transkripcijskih odgovora bakterije Escherichia coli na prekomjernu ekspresiju proteina pomoću kvantitativne PCR. BMC Mol. Biol., 12, 18.

36. Livak, KJ i Schmittgen, TD (2001.) Analiza podataka o relativnoj ekspresiji gena korištenjem kvantitativne PCR u stvarnom vremenu i 2(-Delta Delta C(T)) metode. Metode, 25, 402–408.

37. Andrews, S. (2010) FastQC: Alat za kontrolu kvalitete za podatke sekvence visoke propusnosti. v0.11.9 izd.

38. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. i Salzberg, SL (2009.) Ultrabrzo i memorijski učinkovito usklađivanje kratkih sekvenci DNK s ljudskim genomom. Genome Biol., 10, R25.

39. Danecek,P., Bonfield,JK, Liddle,J., Marshall,J., Ohan,V., Pollard,MO, Whitwham,A., Keane,T., McCarthy,SA, Davies,RM et al. (2021.) Dvanaest godina SAMtools i BCFtools. Gigascience, 10, giab008.

40. Trapnell,C., Williams,BA, Pertea,G., Mortazavi,A., Kwan,G., van Baren,MJ, Salzberg,SL, Wold,BJ i Pachter,L. (2010) Sastavljanje transkripta i kvantifikacija pomoću RNA-Seq otkriva neoznačene transkripte i izmjenu izoformi tijekom stanične diferencijacije. Nat. Biotechnol., 28, 511–515.

41. Trapnell,C., Hendrickson,DG, Sauvageau,M., Goff,L., Rinn,JL i Pachter,L. (2013) Diferencijalna analiza regulacije gena pri rezoluciji prijepisa s RNA-seq. Nat. Biotechnol., 31, 46–53.

42. Lee,ME, Aswani,A., Han,AS, Tomlin,CJ i Dueber,JE (2013.) Optimizacija razine ekspresije višeenzimskog puta u odsutnosti testa visoke propusnosti. Nucleic Acids Res., 41, 10668–10678.

43. Hsu, PD, Scott, DA, Weinstein, JA, Ran, FA, Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, EJ, Wu, X., Shalem, O. et al. (2013.) Specifičnost ciljanja DNA RNA-vođenih Cas9 nukleaza. Nat. Biotechnol., 31, 827–832.

44. Nishimasu, H., Ran, F., Hsu, P., Konermann, S., Shehata, S., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F. i Nureki, O. (2014.) Kristalna struktura Cas9 u kompleksu s vodičem RNA i ciljnom DNA. Cell, 156, 935–949.

45. Fu,Y., Rocha,PP, Luo,VM, Raviram,R., Deng,Y., Mazzoni,EO i Skok,JA (2016) CRISPR-dCas9 i sgRNA skele omogućuju dvobojno snimanje satelitskih sekvenci uživo i ponavljanjem obogaćeni pojedinačni lokusi. Nat. Commun., 7, 11707.

46. ​​Khosravi, S., Schindele, P., Gladilin, E., Dunemann, F., Rutten, T., Puchta, H. i Houben,A. (2020.) Primjena aptamera poboljšava prikaz uživo biljnih telomera temeljen na CRISPR-u. Ispred. Plant Sci., 11, 1254.

47. Nielsen, AA i Voigt, CA (2014.) Genetski sklopovi CRISPR/Cas s više ulaza koji povezuju regulatorne mreže domaćina. Mol. Syst. Biol., 10, 763.

48. Lee, YJ, Hoynes-O'Connor, A., Leong, MC i Moon, TS (2016.) Programabilna kontrola ekspresije bakterijskih gena s 44, 2462–2473.

49. Vigouroux, A., Oldewurtel, E., Cui, L., Bikard, D. i van Teeffelen, S. (2018.) Podešavanje sposobnosti dCas9 da blokira transkripciju omogućuje robusno, bešumno obaranje bakterijskih gena. Mol. Syst. Biol., 14, e7899.

50. Zhang, Y., Shang, X., Lai, S., Zhang, G., Liang, Y. i Wen,T. (2012.) Razvoj i primjena sustava ekspresije inducibilnog arabinozom olakšavanjem unosa induktora u Corynebacterium glutamicum. Appl. Okolina. Microbiol., 78, 5831-5838.

51. Thompson,MG, Sedaghatian,N., Barajas,JF, Wehrs,M., Bailey,CB, Kaplan,N., Hillson,NJ, Mukhopadhyay,A. i Keasling, JD (2018.) Izolacija i karakterizacija novih mutacija u podrijetlu pSC101 koje povećavaju broj kopija. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke, PM, Link, T., Gatgens, J., Sonntag, C., Otto, M., Bott, M. i Polen, T. (2020.) Podesivi plazmid ekspresije inducibilan L-arabinozom za bakteriju octene kiseline Gluconobacter oxydans. Appl. Microbiol. Biotechnol., 104, 9267–9282.

53. Nguyen, TT, Nguyen, NH, Kim, Y., Kim, JR i Park, S. (2021) In vivo karakterizacija inducibilnog promotorskog sustava 3-hidroksipropionske dehidrogenaze u Pseudomonas denitrificans. Biotechnol Bioproc E, 26, 612–620.

54. McCarty, NS, Graham, AE, Studena, L. i Ledesma-Amaro, R. (2020) Multipleksirane CRISPR tehnologije za uređivanje gena i regulaciju transkripcije. Nat. Commun., 11, 1281.

55. Yan, Q. i Fong, SS (2017.) Studija in vitro transkripcijskih učinaka vezanja i šuma korištenjem konstitutivnih promotora u kombinaciji sa sekvencama UP elemenata u Escherichia coli. J. Biol. Eng., 11, 33.

56. Seo, SW, Yang, JS, Kim, I., Yang, J., Min, BE, Kim, S. i Jung, GY (2013.) Prediktivni dizajn regije inicijacije translacije mRNA za kontrolu učinkovitosti translacije prokariota. Metab. Eng., 15, 67–74. 57. Kappel, K., Jarmoskaite, I., Vaidyanathan, PP, Greenleaf, WJ, Herschlag, D. i Das,R. (2019) Slijepi testovi predviđanja afiniteta vezanja RNA-protein. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD, 116, 8336–8341.

58. Zuker,M. (2003) Mfold web poslužitelj za presavijanje nukleinskih kiselina i predviđanje hibridizacije. Nucleic Acids Res., 31, 3406–3415.

59. Xiong, B., Zhu, Y., Tian, ​​D., Jiang, S., Fan, X., Ma, Q., Wu, H. i Xie,X. (2021) Preraspodjela toka središnjeg metabolizma ugljika za učinkovitu proizvodnju l-triptofana u Escherichia coli. biotehnologija. Bioeng., 118, 1393–1404.

60. Yao, R., Li, J., Feng, L., Zhang, X. i Hu,H. (2019) (13)C metabolički inženjering vođen analizom metaboličkog toka Escherichie coli za poboljšanu proizvodnju acetola iz glicerola. biotehnologija. Biogoriva, 12, 29.

61. Duran,N. i Menck, CF (2001.) Chromobacterium violaceum: pregled farmakoloških i industrijskih perspektiva. krit. Rev. Microbiol., 27, 201–222.

62. Balibar, CJ i Walsh, CT (2006) In vitro biosinteza violaceina iz L-triptofana pomoću enzima VioA-E iz Chromobacterium violaceum. Biokemija, 45, 15444–15457.

63. Gwon, DA, Seok, JY, Jung, GY i Lee, JW (2021) Biosenzorski potpomognuta adaptivna laboratorijska evolucija za proizvodnju violaceina. Int. J. Mol. Sci., 22, 6594.

64. Sanchez, C., Brana, AF, Mendez, C. i Salas, JA (2006.) Ponovna procjena biosintetskog puta violaceina i njegovog odnosa s biosintezom indolokarbazola. Chem. Bio. Chem., 7, 1231-1240.

65. Jones, JA, Vernacchio, VR, Lachance, DM, Lebovich, M., Fu, L., Shirke, AN, Schultz, VL, Cress, B., Linhardt, RJ i Koffas, MA (2015) ePathOptimize: a kombinatorni pristup za transkripcijsko balansiranje metaboličkih putova. Sci. Rep., 5, 11301.

66. Zhang, Y., Chen, H., Zhang, Y., Yin, H., Zhou, C. i Wang, Y. (2021.) Izravni RBS inženjering biosintetskog klastera gena za učinkovitu produktivnost violaceina u E. coli. Microb. Cell Fact., 20, 38.

67. Hunter, WN (2007) Nemevalonatni put biosinteze prekursora izoprenoida. J. Biol. Chem., 282, 21573-21577.

68. Rohmer,M. (1999) Otkriće o mevalonatu neovisnog puta za biosintezu izoprenoida u bakterijama, algama i višim biljkama. Nat. proizvod Rep., 16, 565–574.

69. Muller, L., Caris-Veyrat, C., Lowe, G. i Bohm,V. (2016.) Likopen i njegova antioksidativna uloga u prevenciji kardiovaskularnih bolesti – kritički pregled. krit. Rev. Food Sci. Nutr., 56, 1868–1879.

70. Miura, Y., Kondo, K., Saito, T., Shimada, H., Fraser, PD i Misawa, N. (1998) Proizvodnja karotenoida likopena, beta-karotena i astaksantina u prehrambenom kvascu Candida utilis. Appl. Okolina. Microbiol., 64, 1226-1229.

71. Goodall,ECA, Robinson,A., Johnston,IG, Jabbari,S., Turner,KA, Cunningham,AF, Lund,PA, Cole,JA i Henderson,IR (2018) Osnovni genom Escherichie coli K{ {2}}. Mbio, 9, e02096-17.

72. Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA, Tomita, M., Wanner, BL i Mori, H. (2006) Konstrukcija Escherichia coli K-12 in-frame mutanata s nokautom jednog gena: zbirka Keio. Mol. Syst. Biol., 2, 2006.0008.

73. Bertram,R. i Hillen, W. (2008) Primjena Tet represora u regulaciji i ekspresiji prokariotskih gena. Microb. Biotechnol., 1, 2–16.