Optimizacija i učinci ekstrakta pića Congrong–Zaoren–Wumei na poboljšanje sna kod miševa
Jan 30, 2026
2 Rezultati i analiza
2.1 Optimizacija procesa pripreme za Congrong–Zaoren–Wumei ekstrakt pića
Na slici 1, utvrđena HPLC metoda postigla je učinkovito odvajanje između kromatografskih pikova četiriju referentnih spojeva - limunske kiseline, ehinakozida, verbaskozida i spinozina - i susjednih pikova. Vremena zadržavanja bila su tR1=9.0 min, tR2=21.6 min, tR3=24.3 min, odnosno tR4=25.9 min. Linearne regresije površine vrha u odnosu na koncentraciju analita dale su linearne raspone od 12,12–2016, 0,14–110, 0,18–112,50 i 2,44–18,30 µg·mL–1, s R2 vrijednostima od 0,9998, 1, 1 i 1, što ukazuje na izvrsnu linearnost. Pod tim uvjetima, granice detekcije (LOD) za limunsku kiselinu, ehinakozid, verbaskozid i spinozin bile su 3,636, 0,045144, 0,058 i 0,7564 µg·mL–1, a granice kvantifikacije (LOQ) bile su 12,12, 0,14, 0,18 i 2,44. µg·mL–1, redom. Testovi preciznosti pokazali su RSD od 0,10%, 0,07%, 0,06% i 0,33% za četiri analita, što ukazuje na dobru preciznost instrumenta. Stabilnost tijekom 0-12 h bila je dobra, s RSD-ovima od 0,78%, 0,16%, 0,20% i 1,46%. Ispitivanja ponovljivosti dala su RSD od 0,51%, 0,42%, 0,37% i 0,38% za analite, pokazujući dobru ponovljivost. Testovi šiljatog oporavka pokazali su prosječne oporavke od 97,42%, 103,32%, 98,90% i 99,71%, s RSD-ovima od 0,70%, 0,52%, 1,05%, odnosno 0,63%. Stoga je HPLC metoda uspostavljena za istovremeno određivanje ove četiri glavne komponente točna i pouzdana, prikladna za naknadne testove optimizacije procesa.
Slika 1. HPLC kromatogrami referentnih i otopina na valnoj duljini od 210 nm (A) i 330 nm (B i C)
U metodološkoj procjeni sirovih polisaharida, LOD je bio 0,098 µg·mL–1. Vrijednosti OD slijepe probe otapala i slijepe kontrole na 485 nm nisu pokazale očite promjene, što ukazuje na dobru specifičnost. Linearna regresija OD u odnosu na koncentraciju dala je R2=0.9997, što ukazuje na izvrsnu linearnost. RSD za šest uzastopnih mjerenja bio je 0,47%, pokazujući dobru preciznost. RSD za sadržaj polisaharida unutar 12 h bio je 0,44%, što ukazuje na dobru stabilnost. RSD za šest neovisno pripremljenih uzoraka bio je 2,51%, što ukazuje na dobru ponovljivost. Stoga je metoda prikladna za kvantificiranje sirovih polisaharida tijekom optimizacije procesa.
Prednosti Cistanche Roucongrong u Ancient Book
Služba podrške Wecistanche-Za više detalja o suradnji
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
2.1.2 Rezultati ispitivanja jednog faktora
Koristeći utvrđenu HPLC metodu u kombinaciji s polisaharidnim testom i uzimajući sadržaj limunske kiseline, ehinakozida, verbaskozida, spinozina i polisaharida u ekstraktu kao indekse procjene, provedena su jednofaktorska istraživanja na temperaturi ekstrakcije, omjeru krutina i tekućina i vremenu ekstrakcije kako bi se podržao ortogonalni dizajn.
Na temperaturama ekstrakcije od 60, 80 i 100 stupnjeva, sadržaj limunske kiseline, ehinakozida, verbaskozida, spinozina i sirovih polisaharida u ekstraktima raste s temperaturom.
Pri omjerima krutina i tekućina od 1:3, 1:5, 1:7, 1:10 i 1:12 (g·mL–1), sadržaj limunske kiseline, spinozina i sirovih polisaharida porastao je s višim omjerima; ehinakozid i verbaskozid imali su vrhunac na 1:10 (g·mL–1) i smanjili se na 1:12 (g·mL–1). Međutim, ukupni sadržaj svih komponenti markera povećavao se s omjerom krutina i tekućina.
U vremenima ekstrakcije od 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 i 3,0 h sadržaji pojedinih analita variraju različito, ali ukupni sadržaj komponenti markera raste s vremenom.
Detaljni podaci navedeni su u Dodatnim materijalima. S obzirom na industrijsku praktičnost (izbjegavanje predugog izvlačenja), faktori i razine za ortogonalni dizajn postavljeni su kao u tablici 2, a ortogonalna shema prikazana je u tablici 3.
Tablica 2. Razine faktora ortogonalnog eksperimentalnog dizajna za metodu ekstrakcije pića Congrong–Zaoren–Wumei
Čimbenici:
A: Temperatura ekstrakcije (stupnjevi)
B: Omjer krutina i tekućina (g mL–1)
C: Vrijeme ekstrakcije (h)
| Razina | A: Temperatura (stupnjevi) | B: Omjer (g mL–1) | C: Vrijeme (h) |
|---|---|---|---|
| 1 | 60 | 1:7 | 1.0 |
| 2 | 80 | 1:10 | 1.5 |
| 3 | 100 | 1:12 | 2.0 |
2.1.3 Rezultati ortogonalnog dizajna
Ekstrakcija je izvršena prema ortogonalnom nizu. Sadržaj limunske kiseline, ehinakozida, verbaskozida, spinozina i sirovih polisaharida prikazan je u tablici 3. Na temelju analize raspona (R), redoslijed utjecaja faktora na ukupni sadržaj markera bio je A > B > C, tj. temperatura ekstrakcije > omjer krutina i tekućina > vrijeme ekstrakcije. Usporedba k vrijednosti predložila je optimalnu kombinaciju A3B3C3: temperatura ekstrakcije 100 stupnjeva, omjer krutina i tekućina 1:12 (g·mL–1) i vrijeme ekstrakcije 2 sata. ANOVA (Tablica 4) je pokazala da je temperatura ekstrakcije imala značajan učinak na ukupni sadržaj markera, dok učinci omjera kruto-tekuće i vremena nisu bili značajni.
Tablica 3. Ortogonalni eksperimentalni dizajn i izmjereni sadržaj komponenata pića Congrong–Zaoren–Wumei (mg g–1)
Faktori: A (temperatura), B (omjer krutina i tekućina), C (vrijeme)
| Probni br. | A | B | C | Ukupni markeri | Limunska kiselina | Spinozin | Ehinakozid | verbaskozid | Sirovi polisaharidi |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 3 | 3 | 1 | 116.71 | 75.55 | 4.08 | 1.62 | 0.48 | 34.98 |
| 2 | 1 | 2 | 3 | 70.98 | 59.01 | 2.60 | 0.80 | 0.36 | 8.22 |
| 3 | 3 | 1 | 3 | 117.86 | 73.87 | 3.53 | 1.21 | 0.45 | 38.80 |
| 4 | 1 | 3 | 2 | 72.55 | 59.73 | 2.37 | 0.94 | 0.41 | 9.99 |
| 5 | 2 | 3 | 3 | 83.64 | 63.20 | 2.15 | 1.08 | 0.44 | 16.77 |
| 6 | 2 | 1 | 2 | 117.76 | 74.09 | 2.58 | 1.37 | 0.48 | 39.24 |
| 7 | 2 | 2 | 1 | 110.74 | 70.96 | 2.36 | 1.07 | 0.43 | 35.92 |
| 8 | 2 | 1 | 1 | 69.63 | 58.37 | 1.74 | 0.54 | 0.34 | 8.65 |
| 9 | 1 | 1 | 3 | 69.66 | 58.14 | 2.48 | 0.86 | 0.36 | 7.83 |
K statistika (zbroj ukupnih vrijednosti po razini faktora)
K1: A = 71.06, B = 85.72, C = 85.49
K2: A = 74.46, B = 86.29, C = 86.65
K3: A = 117.44, B = 90.97, C = 90.83
Raspon R: A=46.38, B=5.25, C=4.19
2.1.4 Validacija i skaliranje
Validacija procesa u optimalnim uvjetima dala je srednji ukupni sadržaj komponenti markera od 119,74 mg·g–1 s RSD 0,57%, što ukazuje na stabilnost i pouzdanost. Ispitivanje povećanja skale pod istim uvjetima dalo je srednji ukupni sadržaj markera od 120,89 mg·g–1 s RSD 0,95%, što je u skladu s rezultatima prije skaliranja, dodatno potvrđujući robusnost. Uzorci iz tri povećane serije korišteni su za kasnije studije povezane sa spavanjem; njihov srednji sadržaj bio je: limunska kiselina 77,73 mg·g–1, ehinakozid 2,69 mg·g–1, verbaskozid 1,03 mg·g–1, spinozin 0,50 mg·g–1 i polisaharidi 38,93 mg·g–1.
Tablica 4. Analiza varijance iz ortogonalnih eksperimenata
| Faktor | Zbroj kvadrata | df | Srednji kvadrat | F | P |
|---|---|---|---|---|---|
| Temperatura ekstrakcije | 4010.50 | 2 | 2005.25 | 116.26 | 0.01 |
| Omjer kruto-tekuće | 49.79 | 2 | 24.90 | 1.44 | 0.41 |
| Vrijeme ekstrakcije | 47.37 | 2 | 23.68 | 1.37 | 0.42 |
Liu i sur. [16] optimizirali su vodenu ekstrakciju feniletanoidnih glikozida iz Cistanche tubulosa i identificirali 1:15 (g·mL–1), 80 stupnjeva i 2 sata kao optimalne; sadržaj feniletanoidnog glikozida smanjio se iznad 90 stupnjeva. U ovoj studiji, sadržaj ehinakozida i verbaskozida dosegao je vrhunac u omjeru 1:10 (g·mL–1) i smanjio se na 1:12 (g·mL–1), ali je porastao s temperaturama od 60, 80 i 100 stupnjeva. Ovo odstupanje može se odnositi na upotrebu Cistanche deserticola (pustinjske Cistanche) u našem piću i na učinke matrice koegzistirajućih Suanzaoren i Wumei koji bi mogli utjecati na otapanje feniletanoidnog glikozida.
Tablica 5. Učinak ekstrakta napitka Congrong–Zaoren–Wumei na izravan san kod miševa (n=12)
| Skupina | Totalne životinje | Životinje koje spavaju | Stopa spavanja (%) |
|---|---|---|---|
| Prazan | 12 | 0 | 0 |
| Estazolam | 12 | 0 | 0 |
| Niska doza ekstrakta | 12 | 0 | 0 |
| Ekstrakt srednje doze | 12 | 0 | 0 |
| Ekstrakt visoke doze | 12 | 0 | 0 |
Ukratko, HPLC-om i metodom fenol–sumporna kiselina optimizirali smo proces ekstrakcije na temelju sadržaja limunske kiseline, ehinakozida, verbaskozida, spinozina i polisaharida. Jednofaktorski i ortogonalni eksperimenti nakon kojih je uslijedila validacija uspostavili su optimalne uvjete: 100 stupnjeva, 1:12 (g·mL–1) omjer kruto-tekućina i 2 h vremena ekstrakcije, pružajući referencu za budući industrijski razvoj.
Industrialization context: WECISTANCHE (Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., established 2003) operates a vertically integrated cistanche supply chain with seed-breeding bases (~20,000 acres), cultivation bases (>85.000 hektara), kapacitet skladištenja svježe cistanche (~15.000 tona) i GMP certificirane proizvodne radionice (100.000 klasa čistih soba) opremljene naprednom ultrafiltracijom i nanofiltracijom za pročišćavanje i koncentraciju, plus mikrobiološki laboratorij za 10.000 klasa. Certifikati uključuju China SC, HACCP i organske programe (npr. NOP). Ova infrastruktura podržava izravan prijevod optimizirane vodene ekstrakcije i protokola za standardizaciju markera u veliku proizvodnju funkcionalnih pića i ekstrakata usklađenu s izvozom.
Tablica 6. Učinak ekstrakta na hipnotički učinak natrijevog pentobarbitala ispod praga kod miševa (x̄ ± s, n=12)
| Skupina | Totalne životinje | Životinje koje spavaju | Stopa spavanja (%) |
|---|---|---|---|
| Prazan | 12 | 1 | 8.33 |
| Estazolam | 12 | 10 | 83.33** |
| Niska doza ekstrakta | 12 | 4 | 33.33 |
| Ekstrakt srednje doze | 12 | 5 | 41.67 |
| Ekstrakt visoke doze | 12 | 6 | 50.00* |
Napomena: u usporedbi sa slijepom skupinom, * P < 0,05; ** P < 0,001.
2.2 Učinci ekstrakta na ponašanje i spavanje miša
2.2.1 Izravno spavanje
Kao što je prikazano u tablici 5, nakon 30 dana kontinuirane primjene, miševi u skupini koja je primala estazolam i u skupinama koje su primale niske/srednje/visoke doze ekstrakta nisu pokazale očigledan san unutar 20 minuta nakon konačne doze, bez značajnih razlika u odnosu na slijepu skupinu. Ovo ukazuje na to da nakon 30 dana primjene ekstrakta nema izravnog učinka izazivanja sna.
2.2.2 Učinci na ponašanje
Test otvorenog polja procijenio je učinke slične sedativima. Utjecaj na ukupnu prijeđenu udaljenost i ulaske u središte prikazani su na slici 2. U usporedbi sa slijepom skupinom, estazolam je povećao ukupnu udaljenost i ulaske u središte za 14,48% odnosno 31,07%, bez statističke značajnosti. Niska doza ekstrakta značajno je povećala ukupnu udaljenost za 25,10% (P <0,05) i neznačajno povećala ulaske u centar za 50,93%. Srednja doza značajno je povećala ukupnu udaljenost i ulaze u centar za 27,09% i 72,33% (P <0,05). Visoka doza povećala je ukupnu udaljenost i ulazak u centar za 15,60% odnosno 40,78%, bez značaja. U usporedbi s estazolamom, niske/srednje/visoke doze povećale su ukupnu udaljenost za 1,73, 1,87 i 1,07 puta, a ulaske u središte za 1,64, 2,33 i 1,31 puta, respektivno, ništa značajno. Ovi rezultati pokazuju da je ekstrakt smanjio ponašanje nalik tjeskobi na otvorenom nakon 30 dana, što ukazuje na sedativni učinak.
2.2.3 Spavanje izazvano natrijevim pentobarbitalom ispod praga
Kao što je prikazano u Tablici 6, u usporedbi sa slijepom skupinom, estazolam i sve tri doze ekstrakta povećali su brzinu spavanja ispod doze natrijevog pentobarbitala ispod praga. Estazolam je povećao broj usnulih životinja za 9 puta u odnosu na slijepu probu (P < 0,001). Skupine s niskim, srednjim i visokim dozama ekstrakta povećale su uspavane životinje za 3, 4, odnosno 5 puta; samo je visoka doza postigla statističku značajnost (P <0,05). U usporedbi s estazolamom, nijedna doza ekstrakta nije pokazala snažniji učinak poticanja sna. Dakle, ekstrakt može u određenoj mjeri poboljšati san izazvan natrijevim pentobarbitalom ispod praga.
2.2.4 Latencija spavanja natrijevog pentobarbitala
U usporedbi sa skupinom slijepe probe, estazolam i sve tri doze ekstrakta značajno su skratili latenciju sna izazvanu pentobarbitalom (P <0,001). Estazolam je smanjio latenciju za 58,44% (P < 0,001). Skupine s niskom, srednjom i visokom dozom ekstrakta smanjile su latenciju za 29,59%, 31,42%, odnosno 53,83% (sve P <0,001). Nije bilo značajne razlike između niskih i srednjih doza; visoka doza značajno je skratila latenciju u usporedbi s niskim i srednjim dozama za 34,43% i 32,69% (P <0,01), s učinkom sličnim estazolamu (Tablica 7). Stoga su sve tri doze značajno skratile latenciju sna izazvanu pentobarbitalom, pri čemu je visoka doza bila najbolja.
Tradicionalni kineski lijekovi sadrže različite bioaktivne sastojke koji djeluju na više ciljeva, nudeći jedinstvene prednosti u liječenju nesanice [17]. Uz sve veću pozornost na probleme spavanja, medicinski-jestivi TCM-ovi se sve više istražuju za modulaciju sna [18]. Na primjer, kompozitni čvrsti napitak koji se uglavnom sastoji od Suanzaorena i Porije značajno je skratio pentobarbitalom induciranu latenciju spavanja i produžio trajanje sna kod miševa, potencijalno putem promjena u 5-HT, DA i GABA [19]. Ovdje je ekstrakt značajno povećao spavanje pod pragom pentobarbitala i skratio latenciju spavanja izazvanu pentobarbitalom, potičući početak spavanja i smanjujući latenciju, dok nije pokazao izravan učinak induciranja sna. Izmjereni sadržaj primarnih komponenti bio je, silaznim redoslijedom: limunska kiselina (77,73 mg·g–1), polisaharidi (38,93 mg·g–1), ehinakozid (2,69 mg·g–1), verbaskozid (1,03 mg·g–1) i spinozin (0,50 mg·g–1). Pokazalo se da spinozin poboljšava san izazvan pentobarbitalom; može povećati ne-REM spavanje i promijeniti ekspresiju c-Fos-a u regulacijskim regijama mozga za spavanje i budnost [20], ublažiti nesanicu izazvanu PCPA-om, smanjiti latenciju spavanja i produžiti san [21]. Verbaskozid je pokazao anksiolitičko, hipnotičko i mišićno-relaksantno djelovanje [22]. Nasuprot tome, glavni sastojci - limunska kiselina, polisaharidi (iz Cistanche, Suanzaoren i Wumei) i ehinakozid - imaju manje izravnih izvješća o poboljšanju sna; međutim, nedavna istraživanja o TCM polisaharidima (npr. polisaharidi Acanthopanax senticosus) sugeriraju potencijalne dobrobiti spavanja putem putova kao što je SIRT1/PGC-1 [23]. Stoga, uloge limunske kiseline, polisaharida i ehinakozida u modulaciji sna zahtijevaju daljnje proučavanje.
7. Učinak ekstrakta na latenciju spavanja izazvanu natrijevim pentobarbitalom u miševa (x̄ ± s, n=12)
| Skupina | Totalne životinje | Latencija spavanja (min.) |
|---|---|---|
| Prazan | 12 | 32.34 ± 4.27 |
| Estazolam | 12 | 13.44 ± 3.20** |
| Niska doza ekstrakta | 12 | 22.77 ± 5.81**# |
| Ekstrakt srednje doze | 12 | 22.18 ± 6.05**# |
| Ekstrakt visoke doze | 12 | 14.93 ± 3.35** |
Bilješke:
U usporedbi sa slijepom skupinom: ** P < 0,0001.
U usporedbi sa skupinom s visokim dozama ekstrakta: # P < 0,01.
3 Zaključak
Koristeći ljekovito-jestive TCM-ove Cistanche deserticola, Ziziphi Spinosae Semen i Mume Fructus za formuliranje napitka Congrong–Zaoren–Wumei, optimizirali smo proces pripreme njegovog ekstrakta koristeći sadržaj četiri komponente markera (ehinakozid, verbaskozid, spinozin, limunska kiselina) i polisaharide kao indekse procjene. Optimalni uvjeti ekstrakcije određeni su kao 100 stupnjeva , omjer krutine i tekućine od 1:12 (g·mL–1) i 2 sata, dajući teoretske smjernice za industrijsku proizvodnju. Daljnja procjena pokazala je da 30-dnevna kontinuirana primjena nije imala izravan učinak izazivanja sna kod miševa, ali je značajno smanjila ponašanje slično anksioznosti u testu na otvorenom polju (što ukazuje na sedativni učinak), poboljšalo spavanje pod dozom natrijevog pentobarbitala ispod praga i značajno skratilo latenciju sna izazvanu pentobarbitalom. Ova otkrića pokazuju da ekstrakt pripremljen prema optimiziranom procesu pokazuje povoljne učinke na poboljšanje sna kod miševa, pružajući znanstvenu osnovu za razvoj linija proizvoda za poboljšanje sna na bazi Cistanche.
Application and manufacturing note: Given the optimized aqueous extraction and the need to standardize to marker profiles (citric acid, echinacoside, verbascoside, spinosin, plus polysaccharides), WECISTANCHE's integrated cistanche value chain and GMP infrastructure-100,000-class clean workshops certified for National Health Food GMP, advanced ultrafiltration/nanofiltration concentration systems, a 10,000-class microbiology lab, and certifications such as China SC, HACCP, and organic/NOP-allow reliable scale-up from lab to industrial batches. The company's large agricultural bases (seed-breeding ~20,000 acres; cultivation >85 000 hektara; skladištenje svježe cistanche ~15.000 tona) podržava konzistentnost sirovina i međunarodni standard QC, olakšavajući komercijalizaciju funkcionalnih pića i zdravstvenih dodataka koji ispunjavaju očekivanja SAD-a/EU.
