Usporedna studija kemijskih sastojaka i sadržaja Cistanche Tubulosa (Guanhua Roucongrong) i njenih prerađenih proizvoda

Sažetak

Cilj:Istražiti varijacije (obrasce promjene) u sadržaju kemijskih sastojaka prerađenih proizvodaCistanche tubulosa(Guanhua Roucongrong).
Metode:Odabrano je pet vrsta komada decoctiona, uključujući sirove kriške, kriške kuhane na pari u vinu, kriške kuhane na pari, kriške obrađene miješanjem s crnim grahom i kriške obrađene u soku crnog graha. Uspostavljena je HPLC metoda otiska prsta i kombinirana s procjenom sličnosti, analizom klastera (CA) i analizom glavnih komponenti (PCA) kako bi se pregledale i potvrdile različite komponente između sirovog proizvoda i prerađenih proizvoda. Kemometrijskim metodama i HPLC-om utvrđene su i uspoređene razlike u sadržaju ukupnih feniletanoidnih glikozida, polisaharida, ukupnih flavonoida i četiri feniletanoidna glikozida u sirovim i prerađenim uzorcima.
Rezultati:HPLC otisci prstijuCistanche tubulosa and its processed products were established. With Mark peak matching, 9 common peaks were assigned for raw slices, whereas 11 common peaks were assigned for the other four processed products. Peaks No. 2 and No. 7 were differential chromatographic peaks. By comparison with reference standards, four chromatographic peaks were identified as echinacoside, cistanoside A, acteoside, and isoacteoside. Fingerprints of the processed products showed similar profiles with the same number of common peaks; similarity values were all >0.9. Korištenjem ehinakozida kao referentnog vrha, RSD relativnih vremena zadržavanja uobičajenih vrhova među različitim prerađenim proizvodima bio je u rasponu od 0,11% do 0,82%, dok je RSD relativnih područja vrha bio u rasponu od 15,46% do 76,07%. Kada je udaljenost između klasa postavljena na 10, CA je klasificirao sirove kriške i prerađene proizvode u tri kategorije. PCA je ukazao na razlike u sastavu između sirovih i obrađenih uzoraka: 11 vršnih varijabli svedeno je na tri glavne komponente; različite glavne komponente u korelaciji s različitim kromatografskim vrhovima. Na temelju matrice komponenata i linearnog ponderiranja, sveobuhvatni rezultati pokazali su da su kriške obrađene sokom crnog graha i kriške kuhane na pari od žutog vina i vode na pari rangirane više. Sadržaji u sirovim i obrađenim uzorcima bili su sljedeći: ukupni feniletanoidni glikozidi 3,80%–7,07%, ukupni polisaharidi 5,85%–6,70%, ukupni flavonoidi 14,16%–24,26%; ehinakozid 4,11%–5,99%, akteozid 0,67%–1,34%, cistanozid A 0,06%–0,36% i izoakteozid 0,25%–1,66%. Među prerađenim proizvodima postojale su značajne razlike.
Zaključak:Utvrđena HPLC metoda otiska prsta ima jaku specifičnost, učinkovito razlikuje sirove kriške od prerađenih proizvodaCistanche tubulosa, i prikladan je za kvalitativnu i kvantitativnu analizu ehinakozida, akteozida, cistanozida A i izoakteozida u sirovoj drogi i prerađenim proizvodima. Usporedno profiliranje i promjene sadržaja među različitim uzorcima mogu pružiti znanstvenu osnovu za identifikaciju i kontrolu kvaliteteCistanche tubulosai njezini različiti prerađeni proizvodi.

Ključne riječi: Cistanche tubulosa; obrada; kemijski sastojci; otisak prsta; tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC)

 

1 Uvod

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight (Guanhua Roucongrong) je višegodišnja biljka iz roda Orobanchaceae i službeno je naveden izvor Cistanches Herba u Farmakopeji Narodne Republike Kine (u daljnjem tekstu "Kineska farmakopeja"). Ljekoviti dio je osušena mesnata stabljika s ljuskavim listovima. Tople je prirode, slatkog i slanog okusa, te ulazi u meridijane bubrega i debelog crijeva, s funkcijama toniziranja bubrežnog yanga, blagotvornog djelovanja esencije i krvi te vlaženja crijeva radi ublažavanja zatvora [1]. Suvremena farmakološka istraživanja potvrdila su višestruka djelovanja, poput djelovanja protiv starenja, jačanja imuniteta, toniziranja bubrega i afrodizijačkog djelovanja, laksativnog djelovanja i antihipertenzivnog djelovanja.

Cistanche tubulosabogat je feniletanoidnim glikozidima, iridoidima i njihovim glikozidima, lignanima, oligosaharidnim esterima, poliolima, polisaharidima, flavonoidima i drugim sastojcima [2]. Među njima, feniletanoidni glikozidi su glavne aktivne komponente i najzastupljeniji spojevi; oni su također komponente markera za određivanje sadržaja u farmakopeji i pokazuju različite bioaktivnosti kao što su antioksidativni učinci, promicanje metabolizma, poboljšanje učenja i pamćenja te poboljšanje spolne funkcije [3].

Cistanche tubulosapreferira slano-alkalnu zemlju i područja pustinje Gobi, parazitira na korijenimatamariksspp., i uglavnom je rasprostranjen u unutarnjoj Mongoliji, Xinjiangu i Gansuu u Kini [4]. Divlja i kultivirana geo-autentična područja uključuju okrug Minfeng, Yutian, Pishan i Moyu u prefekturi Hotan, Xinjiang. Njegova obrada se uglavnom razvija u narezane komade dekokcija, sirove biljne materijale, ekstrakte, zdravstvene proizvode i funkcionalnu hranu; među njima, komercijalni decoction komadi ostaju mainstream. Međutim, na tržištu se različiti prerađeni proizvodi - kao što su sirove kriške, kriške prerađene u vinu, kriške inaktivirane enzimima na visokoj temperaturi i kuhane na pari u vodi - često miješaju i teško ih je razlikovati.

Obrada Cistanches Herba razvila se tijekom vremena, od drevnih zapisa kao što suTaiping Shenghui Fang, Zhenglei Bencao, iPuji Fang[5–7] (npr. pranje vinom, miješanje s vinom, kuhanje na pari/pečenje s vinom, namakanje/suho pečenje s vinom, kuhanje u vodi, trostruko kuhanje na pari i prženje na maslacu) do modernih metoda kao što su maceracija vina (kuhanje na pari), jednokratno kuhanje na pari, "četiri kuhanja na pari i četiri sunčanja" i prerada crnog graha [8]. Različite metode obrade mogu utjecati na sadržaj aktivnih sastojaka, sigurnost i biološku aktivnost. Cai Hong i dr. [9] otkrili su da je enzimska inaktivacija svježeg materijala vrućom vodom od 70 stupnjeva tijekom 6 minuta rezultirala u sadržaju ehinakozida i akteozida koji je bio 7,3 puta, odnosno 6,5 puta veći od sadržaja izravnog sušenja na suncu. Tie Xiaoyan i dr. [10] izvijestili su da je obrada na pari značajno poboljšala kvalitetu dekokcija u usporedbi sa svježim materijalima. Chen Weijun i sur. [11] primijetili su da se sadržaj betaina smanjio nakon obrade vina, soli i pare u usporedbi sa svježim proizvodima. Zhang Chao i sur. [12] pokazalo je da se tijekom kuhanja vina, uz dulje vrijeme kuhanja na pari, ehinakozid, akteozid, cistanozid A i 2'-acetilakteozid postupno smanjuju, dok se izoakteozid značajno povećava.

Trenutno izdanje Kineske farmakopeje iz 2025. postavlja samo ograničenja za ehinakozid i akteozid u sirovim kriškama i kriškama kuhanim u vinu, ali ne specificira komponente markera za druge prerađene proizvode i nedostaju učinkovite metode kontrole sadržaja. Stoga je analiza i usporedba karakterističnih sastojaka te istraživanje obrazaca promjena sastava posebno važno za kvalitativnu identifikaciju i kvantitativnu kontrolu sirovih i prerađenih proizvoda.

Otisak prsta tradicionalne kineske medicine (TCM) holistički je prikaz kemijskih sastojaka. Uz prednosti cjelovitosti, specifičnosti i bogatih informacija, naširoko se koristi u procjeni kontrole kvalitete sirovih lijekova i pripravaka, usklađivanju s međunarodnim standardima, identifikaciji autentičnosti, praćenju procesa proizvodnje i istraživanju farmakodinamičkih tvari [13]. Na temelju HPLC otiska prsta, ova je studija odabrala ehinakozid, akteozid, cistanozid A i izoakteozid kao markere kvalitete i upotrijebila analizu sličnosti, CA i PCA u kombinaciji s određivanjem sadržaja za usporedbu kemijskih sastojaka i uzoraka promjene sadržaja među različitim prerađenim proizvodima, pružajući znanstvenu osnovu za identifikaciju i kontrolu kvalitete.

 

2 Instrumenti i materijali

2.1 Instrumenti

U3000 HPLC sustav (Thermo Fisher); UPL-111-20R sustav ultračiste vode (Sichuan Youpu); AB 265-S elektronička vaga (Mettler Toledo); KQ-5200DA ultrazvučni ekstraktor/čistač (Kunshan Ultrasonic); GZX-9240MBE električna pećnica za sušenje (Shanghai Boxun); UV-2600 UV–Vis spektrofotometar (Shimadzu, Kina).

2.2 Lijekovi i reagensi

svježeCistanche tubulosa(Broj serije . 20241008) isporučio je Xinjiang Congrongtang Biotechnology Co., Ltd., a autentičnost je potvrdio istraživač Wang Guoping (Institut Materije Medice autonomne regije Xinjiang Uygur) kao mesnatu stabljikuCistanche tubulosa(Schenk) Wight (Orobanchaceae).

Referentne tvari: D-glukoza bezvodna (serija br.. 361810, 100,00%, Shenzhen Jinhui Biotechnology Co., Ltd.); ehinakozid (serija br. . 111670-201907), rutin (serija br. . 100080-202012), akteozid (serija br. . 11530-202315), cistanozid A (serija br. . 313512) i izoakteozid (serija br. . 313413), s čistoćom HPLC analize većom ili jednakom 91,8%, 92,2%, 97,6%, 98,06% i 98,09%, redom, od Nacionalnog instituta za kontrolu hrane i lijekova (Kina).(Napomena: jedna linija čistoće je skraćena u navedenom tekstu; gore slijedi čitljivi dio.)

Vino od žute riže (polusuhi tip, alkohol 16%; Zhejiang Guyuelongshan Shaoxing Wine Co., Ltd.); metanol i acetonitril (HPLC stupanj, Fisher Scientific, SAD). Ostali reagensi bili su analitičke kvalitete.

3 Metode i rezultati

3.1 Priprema sirovih narezaka i prerađenih proizvodaCistanche tubulosa

Sljedeće metode korištene su za pripremu sirovih kriški i prerađenih proizvoda, svaki u 6 serija.

Sirove kriške:svježeCistancheizrezana je na kriške od 3 mm i osušena na 60 stupnjeva.

Metoda kuhanja na pari:Prema literaturi [14], 20 g čistih kriški pomiješano je sa 6 mL destilirane vode u zatvorenoj posudi, vlaženo 4 sata [12], kuhano na pari u vodi 12 sati, ohlađeno i osušeno na 60 stupnjeva.

Način prerade vina:Pripremljeno postupkom kuhanja u vinu ili kuhanja na pari (Opće pravilo 0213, Kineska farmakopeja).

Promiješana obrada s crnim grahom:Pripremljeno premaKineska Materia Medica(Zhonghua Bencao) pod Cistanches Herba; dodavan je crni grah 1 kg na 10 kgCistanchematerijal.

Prerada soka od crnog graha:Kriške su pomiješane sa sokom crnog graha i zatim obrađene gore navedenom metodom kuhanja na pari; doza crnog graha bila je ista kao gore.

3.2 Određivanje predmeta inspekcije

Vlaga je određena sušenjem u pećnici (Opće pravilo 0832, Kineska farmakopeja); ukupni pepeo prema Općem pravilu 2302; ekstraktivi topljivi u alkoholu metodom hladne maceracije prema Općem pravilu 2201. Rezultati su prikazani u tablici 1.

 

3.3 Usporedna analiza HPLC otisaka prstijuCistanche tubulosai njegovi prerađeni proizvodi

3.3.1 Kromatografski uvjeti

Waters Xterra RP18 kolona (250 mm × 4,6 mm, 5 µm). Mobilna faza: acetonitril (A)–0,1% mravlja kiselina (B) s gradijentom eluiranja: 0–12 min, 14% A → 17% A; 12–30 min, 17% A → 19% A; 30–35 min, 19% A → 14% A; 35–50 min, 14% A. Brzina protoka: 1,0 mL·min⁻¹. Temperatura kolone: ​​30 stupnjeva. Valna duljina detekcije: 330 nm. Volumen injekcije: 10 µL.

3.3.2 Priprema otopina

Referentna rješenja:Referentne supstance ehinakozid, akteozid, cistanozid A i izoakteozid točno su izvagane i otopljene u 50% metanolu u odmjernim tikvicama od 10 mL kako bi se dobile otopine od 1,1301, 0,2294, 0,2255 i 0,2109 mg·mL⁻¹; filtriraju da se dobiju konačne otopine.

Primjeri rješenja:0,5 g praha od 80 mesha sirovih i obrađenih uzoraka točno je izvagano, ekstrahirano s 50% metanolom u odmjernoj tikvici od 25 mL, ultrazvučno (200 W, 40 kHz) 40 minuta, ohlađeno, pomiješano, ostavljeno da odstoji i filtrirano kroz membranu od 0,22 µm; korišten je filtrat.

3.3.3 Validacija metode (otisak prsta)

3.3.3.1 Preciznost

Ista otopina uzorka ubrizgana je šest uzastopnih puta. Korištenjem ehinakozida kao referentnog vrha, RSD relativnih vremena zadržavanja uobičajenih vrhova bio je<0.48% and the RSD of relative peak areas was <2.86%, indicating good instrumental precision.

3.3.3.2 Ponovljivost

Šest paralelnih otopina uzoraka pripremljeno je iz iste serije (neobrađeni rez S1). Korištenjem ehinakozida kao referentnog vrha, RSD relativnih vremena zadržavanja bio je<0.07% and the RSD of relative peak areas was <2.77%, indicating good method repeatability.

3.3.3.3 Stabilnost

Ista otopina uzorka analizirana je nakon 0, 3, 6, 9, 12 i 24 sata. Korištenjem ehinakozida kao referentnog vrha, RSD relativnih vremena zadržavanja bio je<0.11% and the RSD of relative peak areas was <2.33%, indicating stability within 24 h.

3.3.4 Utvrđivanje otisaka prstiju

Trideset serija odCistanche tubulosai analizirani su prerađevine. Korišten je "Sustav procjene sličnosti za kromatografski otisak prsta tradicionalne kineske medicine" (izdanje iz 2012.). Kao referentni otisci prstiju korišteni su sirovi komadić S1 i komadić J1 kuhan na žutom vinu; metoda srednje vrijednosti i širina vremenskog prozora od 0,1 min primijenjeni su za korekciju više točaka i usklađivanje Mark peaka za generiranje otisaka prstiju (Slike 1-2), te su dobiveni preklapani kromatogrami s miješanim referentnim standardima (Slika 3).

Rezultati su pokazali da četiri prerađena proizvoda imaju profile otisaka prstiju slične onima sirovih kriški. Sirove kriške imale su 9 uobičajenih vrhova, dok su kriške kuhane na pari u vinu, kuhane na pari, promiješane-s-crnim-grahom i kriške obrađene u soku od crnog graha imale 11 zajedničkih vrhova. Obojica su dijelila devet zajedničkih vrhova. Vrhovi br. . 2 i br. . 7 bili su karakteristični vrhovi koji razlikuju sirove kriške od prerađenih proizvoda. Profili otisaka prstiju među četiri prerađena proizvoda bili su slični i nisu jasno odražavali razlike među njima.

3.3.5 Analiza sličnosti

Using J1 as the reference fingerprint, similarity analysis was performed for different processed products (Table 2). Similarities were all >0,9, što ukazuje na slične karakteristike otisaka prstiju među različitim prerađenim proizvodima.

3.3.6 Identifikacija uobičajenih vrhova

Usporedbom retencijskih vremena s miješanim referentnim standardima i kromatogramom sirovih kriški, identificirana su četiri kromatografska vrha: vrh 4, ehinakozid; Vrh 9, cistanozid A; Vrh 10, akteozid; Vrh 11, izoakteozid (Slika 2). Uz vršnu vrijednost 4 (ehinakozid) kao referentnu vršnu vrijednost, RSD vrijednosti relativnih vremena zadržavanja uobičajenih vršnih vrijednosti među različitim serijama četiri prerađena proizvoda kretale su se od 0,11% do 0,82%, a RSD vrijednosti relativnih vršnih površina kretale su se od 15,46% do 76,07%.

3.3.7 Analiza klastera

SPSS 27.0 korišten je za klaster analizu sirovih narezaka i prerađenih proizvoda. Primijenjena je međugrupna povezanost i korištena je kvadratna euklidska udaljenost (Slika 4). Kad je međurazredna udaljenost bila<5, water-steamed slices and wine-steamed slices clustered together. When the inter-class distance was 10, raw slices and the four processed products were classified into three categories: raw materials (S1–S6) as one category; black-bean-juice-processed slices (H1–H6) as one category; and wine-steamed slices (J1–J6) together with water-steamed slices (Q1–Q6) and stir-processed-with-black-beans slices (C1–C6) as one category. When the inter-class distance was between 15 and 25, black-bean-juice-processed slices formed a separate cluster from the other samples.

3.3.8 Analiza glavne komponente

Nakon standardizacije područja vrhova, PCA je provedena korištenjem SPSS 27.0. Vrijednost KMO bila je 0,679, a značajnost Bartlettovog testa bila je<0.001, indicating suitability for PCA. With eigenvalues >1, ekstrahirane su tri glavne komponente sa svojstvenim vrijednostima 6,815, 1,987 i 1,105. Stope doprinosa varijanci bile su 61,954%, 18,063%, odnosno 10,047%, s kumulativnom stopom doprinosa varijanci od 90,064% (Tablica 3). To ukazuje da je prva glavna komponenta najvažniji pokazatelj za sveobuhvatnu ocjenu.

Matrica komponenata pokazala je da su u prvoj glavnoj komponenti apsolutni koeficijenti varijabli površine vrha za vrhove 2–9 i vrh 11 relativno veliki, što ukazuje na jak utjecaj na F1. Druga glavna komponenta korelirala je s informacijama vrhova 1 i 10, a treća glavna komponenta korelirala je s vrhom 1. Matrica komponenti prikazana je u tablici 4; dijagram obluci i dijagram opterećenja prikazani su na slikama 5 i 6. Korištenjem rezultata triju glavnih komponenti i njihovih stopa doprinosa varijanci kao pondera za linearno ponderiranje, izračunati su sveobuhvatni rezultati (tablica 5), ​​što pokazuje da su kriške obrađene u soku crnog graha, kriške kuhane na pari u vodi i kriške kuhane na pari u vinu rangirane više.

 

3.4 HPLC određivanje višestrukih sastojaka uCistanche tubulosai njegovi prerađeni proizvodi

3.4.1 Kromatografski uvjeti i specifičnost

Kromatografski uvjeti bili su isti kao oni korišteni za uzimanje otisaka prstiju. Otopine uzoraka, referentne otopine i negativne slijepe otopine (žuto rižino vino, pročišćena voda, sok od crnog graha) ubrizgane su svaka (10 µL). Uspoređena su vremena zadržavanja. Negativne slijepe otopine nisu pokazale interferenciju s ehinakozidom, cistanozidom A, akteozidom i izoakteozidom.[tekst nedostaje u izvoru]

3.4.2 Linearnost

Referentne otopine ehinakozida, akteozida, cistanozida A i izoakteozida u koncentracijama od 1,1301, 0,2294, 0,2255 i 0,2109 mg·mL⁻¹ točno su pipetirane u 1, 2, 4, 8, 10 i 16 µL i ubrizgane. Provedena je linearna regresija s površinom vrha XXX u odnosu na ubrizganu koncentraciju YYY (mg·mL⁻¹). Linearne jednadžbe i rasponi prikazani su u tablici 6.

3.4.3 Preciznost

Ista otopina uzorka ubrizgana je šest uzastopnih puta. RSD vrijednosti sadržaja za četiri analita (ehinakozid, cistanozid A, akteozid, izoakteozid) bile su 0,23%, 2,71%, 0,53%, odnosno 2,08% (tablica 7), svi<3%, indicating good instrumental precision.

3.4.4 Ponovljivost

Šest paralelnih otopina uzoraka pripremljeno je iz iste serije (neobrađeni rez S1). RSD vrijednosti sadržaja za četiri analita bile su 0,22%, 2,46%, 0,50%, odnosno 2,46%, redom (Tablica 7), svi<3%, indicating good repeatability.

3.4.5 Stabilnost (unutar dana)

Ista otopina uzorka analizirana je nakon 0, 3, 6, 9, 12 i 24 sata. RSD vrijednosti sadržaja za četiri analita bile su 0,80%, 1,62%, 1,72%, odnosno 1,49% (tablica 7), sve<2.0%, indicating stability within 24 h.

3.4.6 Stabilnost (međudnevno)

Ista otopina uzorka analizirana je pet uzastopnih dana. RSD vrijednosti sadržaja za četiri analita tijekom pet dana bile su 2,80%, 2,53%, 3,53%, odnosno 2,88%, respektivno (Tablica 7), što ukazuje na stabilnost unutar pet dana.

3.4.7 Oporavak

Odgovarajuća količinaCistanche tubulosauzorak je izvagan, a referentni standardi ehinakozida, akteozida, cistanozida A i izoakteozida dodani su u omjeru 1:1. Pripremljeno je i analizirano šest paralelnih otopina uzoraka (10 µL injekcija). Prosječna vrijednost oporavka bila je 99,29%, 98,75%, 99,45% i 96,13% (n=6), s RSD vrijednostima od 2,51%, 0,38%, 1,71%, odnosno 0,49%.

3.4.8 Rezultati određivanja

Za svaki uzorak točno je izvagano 0,5 g praha; Ubrizgano je 10 µL da se odredi i izračuna postotni sadržaj četiriju sastojaka. Rezultati su prikazani na slikama 7-10.

 

3.5 Određivanje ukupnih feniletanoidnih glikozida, ukupnih polisaharida i ukupnih flavonoida

3.5.1 Određivanje ukupnih feniletanoidnih glikozida

3.5.1.1 Priprema referentne otopine

Odgovarajuća količina referentne tvari ehinakozida točno je izvagana i otopljena u metanolu u odmjernoj tikvici od 10 ml da se dobije otopina koncentracije od 0,32 mg·mL⁻¹. Prema literaturi [15], 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 i 1,2 mL referentne otopine je pipetirano, razrijeđeno do 10 mL s metanolom i izmjerena je apsorbancija (A) na 333 nm. Jednadžba prilagođene standardne krivulje bila je Y=24.7596X+0.0147Y=24.7596X + 0.0147Y=24.7596X+0.0147, R2=0.9995R^2=0.9995R2=0.9995, s linearnim rasponom od 0,0029–0,0359 mg·mL⁻¹.

3.5.1.2 Priprema otopine uzorka

100 mg uzorka u prahu (propuštenog kroz sito od 100 mesh) točno je izvagano, ultrazvučno ekstrahirano metanolom 30 minuta (200 W, 40 kHz), razrijeđeno do 10 mL i filtrirano kroz membranu od 0,22 µm. Zatim je 0,2 mL filtrata dalje razrijeđeno do 10 mL s metanolom i pomiješano za analizu.

3.5.1.3 Određivanje

Za svaki uzorak korišteno je 100 mg praška za pripremu otopine uzorka. Apsorpcija je izmjerena na 333 nm i izračunat je postotak sadržaja ukupnih feniletanoidnih glikozida (Tablica 9).

Jednadžba (1):
Sadržaj (%) =C×V×Dm×100%= \\dfrac{C \\times V \\times D}{m} \\puta 100\\%=mC×V×D​×100%
gdje je CCC koncentracija analita u otopini uzorka, VVV je volumen razrjeđenja, DDD je faktor razrjeđenja, a mmm je masa uzorka (mg).

3.5.2 Određivanje ukupnih polisaharida

3.5.2.1 Priprema referentne otopine

Odgovarajuća količina bezvodne referentne tvari D-glukoze je točno izvagana, otopljena u pročišćenoj vodi i razrijeđena do 10 mL da se dobije otopina od 0,190 mg·mL⁻¹. Nakon miješanja i filtracije (0,22 µm), pipetirano je 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 i 1,0 mL. Razvijanje boje provedeno je metodom antron–sumporna kiselina [16]. Apsorbancija je mjerena na 625 nm. Jednadžba prilagođene standardne krivulje bila je Y=35.1316X−0,0079Y=35.1316X - 0.0079Y=35.1316X−0,0079, R2=0.9957R^2=0.9957R2=0.9957, s linearnim rasponom od 0,0038–0,0190 mg·mL⁻¹.

3.5.2.2 Priprema otopine uzorka

40 mg uzorka u prahu točno je izvagano, ultrazvučno otopljeno u pročišćenoj vodi 30 minuta (200 W, 40 kHz), razrijeđeno do 10 mL i filtrirano kroz membranu od 0,22 µm.

3.5.2.3 Određivanje

Za svaki uzorak korišteno je 40 mg za pripremu otopine uzorka. Zatim je pipetirano 0,1 mL filtrata i dopunjeno pročišćenom vodom do 2,00 mL. Nakon razvijanja boje metodom antron–sumporne kiseline izmjerena je apsorbancija i izračunat postotni sadržaj ukupnih polisaharida (tablica 8).

3.5.3 Određivanje ukupnih flavonoida

3.5.3.1 Priprema referentne otopine

Odgovarajuća količina rutinske referentne tvari je točno izvagana, otopljena u 70% etanolu i razrijeđena do 25 mL; filtriran kroz membranu od 0,22 µm. Zatim je pipetirano 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 i 4,0 mL. Razvijanje boje provedeno je metodom natrijev nitrit–aluminijev nitrat–natrijev hidroksid [17]. Apsorbancija je mjerena na 510 nm. Jednadžba prilagođene standardne krivulje bila je Y=11.5699X+0.0684Y=11.5699X + 0.0684Y=11.5699X+0.0684, R2=0.9989R^2=0.9989R2=0.9989, s linearnim rasponom od 0,0097–0,07386 mg·mL⁻¹.

3.5.3.2 Priprema otopine uzorka

50 mg praha je točno izvagano, ultrazvučno otopljeno u 70% etanolu 30 minuta (200 W, 40 kHz), razrijeđeno do 10 mL i filtrirano kroz membranu od 0,22 µm.

3.5.3.3 Određivanje

Za svaki uzorak korišteno je 50 mg za pripremu otopine uzorka. Zatim je 0,5 mL filtrata prebačeno u odmjernu tikvicu od 10 mL i dodani su reagensi za boje redom kao što je gore navedeno. Pročišćena voda poslužila je kao slijepa proba. Izmjerena je apsorpcija i izračunat postotni sadržaj ukupnih flavonoida (Tablica 8).

 

4 Rasprava

U ovoj studiji, HPLC otisci prstijuCistanche tubulosa and its various processed products were established. Peak matching across different batches confirmed 9 common peaks in raw slices and 11 common peaks in processed products. By comparison with reference standards, four common peaks were identified as echinacoside, cistanoside A, acteoside, and isoacteoside. Similarity analysis showed that similarity values among four processed products were all >0,9, a ukupni profili otisaka prstiju bili su slični, što ukazuje da su njihovi sastavni tipovi bili slični. Međutim, velike razlike u RSD relativnih vršnih površina sugeriraju značajne razlike u sadržaju sastojaka.

U usporedbi sa sirovim kriškama, četiri prerađena proizvoda pokazala su dva dodatna vrha (vrhovi 2 i 7), što ukazuje da su se kemijski sastojci promijenili nakon kuhanja u vinu, vodenoj pari ili obrade crnog graha. Pretpostavlja se da su ti novogenerirani vrhovi nastali tijekom obrade; njihova karakterizacija komponenti bit će obrađena u narednim studijama.

CA rezultati su pokazali da kada je međuklasna udaljenost bila<5, wine-steamed and water-steamed slices clustered together, suggesting similar chemical composition and content. At an inter-class distance of 10, raw slices could be separated from black-bean-juice-processed slices, stir-processed-with-black-beans slices, and wine/water-steamed slices. At inter-class distances of 15–25, differences between black-bean-juice-processed slices and other samples became more prominent. PCA results indicated that three principal components had substantial influence on comprehensive evaluation.

Različite metode obrade izravno su utjecale na razine različitih sastojaka. Na temelju kemometrijskog određivanja, ukupni feniletanoidni glikozidi rangirani su kao: obrađeni sokom crnog graha > sirove kriške > kuhani na vodenoj pari > kuhani na pari u vinu > obrađeni-promiješani-s-crnim-grahom. Ukupni polisaharidi rangirani kao: kuhani na vodenoj pari > kuhani na pari u vinu > miješano-obrađeni-s-crnim-grahom > obrađeni-sok-crnog graha > sirove kriške. Ukupni flavonoidi rangirani kao: prerađeni u soku od crnog graha > kuhani na vodenoj pari > miješani-prerađeni-s-crnim-grahom > kuhani u vinu > sirove kriške. U usporedbi sa sirovim kriškama, obrada soka crnog graha povećala je ukupne feniletanoidne glikozide, dok su ih druge metode obrade smanjile; sve četiri metode obrade značajno su povećale ukupne polisaharide i ukupne flavonoide. Između dvije metode crnog graha, obrada soka crnog graha proizvela je veća povećanja ukupnih feniletanoidnih glikozida i ukupnih flavonoida nego obrada crnog graha miješanjem, uz statističke razlike.

 

Tablica 8. Rezultati određivanja ukupnih feniletanoidnih glikozida, ukupnih polisaharida i ukupnih flavonoida uCistanche tubulosai njegove prerađene proizvode

Prerađeni proizvod (komadi uvarka)	Ukupni feniletanoidni glikozidi (%)	Ukupni polisaharidi (%)	Ukupni flavonoidi (%)
Sirove kriške	6.81 ± 0.06	5.85 ± 0.10	14.16 ± 0.24
Kriške kuhane u vinu	5.10 ± 0.05***	6.61 ± 0.05***	20.84 ± 0.33***
Kriške kuhane na vodenoj pari	5.23 ± 0.05***	6.70 ± 0.15***	21.59 ± 0.37***
Promiješano obrađeno ploškama crnog graha	3.80 ± 0.02***	6.56 ± 0.09***	21.02 ± 0.35***
Kriške prerađene sokom od crnog graha	7.07 ± 0.09****	6.09 ± 0.03****	24.26 ± 0.18****

Napomene: U usporedbi sa sirovim kriškama: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; u usporedbi s ploškama obrađenim miješanjem s crnim grahom: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Ehinakozid, akteozid, cistanozid A i izoakteozid ključni su feniletanoidni glikozidi koji doprinose tonificiranju bubrega i blagotvornom učinku esencijeCistanche tubulosa. HPLC usporedba ova četiri sastojka pokazala je da razlike u površini vrhova među uobičajenim vrhovima mogu poslužiti kao osnova za razlikovanje različitih prerađenih proizvoda. U usporedbi sa sirovim kriškama, ehinakozid, cistanozid A i izoakteozid porasli su u različitim stupnjevima u prerađenim proizvodima, s izraženijim porastom u proizvodima od soka od crnog graha. Akteozid se smanjio u tri prerađena proizvoda, ali se povećao u proizvodima obrađenim miješanjem s crnim grahom. To se može odnositi na inherentnu stabilnost akteozida: kao feniletanoidni diglikozid s kafeoilnim ostatkom, može se podvrgnuti cijepanju esterske veze pod promjenama temperature zagrijavanja, vremena i pH kako bi se stvorila kafeinska kiselina i djelomično izomerizirao u izoakteozid. Uočeno smanjenje akteozida i povećanje izoakteozida u četiri prerađena proizvoda može biti povezano s kuhanjem na pari na visokoj temperaturi, što je u skladu s obrascima prijavljenima za preradu Rehmanniae Radix [18].

Echinacoside se povećao nakon kuhanja vina/vode na pari i obrade crnog graha u ovoj studiji, što je suprotno Zhang Chao et al. [12]. Uspoređujući obradu miješanjem s crnim grahom i obradom sokom crnog graha, potonji je pokazao značajno viši sadržaj ehinakozida i cistanozida A i izraženiji trend konverzije iz akteozida u izoakteozid. Sve u svemu, ova studija otkriva promjene sastava i sadržaja nakon različitih metoda obrade i potvrđuje promjenu规律 između akteozida i izoakteozida. HPLC otisci prstiju pružaju znanstvenu metodu za identifikaciju sirovih narezaka i prerađenih proizvoda te nude referencu za uspostavljanje standarda kontrole kvalitete i za kvalitativne i kvantitativne analize.

 

Sukob interesa

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Autorski doprinosi

XU Xiaoqin: podrška projektu, dizajn studije, eksperimentalna determinacija i pisanje rukopisa;
QING Degang: cjelokupna koordinacija i prikupljanje medicinskih materijala;
ZHANG Juan i ZHAO Peng'an: određivanje sastavnica i analiza podataka;
WANG Guoping: provjera autentičnosti medicinskih materijala.

 

Tvornica uzoraka Cistanche:

https://www.xjcistanche.com/about-us

 

 

Reference

[1] Povjerenstvo za farmakopeju Ministarstva zdravstva Narodne Republike Kine.Farmakopeja Narodne Republike Kine[M]. Peking: Chemical Industry Press, 2025.
[2] Jia Xiaoguang, Ni Hui, Zhang Juan, et al. Status istraživanja i industrijskog razvojaCistanche tubulosa [J]. Časopis Medicinskog sveučilišta Xinjiang, 2012, 35(7): 876–880.
[3] Liu Yuewen. Napredak istraživanja feniletanoidnih glikozida uCistanche tubulosa [J]. Suvremeni poljoprivredni strojevi, 2020(11): 60–62.
[4] Tu Pengfei. Ponovno ispitivanje biljnih tekstualnih dokaza za Cistanches Herba [J].China Journal of Chinese Materia Medica, 2022, 47(20): 5670–5679.
[5] Zhu Su, Teng Shuo, Liu Chun.Puji Fang[M]. Peking: Narodna medicinska izdavačka kuća, 1959.
[6] Wang Huaiyin.Taiping Shenghui Fang[M]. Peking: Narodna medicinska izdavačka kuća, 1959.
[7] Tang Shenwei.Chongxiu Zhenghe Jingshi Zhenglei Beiyong Bencao[M]. Peking: Narodna medicinska izdavačka kuća, 1957.
[8] Zhang Yong, Wu Huan. Povijesni razvoj metoda obrade Cistanches Herba [J].China Journal of Chinese Materia Medica, 1992, 17(4): 213–214.
[9] Cai Hong, Bao Zhong, Jiang Yong. Tehnologija prerade za svježeCistanche tubulosa [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2007, 32(13): 1289–1291.
[10] Tie Xiaoyan, Feng Yinping, Ma Dongni. Učinak obrade na pari u području podrijetla na kvalitetu pustinjskih Cistanches Herba [J].Časopis tradicionalne kineske veterinarske medicine, 2021, 40(2): 54–56.
[11] Chen Weijun, Jia Cuiyu, Li Lianjiang. Učinci različitih metoda obrade na sadržaj betaina u XinjianguCistanche tubulosa [J]. Poljoprivredna meliorativna medicina, 2009, 31(5): 400–402.
[12] Zhang Chao, Hua Yue, Lian Jing, et al. Studija varijacija sadržaja 规律 feniletanoidnih glikozida tijekom obrade Cistanches Herba [J].Kineski časopis informacija o tradicionalnoj kineskoj medicini, 2022, 29(4): 92–97.
[13] Wu Chunxing, Yang Yang, Meng Mei, et al. Status istraživanja i analiza trendova TCM otiska prsta u proteklom desetljeću [J].Časopis Kineskog sveučilišta Minzu (izdanje prirodnih znanosti), 2024, 33(4): 63–72.
[14] Jiang Yong, Bao Zhong, Sun Yongqiang. Elaborat o tehnologiji prerade rezova Cistanches Herba [J].Kineski farmaceutski časopis, 2011, 46(14): 1074–1076.
[15] Zhang Leihong, Du Niansheng, Wang Qing. Određivanje feniletanoidnih glikozida u kapsulama ukupnog glikozida Cistanches Herba UV spektrofotometrijom [J].Časopis Medicinskog sveučilišta Xinjiang, 2002, 25(4): 407–408.
[16] Ailadan·Maimaiti Aili, Yang Ting, Yuan Jie. Proces ekstrakcije i in vitro antioksidacijska aktivnost polisaharida iz ostatakaCistanche tubulosa [J]. Tromjesečnik za kemijsko i biokemijsko inženjerstvo(prevedeno ime časopisa na kineskom), 2020., 37(2): 36–41.
[17] Luo Yan. Optimizacija procesa ekstrakcije ukupnih flavonoida izCistanche tubulosa[D]. Shihezi: Sveučilište Shihezi, 2015.
[18] Shan Guoshun, Zhao Qimiao, Li Rui, et al. Dinamičko istraživanje sadržaja akteozida tijekom obradeRehmannia glutinosa [J]. Azijsko-pacifička tradicionalna medicina, 2019, 15(3): 37–39.