Analiza komponenata arome i diferencijalnih metabolita u Cistanche Musalais na temelju GC-MS i metabolomike
Nov 28, 2025
Sažetak:Ovo je istraživanje pripremilo Cistanche Musalais tradicionalnim tehnikama s crvenim grožđem Xinjiang Hetian i različitim dodacima Cistanchea. Optimalni uvjeti obrade određeni su jednosmjernom ANOVA. GC-MS i neciljana metabolomika korišteni su za analizu komponenti arome i različitih metabolita, a kvantificirani su aktivni sastojci poput ukupnih flavonoida i ukupnih polifenola. Optimalni uvjeti bili su: početni sadržaj šećera 32 stupnja Bx, temperatura fermentacije 25 stupnjeva , te 7% dodatak Cistanche deserticola. Pod ovim uvjetima, sadržaj alkohola, ukupna kiselost, ukupni flavonoidi i ukupni polifenoli dosegnuli su (12,6 ± 0,6) % vol, (3,82 ± 0,19) g/L, (0,80 ± 0,01) g/L, odnosno (0,60 ± 0,00) g/L. GC-MS detektirao je 38 aromatskih spojeva, s najzastupljenijom klasom estera (24 spoja), zatim 6 alkohola, 2 ketona i 2 aldehida. U usporedbi s Musalaisom napravljenim isključivo od soka od grožđa, Cistanche deserticola Musalais pokazao je znatno više razine ključnih estera, uključujući etil acetat (6,42% u odnosu na . 2.42%) i etil palmitat (3,75% u odnosu na . 1.18%), dok su se viši alkoholi poput izobutanola značajno smanjili (2,11% u odnosu na . 3.98%). Metabolomika je identificirala 230 različitih metabolita (VIP veći od ili jednak 1, P < 0,05), obogaćenih putovima povezanim s ABC transporterima i biosintezom aminokiselina. Komponente poput trigonelina i krocina bile su značajno povišene. Metabolizam aminokiselina pridonio je stvaranju karakterističnog profila okusa. Ova studija pruža teorijsku i tehničku osnovu za razvoj i poboljšanje kvalitete Cistanche Musalais. Buduća bi istraživanja trebala uključiti molekularne senzorske tehnike, kao što je GC–O, kako bi se bolje identificirali ključni aktivni spojevi odgovorni za ukupni profil okusa.
Ključne riječi: Cistanche;Musalais; GC-MS; metabolomika
CistancheMusalais
Pojedinosti popisa Cistanche Musalais
Musalais (Msalais)je tradicionalno fermentirano piće jedinstveno za Xinjiang, proizvedeno od Awati crvenog grožđa ili Hetian (Hotan) crvenog grožđa. Dobiva se cijeđenjem soka, koncentriranjem i spontanom fermentacijom, a karakterizira ga kao primitivno, prirodno i zeleno. Kao jedinstveno kinesko prirodno fermentirano alkoholno piće, Musalais pokazuje različite regionalne karakteristike u senzornim svojstvima, nutritivnoj vrijednosti i funkcionalnim aktivnostima. Alkoholi, esteri, aldehidi, kiseline, fenoli i terpeni nastali tijekom fermentacije ne samo da daju jedinstveni okus, već su povezani i s dobrobitima kao što su poticanje cirkulacije krvi, snižavanje lipida u krvi, toniziranje bubrega i jačanje tijela, reguliranje kolesterola i održavanje kardiovaskularnog i cerebrovaskularnog zdravlja, što ga čini prikladnim za potrošače različite dobi [1].
Posljednjih godina, s rastućom potražnjom potrošača za zdravim pićima, tržište funkcionalnih alkoholnih pića brzo se proširilo. Na temelju tradicionalnog pivarstva, funkcionalna pića uključuju specifične funkcionalne komponente kako bi zadovoljile potrebe za dobrobit, održavanje zdravlja ili specifičnu fiziološku regulaciju. Na njihovu kvalitetu utječu sirovine, procesi, mikrobne zajednice i stabilnost funkcionalnih komponenti [2]. U narodnoj praksi južnog Xinjianga, lokalni dodaci kao što su goji bobice, šafranika, Cistanche i šafran često se dodaju tijekom pripreme Musalaisa kako bi se poboljšale zdravstvene dobrobiti i obogatila raznolikost okusa [3]. Među njima, Cistanche bogat polisaharidima, aminokiselinama, feniletanoidnim glikozidima, iridoidnim glikozidima i alkaloidima-ima tonične učinke na bubrežni yang, modulira neuroendokrinu funkciju i bori se protiv umora, zaradivši naziv "pustinjski ginseng" [4-5].
Međutim, industrijalizacija Cistanche Musalais trenutačno je suočena s izazovima uključujući nedostatak standarda proizvodnje, nepotpunu tehnologiju prerade i nedostatna istraživanja aromatičnih tvari, što ograničava njegovu promociju na tržištu i poboljšanje kvalitete. U ovoj studiji Cistanche je korišten kao dodatak za optimizaciju procesa fermentacije Musalais. GC-MS i neciljana metabolomika korišteni su za sustavno rješavanje sastojaka arome i različitih metabolita, s ciljem pružanja teorijske osnove i tehničke podrške za standardiziranu proizvodnju, modulaciju okusa i funkcionalno poboljšanje Cistanche Musalais, čime se promiče modernizacija i razvoj vrijednosti ovog tradicionalnog pića.
1 Materijali i metode
1.1 Materijali i reagensi
Cistanche tubulosa (cistanche tubulosa): prvorazredni komercijalni primjerci dobiveni iz Hetiana (Hotan), Xinjiang, punašne teksture i bez plijesni i nečistoća.
Crveno grožđe Hetian: komercijalno voće netaknutog izgleda i jake arome, porijeklom iz Hetiana, Xinjiang.
Metanol i acetonitril: Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
Mravlja kiselina: TCI (Shanghai) Development Co., Ltd.
L-2-klorofenilalanin: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Instrumenti i oprema
08-2T magnetska miješalica konstantne temperature, Shanghai Meiyingpu Instrument Co., Ltd.
57330-U SPME uređaj i 57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME vlakno, Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.
6890N-5973 GC–MS sustav, Agilent Technologies (China) Co., Ltd.
5430R rashladna centrifuga, Eppendorf (Shanghai) International Trading Co., Ltd.
TL-48R visokoučinkoviti mlin za tkivo, Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.
SCIENTZ-1LS vakuumski koncentrator, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.
Vanquish Flex UHPLC, Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
SDAJ-0.5 Linija za proizvodnju vina u kineskom stilu, Shandong Anji Bio-Fermentation Equipment Technology Co., Ltd.
1.3 Eksperimentalne metode
1.3.1 Tijek procesa
Cistanche se kuhao na pari za kasniju upotrebu. Crveno grožđe Hetian je oprano i odabrano, očišćeno od peteljki i zgnječeno. Sok od grožđa ekstrahiran je prešom, zatim zagrijavan i koncentriran kako bi se podesili pokazatelji koncentracije soka. Na kraju, proizvod Cistanche kuhan na pari pomiješan je s koncentriranim sokom od grožđa i fermentiran pod kontroliranim temperaturnim i vremenskim parametrima. Nakon fermentacije, proizvod je bistrio da se dobije Cistanche Musalais.
1.3.2 Priprema Cistanche
Uz manje izmjene Gong et al. [6], visokokvalitetna, nepokvarena sušena Cistanche je oguljena, narezana, zamotana u gazu i kuhana na pari 20 minuta za kasniju upotrebu.
1.3.3 Priprema soka od grožđa
Korišteno je crveno grožđe Hetian s početnom topljivom krutom tvari (šećer) od 18 stupnjeva Bx. Uklonjeno je trulo, pokvareno i neravnomjerno zrelo grožđe. Nakon pranja i guljenja grožđe je prešano. Sok je kuhan (koncentriran) na visokoj temperaturi i koncentracija je zaustavljena kada je šećer dosegao 26, 29 ili 32 stupnja Bx. Sok je ohlađen na sobnu temperaturu za kasniju upotrebu.
1.3.4 Proces fermentacije Cistanche Musalais
Cistanche kuhan na pari dodan je u definiranim omjerima (3%, 5%, 7%) u 600 mL koncentriranog soka od grožđa u fermentoru. Preostali šećer mjeren je svaka 24 sata tijekom fermentacije kako bi se pratio napredak. Kada je zaostali šećer pao na 4 g/L, fermentacija je prekinuta. Supernatant je sakupljen i pasteriziran na 85 stupnjeva 30 minuta da se dobije Cistanche Musalais.
1.3.5 Jednofaktorski eksperimentalni dizajn za Cistanche Musalais
Istraživani su učinci dodatka Cistanche (3%, 5%, 7%), početnog sadržaja šećera (26, 29, 32 stupnja Bx) i temperature fermentacije (22, 25, 28 stupnjeva ) na fizikalno-kemijska svojstva i bioaktivnost.
1.3.6 Analize i mjerenja
Sadržaj alkohola, topljive čvrste tvari i ukupna kiselost: određeno prema GB/T 15038-2006 "Opće analitičke metode za vino i voćna vina."
Ukupni flavonoidi: određeni u odnosu na Xu et al. [7]. Pripremljena je kalibracijska krivulja s koncentracijom rutina (X) kao apscisom i apsorbancijom (Y) na 510 nm kao ordinatom, dajući Y=0.8043X − 0,0278, R2=0.9999, što ukazuje na dobru linearnost.
Ukupni polifenoli: određeni metodom Folin–Ciocalteu [8]. Pripremljena je kalibracijska krivulja sa sadržajem galne kiseline (X) kao apscisom i apsorbancijom (Y) na 760 nm kao ordinatom, dajući Y=0.4177X + 0.1048, R2=0.9975, što ukazuje na dobru linearnost.
1.3.7 GC–MS analiza
Uzorci iz dvije skupine - eksperimentalne (32 stupnja Bx, 25 stupnjeva, 7% Cistanche) i kontrolne bez Cistanchea - podvrgnuti su GC-MS.
Predtretman uzorka: Uzorak je stavljen u bočicu za ekstrakciju od 20 mL; 100 µL 50 ug/mL izoamil fenilacetata je dodano kao interni standard. Bočica je zapečaćena i ekvilibrirana u vodenoj kupelji od 60 stupnjeva uz magnetsko miješanje pri 250 o/min tijekom 20 minuta. Zatim je umetnuto SPME vlakno za 30 min ekstrakcije. Prije upotrebe, SPME vlakno je kondicionirano na ulazu GC na 250 stupnjeva 20 minuta.
GC–MS uvjeti: HP-INNOWax kolona (60 m × 250 μm × 0,25 μm); ulaz 250 stupnjeva; prijenosna linija 250 stupnjeva; protok plina nosača 1,5 mL/min; podijeljeno 4:1. Program pećnice: 40 stupnjeva (5 min), povećanje 5 stupnjeva/min do 250 stupnjeva, držite 10 min. Izvor iona 230 stupnjeva; kvadrupol 150 stupnjeva ; EI 70 eV; full scan 35–550 Da.
1.3.8 Neciljana metabolomika
1.3.8.1 Priprema uzorka
Ispitane su dvije skupine: eksperimentalna (32 stupnja Bx, 25 stupnjeva , 7% Cistanche) i kontrolna bez Cistanchea; n=3 bioloških replika po skupini, ukupno 6 uzoraka. Nakon odmrzavanja i vorteksiranja, 300 μL svakog uzorka je prebačeno u epruvetu od 1,5 mL i centrifugirano na 12 000 o/min, 4 stupnja tijekom 15 minuta. Zatim je 100 μL supernatanta premješteno u epruvetu od 2 mL, brzo zamrznuto u tekućem dušiku i liofilizirano. Dodati 1 mL prethodno ohlađenog metanol:acetonitril (1:1, v/v), vrtložiti 30 s; zamrznuti na -20 stupnjeva 30 minuta; centrifuga na 12 000 okr/min, 4 stupnja 10 min; prikupiti 850 μL supernatanta i osušiti u vakuumu do kraja; rekonstituirati u 150 μL 50% metanola (s 5 ppm 2-klorfenilalanina), vrtložiti 30 s; centrifuga 12.000 o/min, 4 stupnja 10 min; filtrirajte kroz membranu od 0,22 μm i prenesite filtrat u bočice. Kombinirajte 10–20 μL iz svakog uzorka kako biste stvorili QC uzorak za procjenu stabilnosti instrumenta i pouzdanosti podataka; QC se izostavlja ako je uključeno manje od 5 uzoraka.
1.3.8.2 Analitički uvjeti
Kromatografija: ACQUITY UPLC HSS T3 kolona (100 Å, 1,8 μm, 2,1 mm × 100 mm); protok 0,4 mL/min; stupac 40 stupnjeva ; automatski uzorkivač 8 stupnjeva; injekcija 2 μL. Mobilna faza A: voda s 0,1% (v/v) mravlje kiseline; mobilna faza B: acetonitril s 0,1% (v/v) mravlje kiseline.
Masena spektrometrija: napon prskanja +3.5 kV/−3,0 kV; plaštni plin 40 arb; pomoćni plin 10 arb; kapilara 320 stupnjeva ; temperatura pomoćnog plina 300 stupnjeva; MS1 razlučivost 60 000; raspon skeniranja m/z 70–1.000; AGC ciljni standard; Max IT 100 ms; MS/MS ovisna o podacima na prva 4 iona s dinamičkim isključivanjem 4 s; MS2 rezolucija 15 000; HCD energija sudara 30%.
1.3.8.3 Identifikacija metabolita
Identifikacija metabolita temeljila se na PSNGM (PerSonalbio Next-Generation Metabolomics Database), koja se sastoji od interne knjižnice standarda, mzCloud (https://www.mzcloud.org/), LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/), HMDB (https://hmdb.ca/), MoNA (https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu/), NIST_2020_MSMS i MS/MS spektralna biblioteka predviđena umjetnom inteligencijom.
Napomena o vanjskim bazama podataka koje se koriste u komentaru:
HMDB: Sveobuhvatna baza podataka ljudskog metaboloma (verzija 5.0) koja sadrži detaljne kemijske, kliničke i biokemijske informacije za 220 945 metabolita, s opsežnim unakrsnim vezama s KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniProt i GenBank, te podržava napredna pretraživanja teksta/slijeda/strukture i MS/NMR spektra. Također povezan s DrugBank, T3DB, SMPDB i FooDB.
LIPID MAPS: An open-access lipidomics resource providing databases (e.g., LMSD with >50 000 odabranih lipidnih struktura), spektri, putovi, alati za MS analizu, crteži strukture i izvori nomenklature/klasifikacije.
mzCloud: Napredna spektralna knjižnica mase koja podržava spektre, strukturu, podstrukturu, stablo i pretraživanja temeljena na m/z, s 32 330 spojeva, 51 002 spektralna stabla i 16 531 567 spektara (sa značajnim dodacima u 2024.), optimizirana za pristup stolnom računalu Firefox/Chrome.
1.3.8.4 Multivarijantna statistička analiza
Multivarijantne analize primijenjene su na podatke metabolita iz 6 uzoraka kako bi se izvršio PCA, razjašnjavajući metaboličke razlike između Cistanche Musalais i Musalais. Diferencijalni metaboliti u skupinama pregledani su korištenjem OPLS-DA varijable važnosti u projekciji (VIP), promjene puta i P vrijednosti (VIP prag i značaj kao gore), nakon čega je uslijedila biološka interpretacija uključujući obogaćivanje KEGG puta [9].
Reference
[1] Zhu LX, Wang LL, Song HZ, et al. Kvalitativna analiza glavnih aroma spojeva povezanih s tradicionalnom obradom Musalais u Xinjiang Kini. Časopis Instituta za pivarstvo. 2012;118(2):236–242.
[2] Zhao B, Li DD, Yuan Y, et al. Suvremeni napredak u istraživanju fermentirane funkcionalne tekućine. Izrada alkoholnih pića. 2025;52(2):43–49.
[3] Zhu LX, Hou XJ, Xu Q. Rasprava o strategijama razvoja vina od grožđa Xinjiang Msalais. Znanost i tehnologija proizvodnje alkoholnih pića. 2008(7):111–113.
[4] Pjesma ZH, Lei L, Tu PF. Napredak u istraživanju farmakološke aktivnosti u biljkama Cistanche Hoffing. et Link. Kineske tradicionalne i biljne droge. 2003;34(9):U018.
[5] Shi TT, Ge WH. Razvoj istraživanja Cistanche Hoffmg. Et Link. Kineski časopis za etnomedicinu i etnofarmaciju. 2009;18(9):7–9.
[6] Gong X, Zhong T, Zhou JY, et al. Elaborat o tehnologiji novog fermentiranog vina Cistanche. Moderna hrana. 2019(5):64–68;79.
[7] Xu HT, Li H, Zhao YZ, et al. Antioksidativno i antibakterijsko djelovanje ukupnih flavonoida iz Nervilia fordii. Sjeverna hortikultura. 2017(16):161–165.
[8] Yu H, Xu X, Hao JX, et al. Mješovita fermentacija komine kore citrusa s Trichoderma koningii, Aspergillus oryzae i Lactobacillus casei: optimizacija procesa, antioksidativno djelovanje i neciljana metabolomska analiza. Bioznanost o hrani. 2025;66:106180.
[9] Zhou JN, Hou DH, Zou WQ, et al. Usporedba široko ciljane metabolomike i neciljane metabolomike divljeg Ophiocordyceps sinensis. Molekule. 2022;27(11):3645.
[10] Li XH. Istraživanje tehnologije Rosa kwangsiensis var. sterilis fermentirano vino [Magistarski rad]. Chongqing: Jugozapadno sveučilište; 2017.
[11] Li ZJ, Zhang XD, Long BX, et al. Istraživanje razvoja proizvoda i optimizacije površine odziva Msalais kruške. Prerada poljoprivrednih proizvoda. 2025;3:1–10.
[12] Zhang L, Jiang XF. Provjera prilagodljivosti metode određivanja bakra u općoj metodi analize vina i voćnih vina GB/T15038-2006. Proizvodnja alkoholnih pića. 2020;47(5):104–107.
[13] Zhong DL, Yang H, Wang Z, et al. Utjecaj temperature malolaktičke fermentacije na kvalitetu vina Cabernet Sauvignon. Zhejiang poljoprivredne znanosti. 2025;66(7):1724–1732.
