Sažetak

Cilj:Hipoglikemijsko-lipidno-regulirajuća formula (HLF) na bazi Cistanche pokazala je značajnu učinkovitost u poboljšanju poremećaja metabolizma glukoze i lipida. Međutim, njegovi specifični mehanizmi djelovanja ostaju nejasni. Ovo je istraživanje imalo za cilj istražiti potencijalne ciljeve i mehanizme HLF-a u poboljšanju metaboličkih poremećaja glukolipida kroz mrežnu farmakologiju, molekularno spajanje, simulacije molekularne dinamike (MD) i eksperimentalnu validaciju.

Metode:
Ciljevi povezani s metaboličkim poremećajima glukolipida preuzeti su iz baze podataka GeneCards. Ciljevi djelovanja glavnih aktivnih komponenti HLF-a dobiveni su iz baza podataka CTD i SwissTargetPrediction. Baza podataka STRING i softver Cytoscape korišteni su za konstrukciju mreža protein-protein interakcije (PPI). Nakon identificiranja potencijalnih ključnih meta, analize obogaćivanja Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) provedene su putem Metascape baze podataka, te je konstruirana mreža "compound-target-pathway". Molekularno spajanje provedeno je korištenjem AutoDocka i PyMOL-a za provjeru interakcija između glavnih komponenti i ključnih ciljeva. Zatim su izvedene MD simulacije na najboljim kompleksima protein-ligand identificiranim iz spajanja. Utvrđen je mišji model metaboličkog poremećaja glukolipidain vivovalidacija mrežnih farmakoloških nalaza.

Rezultati:
Topološka analiza PPI mreže identificirala je 10 ključnih ciljeva: TNF, CTNNB1, AKT1, NF-κB1, ESR1, FN1, TP53, IL-1, IL-6 i EGFR. GO obogaćivanje pokazalo je da su te mete uglavnom uključene u prijenos signala i regulaciju transkripcije. Analiza KEGG puta otkrila je značajnu povezanost s putevima lipida i ateroskleroze. Molekularno spajanje potvrdilo je povoljne afinitete vezanja između ključnih komponenti HLF-a (npr. lovastatina, koptizina, salvianolne kiseline B) i ciljeva kao što su AKT1, FN1 i IL-6. MD simulacije dodatno su pokazale stabilne interakcije, posebno između AKT1 i spojeva poput lovastatina, koptizina i salvianolne kiseline B. Eksperimenti na životinjama pokazali su da HLF može imati terapeutske učinke regulacijom naniže ekspresije AKT1, TP53, FN1 i EGFR, potiskivanjem čimbenika upale kao što su IL-1 i IL-6 i regulacijom CTNNB1 i ESR1. Ove promjene dovele su do poboljšanja razine glukoze u krvi i lipida u modelu miševa.

Zaključak:
HLF može regulirati metabolizam glukoze i lipida i poboljšati aterosklerotske lezije ciljanjem puteva povezanih s lipidima i aterosklerozom. Nudi sveobuhvatnu terapijsku strategiju za prevenciju i liječenje metaboličkih poremećaja i povezanih komplikacija.

Ključne riječi:
Formula na bazi Cistanche; Poremećaj metabolizma glukolipida; Mrežna farmakologija; Molekularno spajanje; Simulacija molekularne dinamike;Put lipida i ateroskleroze

 

 

 

ekstrakt cistanche acteoside sastojak za liječenje metaboličkih poremećaja glukolipida

saznajte više o prednostima cistanche, kontaktirajte nas

Kontaktirajte odmah

 

 

 

1. Uvod

Metabolički poremećaji glukolipida postali su istaknuti javnozdravstveni problem diljem svijeta. U 2021. globalna prevalencija dijabetesa dosegla je približno 529 milijuna, s projekcijama koje ukazuju na preko 1,31 milijardu slučajeva do 2050. U Kini, nedavne studije pokazuju prevalenciju dijabetesa od 12,4% u 2018., u odnosu na 10,9% u 2013. Dislipidemija je često komorbiditet s dijabetesom, značajno povećavajući rizik od kardiovaskularnih i cerebrovaskularnih događaja, smrtnosti i invaliditeta.

Epidemiološka istraživanja iz 20 tercijarnih bolnica u Kini pokazuju da 67,1% pacijenata s dijabetesom tipa 2 (T2DM) ima dislipidemiju. Studija CCMR-3B izvijestila je da je 72% bolesnika s T2DM također imalo dislipidemiju i/ili hipertenziju, što je udvostručilo njihov rizik od makrovaskularnih i mikrovaskularnih komplikacija u usporedbi s pacijentima koji imaju samo dijabetes.

Zbog složene patogeneze metaboličkih poremećaja glukolipida i niske stope postizanja sveobuhvatne metaboličke kontrole, djelotvorni tretmani su ograničeni. Formula za regulaciju hipoglikemije i lipida (HLF) koja se temelji na Cistancheu, razvijena prema teoriji "zamućenosti sluzi", ima za cilj ukloniti toplinu, ukloniti zamućenost i vratiti ravnotežu. Sastoji se od osam biljaka uključujućiCistanche, Momordica charantia, Aloe vera, Scutellaria baicalensis, Schisandra chinensis, Zingiber officinale, Salvia miltiorrhiza, iAtractylodes macrocephala, HLF cilja na temeljne mehanizme metaboličkih poremećaja.

Analiza otiska prsta pomoću HPLC-a identificirala je ključne spojeve:mangiferin, koptizin, jatrorizin, salvianolna kiselina B, aloin, berberin, palmatin,ilovastatin. Prethodne studije potvrdile su učinkovitost HLF-a u snižavanju razine glukoze i lipida, smanjenju kardiovaskularnog rizika i poboljšanju inzulinske rezistencije. Multicentrično, randomizirano, otvoreno kliničko ispitivanje koje je uključivalo 450 pacijenata s T2DM povezanim s pretilošću i dislipidemijom pokazalo je da HLF učinkovito smanjuje glukozu u krvi, regulira lipide, smanjuje tjelesnu težinu i poboljšava osjetljivost na inzulin.

Daljnja istraživanja pokazala su da HLF može modulirati crijevnu mikrobiotu (npr.Faecalibacterium, Blautia) i utječu na metaboličke putove poput razgradnje masnih kiselina i glikolize/glukoneogeneze. Unatoč dokazanoj kliničkoj učinkovitosti, točni mehanizmi ostaju nejasni, ograničavajući širu primjenu.

Mrežna farmakologija nudi pristup na razini sustava za razjašnjavanje mehanizama bolesti i djelovanja lijekova integracijom bioinformatike i probira visoke propusnosti. Ova studija koristi mrežnu farmakologiju, molekularno spajanje, molekularnu dinamiku i pokuse na životinjama kako bi otkrila višeciljane mehanizme HLF-a u liječenju metaboličkih poremećaja glukolipida.

2. Materijali i metode

2.1 Instrumenti

D3024R rashladna centrifuga velike brzine (SCILOGEX)

Y300C aparat za elektroforezu i JY300C spremnik za elektroforezu (Junyi Oriental, Peking)

Sustav za snimanje ChampGel 5000 (Saizhi Innovation, Peking)

SMA-1000 spektrofotometar (Meilin Hengtong, Peking)

StepOne Plus qRT-PCR sustav (ABI)

PowerPac univerzalna jedinica za elektroforezu (Bio-Rad)

PB-10 pH metar (Sartorius)

Kemiluminiscencijski analizator Tanon 5200 (Tanon, Šangaj)

2.2 Biljni lijekovi

HLF formula uključuje:

Cistanche (Cistanches Herba)

Momordica charantia

Scutellaria baicalensis

Aloe vera

Schisandra chinensis

Zingiber officinale

Salvia miltiorrhiza

Atractylodes macrocephala
Sve su biljke bile granulirane formule ekstrakata (Tianjiang Pharmaceutical, Jiangyin).

Kontrolni lijek:Metformin hidrokloridtablete (0,5 g po tableti, Bristol-Myers Squibb, Šangaj).

2.3 Reagensi i antitijela

TRIzol reagens (Invitrogen)

HiFiScript cDNA Synthesis Kit (CW2569)

UltraSYBR mješavina (High ROX, CW2602)

Komplet za analizu BCA proteina

Primarna protutijela usmjerena na p-AKT, p-NF-κB p65, AKT, NF-κB p65, FN1, p53, IL-1, IL-6, EGFR, TNF-, -katenin, ESR1, -aktin

Sekundarna antitijela (HRP-konjugirani kozji anti-zečji/mišji IgG)

2.4 Životinjski modeli

Kupljeni su mužjaci C57BL/6J miševa (stari 7 tjedana) i držani pod standardnim SPF uvjetima. Sve postupke na životinjama odobrilo je Etičko povjerenstvo bolnice Guang'anmen (br. odobrenja IACUC-GAMH-2019-002).

2.5 Predviđanje cilja

Upitivani su aktivni spojevi iz HLF-aCTDiSwissTargetPrediction(vjerojatnost > 0,1). Ciljevi povezani s bolešću za T2DM i dislipidemiju preuzeti su izGeneCards(ocjena relevantnosti > 1). Vennovi dijagrami identificirali su preklapajuće ciljeve za daljnju PPI analizu.

2.6 Izgradnja PPI mreže

Uneseni su ciljevi koji se preklapajuNIZ(https://www.string-db.org), sa srednjom pouzdanošću (rezultat veći ili jednak 0,4). Mreža je vizualizirana i analizirana uCytoscape, i temeljne ciljeve identificirane prema stupnju centralnosti.

2.7 GO i KEGG obogaćivanje

Podneseni su ključni ciljeviMetascapeza analizu GO (BP, MF, CC) i KEGG puta (P < 0,01). Vizualizacija je napravljena korištenjem dijagrama s mjehurićima.

2.8 Mreža putanja spoj-cilj

Cytoscape je korišten za izgradnju mreže koja povezuje biljke, spojeve, ciljeve i putove, ilustrirajući interakcije s više ciljeva i putova.

2.9 Molekularno spajanje

2D strukture spojeva dobivene su izPubChem, pretvoren u PDB pomoćuOtvori Babel. Proteinske strukture preuzete su sRCSB PDB, pripremljen uAutoDockTools, i spojen pomoćuSailVina. Afinitet vezanja Manji ili jednak -4,25 kcal/mol smatrao se značajnim. Rezultati spajanja vizualizirani su sPyMOL.

2.10 Simulacija molekularne dinamike

MD simulacije su izvedene pomoćuAmber18za odabrane vrhunske komplekse. Protein: amber14SB; ligand: gaff; water: OPC model. RMSD i RMSF izračunati su iz NPT simulacija od 20 ns.

2.11 Grupiranje životinja i intervencija

Miševi su randomizirani u 4 skupine: normalni (N), model (M), metformin (MET) i HLF. Osim skupine N, svi miševi su hranjeni hranom bogatom mastima (HFD) tijekom 6 tjedana. HLF je primijenjen u dozi od 14 g/kg (ekvivalent sirove biljke), MET u dozi od 250 mg/kg. Nakon 8 tjedana intervencije, krv i jetreno tkivo su prikupljeni za analizu.

2.12 qRT-PCR

Ukupna RNA ekstrahirana je pomoću TRIzola. cDNA je sintetizirana pomoću HiFiScripta. qPCR je proveden pomoću UltraSYBR-a i StepOne Plus. Relativni izraz je izračunat preko 2^−ΔΔCt.

2.13 Western Blot

Proteini su ekstrahirani iz tkiva jetre, kvantificirani, odvojeni pomoću SDS-PAGE i prebačeni na PVDF membrane. Nakon blokiranja i inkubacije s primarnim i sekundarnim protutijelima, signali su vizualizirani ECL-om i kvantificirani pomoću ImageJ. -aktina je korišten za normalizaciju.

2.14 Statistička analiza

Podaci su analizirani pomoćuSPSS 23.0iGraphPad Prism 10.1.2. Korišteni su jednosmjerna ANOVA i t-testovi, pri čemu se P < 0,05 smatra statistički značajnim.