Antimelanogena svojstva Velutina i njegovih analoga

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Se-Hui Jung 1,‡, Hee-Young Heo 1,‡, Jung-Won Choe 1, Jaehyun Kim 1 i Kooyeon Lee 1,2,*

Sažetak:Velutin, jedan od flavona sadržanih u prirodnim biljkama, ima različita korisna djelovanja, poput izbjeljivanja kože, kao i protuupalno, antialergijsko, antioksidativno i antimikrobno djelovanje. Međutim, odnos između struktureželatinua njegovo djelovanje protiv melanogeneze još nije istraženo. U ovoj smo studiji kemijskom sintezom dobili 12 derivata želatine supstituiranih na C5, C7, C30 i C40 flavonske okosnice s vodikovim, hidroksilnim i metoksi funkcionalnim skupinama, kako bismo izvršili SAR analizu velutinoznih strukturnih analoga. Studija SAR otkrila je da supstitucija funkcionalnih skupina na C5, C7, C30 i C40 okosnice flavona utječe na biološke aktivnosti povezane sa sintezom melanina. Koegzistencija hidroksila i metoksi na položajima C5 i C7 ključna je za inhibiciju aktivnosti tirozinaze. Međutim, spojevi 1,2-diola supstituirani na C30 i C40 kostura flavona induciraju apoptozu stanica melanoma. Nadalje, supstitucija na C30 i C40 s metoksi ili vodikom bitna je za inhibiciju melanogeneze. Stoga bi ova studija bila od pomoći za razvoj funkcionalnih materijala prirodnog podrijetla za regulaciju sinteze melanina.

Ključne riječi: derivati ​​želatine; sinteza melanina; aktivnost tirozinaze; SAR studija

koristi desert cistanche: inhibira sintezu melanina

1. Uvod

Flavoni, tip flavonoida koji se sastoji od dva fenilna prstena i benzopiranske funkcionalnosti, široko su prisutni u prirodnim biljkama, uključujući povrće i voće [1]. U mnogim spojevima, flavonske skele se smatraju važnim središnjim strukturama koje djeluju na različite ciljne molekule putem jednostavnih modifikacija. Konkretno, poznato je da derivati ​​flavona s metaboličkom ili sintetskom modifikacijom imaju protuupalno, antiestrogeno, antialergijsko, antioksidativno, antimikrobno, antitumorsko i antiproliferacijsko djelovanje [2-4]. Nadalje, jednostavna zamjena flavonske okosnice funkcionalnim grupe kao što su hidroksil i metoksi rezultiraju vrlo različitim biološkim aktivnostima. Zbog širokih bioloških aktivnosti flavona, njihov odnos strukture i aktivnosti (SAR) privukao je interes u području medicinske kemije, što je pomoglo u otkrivanju nekih olovnih spojeva za ublažavanje brojnih bolesti. Na primjer, prethodna SAR studija otkrila je da se, kako se povećavao broj hidroksilnih skupina, povećavao učinak flavona na uklanjanje radikala [5].

Melanin je prirodni pigment koji je uključen u određivanje boje kože, očiju i kose te ima važnu ulogu u zaštiti kože od oštećenja štetnim svjetlom, kao što su ultraljubičaste zrake [6-8]. Unatoč svojim korisnim učincima, abnormalna regulacija sinteze melanina odgovorna je za pigmentne poremećaje koji uključuju albinizam, vitiligo, melazmu, pjege i lentigo [9,10]. Melanin se sintetizira u melanocitima, koji su specijalizirane stanice smještene u bazalnom sloju epidermisa, kroz višestupanjske katalitičke reakcije enzima kao što su tirozinaza, protein 1 povezan s tirozinazom i protein 2 povezan s tirozinazom [9,11]. Tirozinaza igra ključnu ulogu u dvije reakcije sinteze melanina koje ograničavaju brzinu, hidroksilacijom L-tirozina u L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) i oksidacijom L-DOPA u dopakinon [12]. Stoga su proučavani različiti regulatori aktivnosti tirozinaze za liječenje pigmentnih poremećaja [13]. Reagensi za izbjeljivanje koji se temelje na inhibiciji tirozinaze, kao što su hidrokinon, azelaična kiselina, arbutin i kojična kiselina, navodno sprječavaju hiperpigmentaciju kože [11,14]. Međutim, zbog svoje stanične toksičnosti, niske učinkovitosti i niske stabilnosti u prisutnosti kisika i vode, sastojci za izbjeljivanje iz prirodnih proizvoda smatraju se u području istraživanja i razvoja kozmetike alternativnom strategijom za sprječavanje hiperpigmentacije.

Velutinous pripada klasi flavonoida koji imaju hidroksilne, metoksi, metoksi i hidroksilne skupine naC5', C7', C3' i C4'flavonske okosnice (Slika 1). Vrednovanje se nalazi u pulpi acai voća i poznato je da pokazuje protuupalno i antioksidativno djelovanje [15,16]. Nadalje, velutin dobiven deglikozilacijom homo-flavoya-dorinina B u ekstraktu imele ima inhibitorni učinak na tirozinazu i melanogenezu [8]. Međutim, odnos između strukturne modifikacije velutinousa i njegovih aktivnosti protiv tirozinaze i antimelanogeneze još nije istražen.

U ovoj studiji pripremili smo 12 derivata želatine supstitucijom na C5', C7', C3' i C4' flavonske okosnice s vodikovim, hidroksilnim i metoksi funkcionalnim skupinama, kako bismo izvršili SAR analizu vrednovanja strukturnih analoga. Svih 12 derivata procijenjeno je na njihovu inhibitorsku aktivnost protiv aktivnosti tirozinaze i melanogeneze. Otkrili smo da je koegzistencija metoksi skupine na položaju C7 i hidroksilnih skupina na položajima C5 i C40 u kosturu flavona ključna za inhibicijsko djelovanje. Osim toga, 1,2-diol se formira s hidroksilnim skupinama na položajima C30 i C40 apoptoze inducirane flavonom u stanicama melanoma. Stoga bi ova otkrića bila od pomoći za istraživanje učinka derivata flavona na biosintezu melanina i za razvoj novih kemijskih lijekova za suzbijanje sinteze melanina.

za što se koristi cistanche: potiskuje sintezu melanina.

2. Rezultati i rasprava

2.1. Kemijska sinteza derivata Velutina

Kako bi se razumio odnos između strukturne modifikacije okosnice vrednovanja i njegovih bioloških aktivnosti, jedanaest derivata želatine (V1–V12, osim V11) kemijski je sintetizirano iz 2-derivata hidroksi acetofenona i derivata aromatskih aldehida, putem konvencionalnih pet koraka metode [17]. Tri velutinozna derivata, V1 (velutinozni), V5 i V8, sintetizirana su putem reakcije u sedam koraka, kao što je prikazano u shemi 1. Prvo, za sintetiziranje 1-(2-(benziloksi)-6- hidroksi-4-metoksifenil)etan-1-on (V1e), bis-MOM-zaštićeni acetofenon (V1b) sintetiziran je iz komercijalno dostupnog 20, 40, 60-trihidroksi acetofenona (V1a), podvrgnut uklanjanju zaštite reakcija, naknadna sinteza benziliranog acetofenona (V1c) i selektivna supstitucija metoksi skupine na C4 položaju 1-(2-(benziloksi)-4,6-dihidroksi fenil)etana -1-jedan (V1d) je izveden. Zatim su derivati ​​V1, V5 i V8 sintetizirani naknadnom aldolkondenzacijom, oksidativnom ciklizacijom i redukcijom iz modificiranog acetofenona (V1e).

V2 i V3 su sintetizirani putem sljedećih reakcija, kao što je prikazano u Shemi 2; O-alkilacija na R2 i R1 komercijalno dostupna dva dihidroksi acetofenon spoja, aldolna kondenzacija, oksidativna ciklizacija i deprotekcija.

Shema 1. Sinteza V1, V5 i V8 derivata.

Četiri derivata, uključujući V4, V6, V9 i V10, sintetizirana su naknadnim reakcijama, kao što je prikazano u Shemi 3; O-alkilacija na C4 i C6 komercijalno dostupnog 2', 4', 6'-trihidroksi acetofenon spoja (V1a), aldolna kondenzacija, oksidativna ciklizacija i deprotekcija.

Derivat V7 sintetiziran je sljedećim reakcijama, kao što je prikazano u Shemi 4; benzilna zaštita na C4 i C6 komercijalno dostupnih 2', 4', 6'-trihidroksi acetofenon spojeva (V1a), aldolna kondenzacija, oksidativna ciklizacija i redukcija.

Derivat V12 sintetiziran je reakcijom u dva koraka, kao što je prethodno objavljeno [18]; aldolna kondenzacija dvaju komercijalno dostupnih 2'-hidroksi acetofenona i benzaldehida i oksidacijska ciklizacija.

Shema 2. Sinteza V2 i V3 derivata.

2.2. Karakterizacija sintetskih derivata velutina

2.2.1. Sinteza Velutina (V1)

(V1): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (12,97 (s, 1H), 10,01 (br, s, 1H), (7,61-7,59) (m, 2H), (6,96-6,94) (m , 2H), 6,80 (d, J=1.52 Hz, 1H), 6,37 (d, J=2.08 Hz, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,88 (s, 3H )).

2.2.2. Sinteza 2-(4-Hidroksi-3-metoksifenil)-7-metoksi-4H-kromen-4-ona (V2)

(V2): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 (9,88 (s, 1H), 7,92 (d, J=8,84 Hz, 1H), (7,61-7,58) (m, 2H) , 7,32 (d, J=2,36 Hz, 1H), 7,05 (dd, J1=8,80 Hz, J2=2,40 Hz, 1H), (6,95-6,93) (m, IH), 6,89 (s, IH), 3,92 (s, 3H), 3,91 (s, 3H)).

2.2.3. Sinteza 5-Hidroksi-2-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-4H-kromen-4-ona (V3)

(V3): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 (12,85 (s, 1H), (7,69-7,62) (m, 3H), 7,21 (d,J=8.36 Hz, 1H) 7,07 (s, IH), 6,96 (d, J=8, 16 Hz, IH), 6,81 (d, J=8, 16 Hz, 1 H), 3,91 (s, 3H)).

2.2.4. Sinteza Genkwanina (V4)

(V4): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 (12,96 (s, 1H), (7,97-7,95) (m, 2H), (6,95-6,92) (m, 2H), 6,85 (s, 1H) ), 6,77 (d, J=2.24 Hz, IH), 6.38 (d, J=2.28 Hz, IH), 3.87 (s, 3H)).

2.2.5. Sinteza 5-Hidroksi-7-metoksi-2-(3-metoksifenil)-4H-kromen-4-ona (V5)

(V5): 'H NMR (400 MHz, CDC13) 5 (12,71 (s, 1H), (7,45-7,39) (m, 3H), (7,10-7,07) (m, 1H), 6,65 (s, 1H), 6,50 (d, J=2.28 Hz, IH), 6.38 (d, J=2.24 Hz, IH), 3.90 (s, 3H), 3.89 (s, 3H)).

2.2.6. Sinteza 2-(4-Hidroksi-3-metoksifenil)-5,7-dimetoksi-4H-kromen-4-ona (V6)

(V6): 'H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 (7,53-7,52) (m, 2H), (6,93-686) (m, 1H), 686 (d, J=2.24 Hz, 1H), 6,49 (d, J=2.20 Hz, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,89 (s, 3H), 3,83 (s , 3H)).

2.2.7. Sinteza hrizoeriola (V7)

(V7): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 (12,97 (s, 1H), (7,57-7,55) (m, 1H), 6,93 (d,J=8,92 Hz, 1H) 6,88 (s, IH), 6,47 (d, J=1, 87 Hz, IH), 6,16 (d, J=1, 91 Hz, 1 H), 3,89 (s, 3H)).

2.2.8. Sinteza 2-(3,4-dihidroksifenil)-5-hidroksi-7-metoksi-4H-kromen-4-ona (V8)

(V8): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 (12,99 (br, s, 1H), (7,47-7,44) (m, 2H), 6,90 (d,J=8.21 Hz, 1H), (6,74-6,73) (m, 2H), 6,38 (d, J=2, 24 Hz, 1H), 3,88 (s, 3H)).

2.2.9. Sinteza 2-(3,4-dimetoksifenil)-5-hidroksi-7-metoksi-4H-kromen-4-ona (V9)

(V9): 'H NMR (400 MHz, CDC13) 8 (12,80 (s, 1H), 7,53 (dd, J1=8.48 Hz, J2=2.12 Hz, 1H), 7.34 ( d, J=2.08 Hz, 1H), 6.98 (d, J=8.54 Hz, 1H), 6.50 (d, J=2.24 Hz, 1H), 6.37 (d, J=2. 22 Hz, IH), 3,98 (s, 3H), 3,97 (s, 3H), 3,89 (s, 3H)).

2.2.10. Sinteza 2-(3,4-dimetoksifenil)-5,7-dimetoksi-4H-kromen-4-ona (V10)

(V10): 'H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 (7,64 (dd, J1=8.48 Hz, J2=2.16 Hz, 1H), 7.53 (d, J {{ 14}}.12, 1H), 7,11 (d, J=8.62, 1H), 6,87 (d, J=2.30, 1H), 6,77 (s, 1H), 6,50 ( d, J=2.30, IH), 3,91 (s, 3H), 3,88 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 3,83 (s, 3H)).

2.2.11. 2-Fenilkromen-4-on (V12)

(V12): 1H NMR (400 MHz, CDC13) δ (8,24 (dd, 1H, J1=1,66 Hz, J2=7,94 Hz), (7,96-7,93) (m, 2H ), (7,73-7,69) (m, 1H), (7,59-7,57) (m, 1H), (7,56-7,53) (m, 3H), 7,45-7,41 (m, 1H), 6,84 (s, 1H) ).

Tablica 1. Supstitucijska skupina i ukupni prinos sintetiziranih velutinoznih derivata.

2.3. Učinak derivata Velutina na aktivnost uklanjanja radikala ABTS

Aktivnost hvatanja ABTS radikala dvanaest derivata želatine ili arbutina (pozitivna kontrola) je zatim procijenjena u rasponu koncentracija 50-200 µM, a tablica 2 navodi njihove vrijednosti polumaksimalne efektivne koncentracije (EC50). Većina derivata, osim V10, pokazala je aktivnost hvatanja radikala ovisnu o dozi (podaci nisu prikazani), s EC50 vrijednostima u rasponu (5,47–100,13) µM (Tablica 2). Konkretno, spojevi V8 i V11 (luteolin) sa strukturom tipa 1,2-diola pokazali su bolju aktivnost hvatanja radikala od ostalih derivata. Nasuprot tome, V10 ili V12 spojevi supstituirani s metoksi ili vodikovom skupinom na C5', C7', C3' i C40 okosnice, nisu imali značajan učinak na aktivnost hvatanja radikala. Ovi rezultati pokazuju da je prisutnost hidroksilne skupine na okosnici vrednovanja kritična za njegovu aktivnost hvatanja radikala. Nadalje, povećanje broja metoksi funkcionalnosti na C5', C7', C3' i C40 okosnice smanjilo je aktivnost uklanjanja ABTSradikala.

Tablica 2. Inhibicijski učinak velutinskih derivata na hvatanje radikala ABTS i aktivnosti tirozinaze gljiva.

2.4. Učinak derivata velutina na inhibitornu aktivnost tirozinaze gljiva

Da bi se dalje razumio učinak elektrostatskog potencijala derivata na njihovu inhibitornu aktivnost protiv tirozinaze, procijenjen je inhibitorni učinak dvanaest derivata želatine na tirozinazu gljiva. Pet derivata želatine V1, V4, V8, V9 i V11 imalo je potencijalnu inhibitornu aktivnost protiv tirozinaze gljiva, s IC50 vrijednostima u rasponu 37-910 µM, ali ostalih sedam derivata želatine V2, V3, V5, V6, V9, V10 i V12 nije imao značajan učinak (tablica 2). Ovi rezultati pokazuju da je broj hidroksilnih skupina na C5', C7', C3' i C40 kostura flavona važan čimbenik za njihovu inhibitornu aktivnost protiv tirozinaze. Konkretno, spoj V11 pokazao je najnižu vrijednost IC50 u dvanaest derivata, dok V10 i V12 nisu imali značajan učinak na aktivnost tirozinaze, što sugerira da postojanje hidroksilne skupine, a ne metoksi ili vodikove skupine, na C5', C7', C3', a C40 flavonske okosnice bio je važniji za njegov učinak protiv tirozinaze. Nadalje, hidroksilne i metoksi funkcionalne skupine na R1 i R2 položajima mogu igrati važnu ulogu u inhibiciji tirozinaze.

2.5. Citotoksičnost derivata Velutina u stanicama melanoma

Citotoksičnost je zabrinjavajuća za svaki potencijalni spoj, pa smo nakon tretiranja stanica derivatima kvantitativno izmjerili citotoksičnost jedanaest derivata želatine koji su mogli inhibirati melanogenezu, osim za V12, koji nije imao potencijal inhibirati melanogenezu kroz MTT test. Devet derivata, isključujući V8, V10 i V11, nije imalo značajan učinak na vitalnost stanica pri koncentracijama do 20 µM (podaci nisu prikazani). Međutim, liječenje s V8, V10 i V11 izazvalo je staničnu smrt na način ovisan o koncentraciji, sa stopama smrti od 71,8, 24,0 odnosno 69,7 posto, pri 20 µM (Slika 2). Ovaj rezultat ukazuje da je 1,2-diolni oblik s hidroksilnim skupinama na C30 i C40 položajima flavona inducirao apoptozu u stanicama melanoma, što je bilo u skladu s prethodnim izvješćem koje objašnjava citotoksičnost flavonoidnih derivata u 1,2- diolni oblici, kao što su katehin i epikatehin [19].

Slika 2. Citotoksičnost derivata želatine u stanicama melanoma B16F10.

2.6. Učinak derivata velutina na melanogenezu u stanicama melanoma

Zatim su utvrđeni učinci devet derivata želatine, isključujući V8 i V11, koji imaju citotoksičnost, na melanogenezu stimuliranu -melanocit-stimulirajućim hormonom (-MSH) u stanicama melanoma. Tretman s –MSH stimulirao je 1.9-struko povećanje sadržaja melanina u stanicama melanoma (Slika 3A). Otkrili smo da je –MSH-stimulirana melanogeneza bila potpuno inhibirana V1 i V2 (p < {{10}}.{{20}}01),="" a="" djelomično="" inhibirana="" v3="" (50.7="" posto,="" p="">< 0.005),="" v4="" (69,1="" posto,="" p="">< 0,001)="" i="" v5="" (39,3="" posto,="" p="">< 0,005),="" dok="" melanogeneza="" stimulirana="" –msh="" nije="" značajno="" promijenjena="" pomoću="" v7,="" v9="" i="" v10="" (slika="" 3a).="" iznenađujuće,="" derivat="" v6="" značajno="" je="" povećao="" sintezu="" melanina="" za="" 3.0-puta="" (p="">< 0,001).="" ovi="" rezultati="" sugeriraju="" da="" derivati="" ​​želatine="" sa="" sličnim="" strukturama,="" ali="" različitim="" supstitucijskim="" skupinama="" imaju="" različitu="" biološku="" aktivnost="" na="" melanogenezu.="" nadalje,="" utvrđene="" su="" inhibicijske="" aktivnosti="" devet="" derivata="" želatine="" na="" –msh-posredovanu="" unutarstaničnu="" aktivaciju="" tirozinaze,="" budući="" da="" ovaj="" enzim="" igra="" ključnu="" ulogu="" u="" melanogenezi="" .="" tretman="" s="" –msh="" inducirao="" je="" približno="" 1.7-struku="" aktivaciju="" tirozinaze="" u="" stanicama="" b16f10="" (slika="" 3b).="" četiri="" derivata="" v1="" (87="" posto,="" p="">< 0,001),="" v3="" (97="" posto,="" p="">< 0,001),="" v4="" (100="" posto,="" p="">< 0,001)="" i="" v5="" (80="" posto,="" p="">< 0,001)="" preokrenuli="" su="" aktivaciju="" tirozinaze="" posredovanu="" –msh,="" dok="" četiri="" druga="" derivata="" v2,="" v7,="" v9="" i="" v10="" nisu="" (slika="" 3b).="" ovi="" rezultati="" pokazuju="" da="" su="" četiri="" derivata="" v1,="" v3,="" v4="" i="" v5="" inhibirali="" –msh-induciranu="" sintezu="" melanina,="" inhibicijom="" unutarstanične="" aktivnosti="" tirozinaze="" u="" stanicama="">

2.7. In Silico Molecular Docking simulacija inhibicije enzima

Kako bi se predvidjela interakcija između velutinoznih derivata i tirozinaze, provedena je studija silikomolekularnog spajanja pomoću softvera Maestro. Studija molekularnog spajanja otkrila je da se derivati ​​V9 i V10, visoko supstituirani metoksi skupinama, nisu vezali na enzim (Tablica 3); ovaj je rezultat bio u skladu s našim rezultatima dobivenim iz in vitro eksperimenta. Nadalje, većina derivata flavona, osim V9 i V10, stupa u interakciju s tirozinazom s energijama vezanja u rasponu od -4,983 do -5,677 kcal/mol (Tablica 3). Dva derivata, V1 i V4, pokazala su inhibitornu aktivnost protiv aktivnosti tirozinaze u stanicama melanoma, s rezultatima spajanja od -5,043 odnosno -5,136 kcal/mol. Stabilizirani su π–π slaganjem s Phe 264 (A i C prsten) i His 259 (B prsten), te interakciju π–kationa s Arg 268 (A prsten), kao što je prikazano na slici 4. Dva derivata koji su bili visoko supstituirani s hidroksilnim skupinama, V7 i V11, formirali su vodikove veze s enzimom i pokazali relativno visoko spajanje rezultati od -5,174 i -5,677 kcal/mol, redom. Ovaj je rezultat bio u skladu s našim rezultatima, pokazujući relativno niske vrijednosti IC50 u odnosu na aktivnost tirozinaze dobivene in vitro eksperimentom. Međutim, V7 nije imao učinak na melanogenezu i aktivnost tirozinaze u stanicama melanoma, dok je V11 pokazao citotoksičnost u stanicama melanoma.

cistanche phelypaes

3. Eksperimentalni dio

3.1. Kemija

Komercijalno dostupni reagensi korišteni su bez dodatnog pročišćavanja. Sve reakcijske smjese su magnetski miješane i praćene tankoslojnom kromatografijom, koristeći staklene ploče prethodno obložene silika gelom, vizualizirane UV svjetlom, a zatim su razvijene pomoću joda ili otopine anisaldehida. Brza kromatografija na stupcu provedena je pomoću silika gela ((230-400) mesh). 'H NMR (400 MHz) i spektri su snimljeni NMR spektrometrijom. Deuterirani kloroform korišten je kao otapalo, a vrijednosti kemijskog pomaka (δ) navedene su u dijelovima na milijun, u odnosu na rezidualne signale ovog otapala [δ 7,26 za 1H (kloroform-d), δ 2,50 za 1H (dimetil sulfoksid-d)] .

3.2. Materijali

Reagensi kao što su 2,20-cink bis(3-etil benzotiazolin-6-sulfonska kiselina (ABTS) i 3-(4,5-dimetiltiazol-2- yl)-2,5-difeniltetrazolij bromid (MTT), hormon koji stimulira melanocite (a–MSH) i enzimi, kao što je tirozinaza gljiva, dobiveni su od Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, SAD).Kalijev persulfat (K2S2O8), pirokatehol violet i 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA) kupljeni su od Alfa Aesara (Haverhill, MA, SAD).

3.3. Određivanje ABTS aktivnosti hvatanja slobodnih radikala

Kako bi se procijenila antioksidativna aktivnost derivata vrednovanja, određena je aktivnost hvatanja radikala ABTS, kao što je prethodno opisano [20]. Da bi se proizveo ABTSradikal, 10 mL 7 mM ABTS pomiješano je sa 176 µL 140 mM kalijevog peroksid-disulfateina dH2O i inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi (RT) 16 h, prije upotrebe. Otopina ABTS radikala je razrijeđena apsolutnim metanolom, da se dobije apsorbancija od blizu 0,7 na 734 nm. Alikvoti od 100 µL svakog derivata u navedenom koncentracijskom rasponu od 2 do 200 µM dodani su u 100 µL razrijeđene otopine ABTS radikala i inkubirani 10 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Apsorbancija je zatim izmjerena na 732 nm pomoću SpectraMaxM5 Multi-Mode čitača mikropločica (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, SAD). Aktivnost uklanjanja radikala ABTS izračunata je na sljedeći način:

ABTS aktivnost hvatanja radikala ( postoci )=1 − (A uzorak/A kontrola) × 100 (1)

3.4. In vitro inhibicija tirozinaze gljiva

Inhibicijski učinak derivata želatine na aktivnost tirozinaze procijenjen je količinom dopakroma sintetiziranog iz katalitičke reakcije tirozinaze [8,21]. Ukratko, 50 µL derivata želatine u rasponu koncentracija od 0.01–1 mM pomiješano je s 50 µL od 50 U/mL tirozinaze gljiva, u 50 mM fosfatno puferirane fiziološke otopine (PBS; 8,1 mMNa2HPO4, 1,2 mM KH2P04, pH 6,8, 2,7 mM KCl, 138 mM NaCl) u 96-ploči s jažicom, i inkubirano 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je u svaku jažicu dodano 100 µL 0,4 mM L-tirozina, nakon čega je uslijedila inkubacija dodatnih 10 minuta na 37 ◦C. Apsorbancija dobivene otopine izmjerena je na 475 nm, pomoću čitača mikropločica SpectraMax M5 Multi-Mode.

3.5. Kultura stanica

Stanice mišjeg melanoma B16F10 uzgajane su u mediju DMEM (Gibco, Gaithersburg, SAD) s dodatkom 10 posto toplinski inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (Gibco), 100 jedinica/mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina (Gibco), na 37 ◦C pod ovlaženo 5 posto CO2.

3.6. Preživljavanje stanica

Viabilnost stanica B16F10 određena je pomoću MTT testa, kao što je prethodno opisano [22]. Ukratko, B16F10 stanice su nasađene u 24-pločice s jažicom u gustoći od 1 × 104 stanica po jažici. Nakon 24 sata, stanice su tretirane naznačenim koncentracijama velutinskih derivata tijekom 48 sati. Stanice su zatim inkubirane s MTT otopinom 4 sata, a reducirani kristali formazana otopljeni su u DMSO. Dobivena otopina je prebačena u 96-ploče s jažicama, a apsorbancija je izmjerena na 540 nm, upotrebom čitača mikropločica SpectraMax M5Multi-Mode.

3.7. Određivanje sadržaja melanina

Sadržaj melanina je određen kao što je prethodno opisano, uz neke modifikacije [23]. Stanice melanoma uzgajane su u 6-ploči s jažicama 24 sata. Tretirane su s navedenim koncentracijama velutinoznih derivata daljnjih 48 sati, u prisutnosti 100 nM –MSH. Nakon dva puta ispiranja ohlađenim Dulbeccovim fosfatnim puferiranim slanim otopinama dopunjenim kalcijevim kloridom i magnezijevim kloridom (D-PBS, Gibco), dobivene stanice su odvojene inkubacijom s otopinom tripsina-EDTA. Nakon centrifugiranja na 1000 okretaja u minuti tijekom 3 minute, talog stanica je otopljen u 150 µL 1 M NaOH koji je sadržavao 10 posto DMSO tijekom 1 sata na 60 ◦C. Sadržaj melanina određen je apsorbancijom na 405 nm, pomoću čitača mikropločica.

3.8. Određivanje aktivnosti stanične tirozinaze u stanicama melanoma

Aktivnost tirozinaze u stanicama B16 ispitivana je na temelju količine dopakroma proizvedenog katalitičkom reakcijom unutarstanične tirozinaze [24]. Ukratko, melanomske stanice su uzgajane u 6-ploči s jažicama tijekom 24 sata, nakon čega je uslijedio tretman različitim koncentracijama velutinoznih derivata daljnjih 48 sati, u prisutnosti 100 nM –MSH. Nakon dva puta ispiranja s ledeno hladnim D-PBS-om, stanice su lizirane u 200 µL pufera za radioimunoprecipitacijski test (RIPA) (Sigma-Aldrich), koji sadrži inhibitore proteaze i fosfataze. Nakon centrifugiranja staničnog lizata sakupljenog iz svake jažice na 15,{11}}× g tijekom 15 minuta, 100 µL supernatanta pomiješano je sa 100 µL 1 mM L-DOPA u PBS-u (pH 6,8), nakon čega je uslijedila inkubacija 30 minuta na 37 ◦C. Apsorpcija dopakroma je izmjerena na 475 nm pomoću čitača mikropločica. Podaci su normalizirani s koncentracijom proteina, određenom analizom bicinhoninske kiseline.

3.9. Molekularno modeliranje

Kristalna struktura tirozinaze gljive za molekularno modeliranje bila je tirozinaza Agaricus (PDB radi: 2Y9X) dobivena iz Banke podataka o proteinima (PDB). Enzim je pripremljen pomoću tijeka rada za pripremu proteina čarobnjaka ugrađenog u program Maestro (Maestro, verzija 11.9.011, Schrödinger, LLC, New York, NY, SAD, 2019.). Voda i sve ostale molekule prisutne u PDB datotekama su uklonjene. Moleculardocking je izveden pomoću protokola Induced Fit Docking (IFD) (Schrödinger Suite2019 Induced Fit Docking protocol), kao što je ranije objavljeno [25].

3.10. Statistička analiza

Svi podaci u ovoj studiji izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD) iz tri neovisna eksperimenta. Statističke analize provedene su korištenjem Graph-PadPrism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, SAD). Razlike između srednjih vrijednosti kontrolne i izložene skupine analizirane su jednosmjernom analizom varijance (ANOVA). Vrijednost p < 0.05="" smatra="" se="" statistički="">

za što se koristi cistanche: izbjeljivanje kože

4. Zaključci

U ovom smo istraživanju kemijskom sintezom dobili dvanaest derivata želatine i usporedno analizirali odnos između kemijske strukture ovih derivata i njihove aktivnosti vezane uz sintezu melanina. Studija SAR otkrila je da je supstitucija funkcionalnih skupina na C5', C7', C3' i C40 okosnice flavona utjecala na biološke aktivnosti povezane sa sintezom melanina (Slika 5). Koegzistencija hidroksila i metoksi na R1 odnosno R2 bila je bitna za inhibiciju aktivnosti tirozina. Međutim, spojevi 1,2-diola supstituirani na R3 i R4 inducirali su apoptozu stanica melanoma. Nadalje, supstitucija na R3 i R4 s metoksi ili vodikom bila je bitna za inhibiciju melanogeneze. Ova bi studija bila od pomoći za razvoj funkcionalnih materijala prirodnog podrijetla za regulaciju sinteze melanina.

cistanche dodatak