Ciklopentanon djeluje protiv melanogeneze i bora kod B16F10 melanoma

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2, Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 i Hyung Ryong Moon 1, 2,*

Sažetak:Izloženost ultraljubičastom (UV) zračenju primarni je uzrok vanjskog starenja kože, što rezultira hiperpigmentacijom kože i borama. U ovoj smo studiji istraživali učinak izbjeljivanja (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanona (BHCP) na B16F10 melanom i njegove anti- aktivnost bora na stanicama fibroblasta Hs27. Utvrđeno je da BHCP snažno inhibira tirozinazu, s 50 postotnom koncentracijom inhibicije (IC50) vrijednostima od 1,10 μM i 8,18 μM formikofenolata (L-tirozin) i difenolaze (L-DOPA), a studija kinetike enzima otkrila je da je BHCP kompetitivni inhibitor tirozinaze . Nadalje, BHCP je značajno inhibirao sadržaj melanina i aktivnost stanične tirozinaze i smanjio razine transkripcijskog faktora povezanog s mikroftalmijom (MITF), fosforilirane razine proteina vezanja elementa odgovora cAMP (CREB) i tirozinaze u hormonu koji stimulira melanocite (-MSH). Stanice melanoma B16F10. Štoviše, BHCP je inhibirao fosforilaciju p65 i ekspresiju matričnih metaloproteinaza (MMP-1, MMP-9, MMP-12 i MMP-13) u Hs27 fibroblastima stimulirano UV zračenjem. Stoga naši rezultati pokazuju da bi BHCP mogao biti dobar kandidat za razvoj terapeutskih sredstava za bolesti povezane s hiperpigmentacijom i borama.

Ključne riječi: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanon (BHCP); inhibitor tirozinaze; anti-melanogeneza; protiv bora

Cistanche jeprotiv bora.

1. Uvod

Starenje kože složen je i progresivan proces koji dovodi do funkcionalnih i estetskih promjena na koži, pri čemu su odgovorni i intrinzični i ekstrinzični čimbenici [1]. Ekstrinzično starenje kože uzrokovano je agresorima iz okoliša, poput ultraljubičastog (UV) zračenja, stresa ili pušenja. Međutim, to je uglavnom uzrokovano ponavljanim izlaganjem UV zračenju od sunca, što se naziva fotostarenje. Fotostarenje kože karakteriziraju grube i duboke bore, debljina, hrapavost, dispigmentacija i histološke promjene [2-4].

Tirozinaza (EC 1.14.18.1), koja je također poznata kao polifenol oksidaza, jedan je od višenamjenskih enzima koji sadrže bakar uključenih u sintezu melanina i široko se nalazi u prirodi [5]. Tirozinaza je tipično prisutna u većini mikroorganizama, biljaka, i životinje. U biljkama tirozinaza djeluje oksidacijom monofenola u difenole (aktivnost mikofenolata) i uključena je u oksidaciju o-difenola u o-kinone (aktivnost difenolaze), nakon čega slijedi oksidacija kinona u tamnosmeđe pigmente [6].

Melanogeneza je transformacija L-tirozina u 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), pri čemu se L-DOPA pretvara u DOPA kinin [7]. Stoga tirozinaza igra važnu ulogu u proizvodnji melanina u melanocitima, a inhibicija tirozinaze je atraktivna meta za poboljšanje poremećaja povezanih s pigmentacijom i za razvoj sredstava za izbjeljivanje [8,9]. Sintezu melanina inducira nekoliko podražaja, kao što su UV zračenje i kemikalije uključujući izobutilmetilksantin (IBMX) i hormon koji stimulira alfa-melanocite (-MSH). -MSH se veže za svoj receptor melanokortin 1 receptor (MC1R), posljedično povećavajući razinu citoplazmatskog cikličkog AMP(cAMP). Povećana razina cAMP aktivira protein kinazu A (PKA), koja inducira ekspresiju transkripcijskog faktora povezanog s mikroftalmijom (MITF) putem fosforilacije proteina koji veže odgovorni element cAMP (CREB). MITF inducira ekspresiju tirozinaze, proteina povezanog s tirozinazom (TRP) -1 i TRP-2, što konačno rezultira povećanom sintezom melanina [10]. MITF se smatra ključnim transkripcijskim faktorom melanogeneze; stoga su provedena mnoga istraživanja za kontrolu ekspresije MITF-a radi inhibicije melanogeneze [11].

Poznato je da je stvaranje bora usko povezano s degradacijom izvanstaničnog matriksa kože, a UV zračenje aktivira nuklearni faktor-κB (NF-κB), čime se povećava proizvodnja fragmentacije kolagena i matričnih metaloproteinaza (MMP) [2]. MMP su endopeptidaze ovisne o cinku koje su važne u remodeliranju strukture izvanstaničnog matriksa u koži. Stoga je prekomjerna razgradnja kolagena i matriksa UV-induciranim MMP-ima karakteristična značajka fotooštećene kože, a MMP-i se koriste kao glavni marker UV-induciranog fotostarenja, kao i upale kože [12].

Diarilheptanoidni kosturni derivati ​​slični kurkuminu uključuju antioksidanse, prijavljene antikancerogene aktivnosti.skelete, uključujući (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanon (BHCP) (Slika 1),pokazati širok raspon protuupalnih, antimelanogeneza, posebno, Leow et al. [19] prijavljeni u bioaktivnostima, i anti-tirozinaza [13-18]dibenziliden-ciklopentanonu 2014. koji bi mogli pridonijeti zaštitnim učincima na ljudski osteosarkom putem regulacije Wnt/-catenin signalnog puta. Međutim, djelovanje BHCP-a protiv melanogeneze i bora tek treba otkriti, a molekularni mehanizmi na kojima se temelji njegovo djelovanje još nisu jasno utvrđeni.

Slika 1. Struktura (2E,5E)-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanona (BHCP).

U ovoj smo studiji istraživali antimelanogenezu i potencijal BHCP-a protiv bora i nastojali smo identificirati uključeni mehanizam, posebno s obzirom na sadržaj melanina i aktivnost stanične tirozinaze, koji su istraženi korištenjem testa inhibicije tirozinaze i analize kinetike enzima. Štoviše, pokazali smo da BHCP ima inhibicijski učinak na melanogenezu i bore koji je povezan s niskom regulacijom CREB/MITF/tirozinaze u -MSH-induciranim B16F10 mišjim melanomskim stanicama i inhibicijom fosforilacije p65 i MMP ekspresije u UV-induciranim Hs27 ljudskim fibroblastima.

zmajevo bilje cistanche

2. Rezultati i rasprava

2.1. Sinteza (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanona (BHCP)

Otopina {{0}}hidroksi-4-metoksibenzaldehida (100 mg, 0.66 mmol, izovanilin) ​​i ciklopentanona (0,03 mL, 0,33 mmol) u 1 N otopini HCl-octene kiseline (0,02 mL) miješa se 2 h pri 25 ◦C. Nakon što je stajala 1 dan, reakcijska smjesa je obrađena hladnom vodom u prisutnosti male količine metanola, filtrirana i isprana hladnom vodom kako bi se proizveo BHCP (65,9 mg) u prinosu od 56,9 posto. BHCP je identificiran spektroskopskim metodama, uključujući 1H i 13C-NMR, kao i usporedbom s objavljenim spektralnim podacima i analizom tankoslojne kromatografije (TLC) [19]. Struktura je prikazana na slici 1.

BHCP: žuti amorfni prah (CHCl3); 'H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) 8: 9,25 (s, 2H, 2 x OH), 7,28 (s, 2H, 2 x vinilH), 7,14 (d, 2H , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7.11 (dd, 2H, J=8.5, 2.0 Hz, 2×6- H), 7,01 (d, 2H, J=8.5 Hz, 2 × 5- H), 3,81 (s, 6H, 2 × OMe), 3,01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 8: 195,5, 149,9, 147,2, 136,0, 133,1, 129,1, 124,3, 117,5, 112,8, 56,3, 26,6; ESI-MS: m/z 351 (M-H)-.

2.2. Inhibicijski učinak BHCP-a na aktivnost tirozinaze gljiva

Kao što je prikazano u Tablici 1, BHCP je inhibirao tirozinazu s IC50 vrijednostima od 1,10 ± 0,12 μM i 8,18 ± 0,44 μM, dok je kojična kiselina (pozitivna kontrola) imala IC50 vrijednosti od 18,68 ± 1,40 μM i 33,89 ± 1,16 μM za monofenolazu, odnosno difenolazu. U našoj prethodnoj studiji sintetskih potencijalnih inhibitora tirozinaze, kroz studije molekularnog modeliranja pronašli smo mehanizam prema kojem su 3-hidroksi i 4-metoksi skupine benzilidena imale velike tendencije vezanja prema aktivnom mjestu tirozinaze [20]. Iz rezultata ove studije pokazalo se da su njegove funkcionalne skupine (3-hidroksi i 4-metoksi skupine) povezane sa značajnim povećanjem inhibitorne aktivnosti tirozinaze.

Tablica 1. Inhibicijska aktivnost tirozinaze i enzimska kinetička analiza BHCP.

Nadalje, mehanizam odgovoran za inhibiciju tirozinaze pomoću BHCP-a ispitan je enzimskom kinetičkom analizom u ovoj studiji (tablica 1 i slika 2). Lineweaver-Burk dijagrami su nacrtani koristeći podatke dobivene iz kinetičkih studija, a konstanta inhibicije (Ki) je dobivena iz Dixon dijagrama. Lineweaver–Burk dvostruki recipročni dijagrami ukazivali su na inhibiciju kompetitivnog tipa. Kao što je prikazano na slikama 2a–c, BHCP je djelovao kao kompetitivni inhibitor i L-tirozina i L-DOPA-e. Štoviše, presjeci na x-osi Dixon dijagrama obično su koristi se za određivanje tipova konstanti inhibicije enzima (Ki) za kompleks enzim-inhibitor [21,22], gdje vrijednost x-osi označava vrijednost −Ki. Kao što je prikazano na slici 2b–d, Ki vrijednosti BHCP bile su 1,7 μM i 10,5 μM kao supstrati za L-tirozin, odnosno L-DOPA. Budući da Ki vrijednost predstavlja koncentraciju potrebnu za stvaranje kompleksa enzim-inhibitor, niža Ki vrijednost sugerira učinkovitiju inhibiciju protiv tirozinaze.

Slika 2. Lineweaver-Burk (a,c) i Dixon (b,d) dijagrami za inhibiciju enzima tirozinaze BHCP-om.

2.3. Učinci BHCP-a na vitalnost stanica melanoma B16F10 i fibroblastnih stanica Hs27

Prije utvrđivanja je li BHCP pokazao ikakve aktivnosti protiv melanogeneze i bora, ispitali smo citotoksičnost BHCP-a na stanice B16F10 i Hs27 stanice tretiranjem različitim koncentracijama BHCP-a u različitim vremenskim intervalima, a održivost stanica izmjerena je EZ-Cytox testom. Kao što je prikazano na slici 3a,b, do 10 µM BHCP tijekom 48 sati nije smanjilo preživljavanje niti stanica B16F10 niti stanica Hs27. Potom su provedena daljnja in vitro ispitivanja djelovanja BHCP-a protiv melanogeneze i bora s 1, 5 i 10 μM.

2.4. Inhibicija BHCP-a protiv sadržaja melanina i aktivnosti stanične tirozinaze u stanicama melanoma B16F10

Kako bi se utvrdilo ima li BHCP inhibicijski potencijal na sadržaj melanina u -MSH-induciranim B16F10 stanicama, stanice su prethodno tretirane naznačenim različitim koncentracijama (1, 5 i 10 μM) BHCP-a ili kojične kiseline (5 mM) tijekom 24 sata i zatim stimulirane s -MSH 48 h. Kao što je prikazano na slici 4a, sadržaj melanina u stanicama tretiranim BHCP-om u prisutnosti -MSH smanjio se na način ovisan o koncentraciji, pokazujući 113 posto pri 1 μM, 106 posto pri 5 μM i 102 posto pri 10 μM, u usporedbi s kontrolna skupina tretirana samo s -MSH (186 posto). Zanimljivo je da je BHCP (1 μM) jače inhibirao sadržaj melanina nego kojična kiselina (5 mM). Nadalje, proveden je test aktivnosti stanične tirozinaze da se izmjeri inhibitorni učinak BHCP na B16F10 stanice. Kao što je prikazano na slici 4b, BHCP se smanjio na način ovisan o koncentraciji s aktivnošću tirozinaze za 120 posto pri 1 μM, 116 posto pri 5 μM i 105 posto pri 10 μM, u usporedbi s kontrolnom skupinom liječenom samo s -MSH (181 postotak). Inhibicijski učinak BHCP-a bio je mnogo snažniji od učinka kojične kiseline; inhibicija BHCP na 1 µM bila je bolja od one kojične kiseline na 5 mM (131 posto). Ovi rezultati sugeriraju da BHCP ima učinak izbjeljivanja inhibicijom biosinteze melanina i unutarstanične sinteze tirozinaze u melanocitima B16F10.

Slika 4. Inhibicija sadržaja melanina (a) i aktivnosti stanične tirozinaze (b) BHCP na stanicama melanoma B16F10.

2.5. Učinci BHCP-a na ekspresiju MITF/tirozinaze i fosforiliranog CREB-a u stanicama B16F10

MITF, specifični faktor transkripcije, igra ključnu ulogu u učinkovitoj aktivaciji melanogenih gena, uključujući tirozinazu, katalizirajući korak koji ograničava brzinu u biosintezi melanina: TRP-1 i TRP-2. Ekspresija MITF-a mogla bi biti povećana fosforilacijom CREB-a [23]. CREB je važan promotor MITF-a [24,25], a fosforilacija CREB-a u melanocitima povećava ekspresiju MITF-a vezanjem na CREB (c-AMP response element-binding protein) u melanocitima [26]. Kako bismo razjasnili molekularne putove odgovorne za antimelanogeni učinak BHCP-a na stanice B16F10, ispitivali smo razine proteina ključnih molekula, uključujući CREB i MITF, koje igraju važnu ulogu u melanogenezi pomoću Western blot analize. Stanice su tretirane s BHCP ili kojičnom kiselinom i zatim stimulirane s -MSH 48 h. Vremenski interval za mjerenja slijedio je metodologiju opisanu u prethodnim studijama [27]. Kao što je prikazano na slici 5, razine tirozinaze i MITF porasle su s -MSH, ali BHCP je smanjio razine tih proteina. Nadalje, BHCP je značajno potisnuo fosforilaciju CREB-a. Poznato je da je regulacija fosforilacije CREB izazvane -MSH potencijalno važna u regulaciji pigmentacije [28]. Ovi rezultati pokazuju da su antimelanogeni učinci BHCP-a rezultat snižene regulacije MITF-a i tirozinaze putem snižene regulacije fosforiliranog CREB-a. Ova studija sugerira da je razjašnjavanje mehanizma inhibicije BHCP-a na tirozinazu i melanogenezu ključno i da se mora dodatno istražiti u budućnosti. Iako je stanična linija B16F10 melanoma općenito prikladnija za istraživanje signalnih mehanizama in vitro, stanična linija B16F10 pripada melanomu glodavaca. Stoga će biti potrebna daljnja istraživanja na ljudskim melanocitima kako bi se potvrdili nalazi.

2.6. Učinak BHCP na UV-induciranu NF-κB p-p65 aktivaciju u Hs27 stanicama

Zatim smo istražili učinak BHCP-a na UV-induciranu ekspresiju upalnih medijatora koristeći Hs27 fibroblaste. Ranije je objavljeno da je fosforilacija p65 (Ser536) bitna za njegovu sposobnost transaktivacije gena [29]. Stoga su razine proteina p-p65 (Ser536) i p65 ispitivane u frakciji jezgre Western blotom. Kao što je prikazano na slici 6a,b, u stanicama Hs27, UV je povećao razinu proteina p-p65 (Ser536) u jezgri, dok je liječenje BHCP-om smanjilo razinu proteina p-p65 (Ser536) jezgre. U skladu s tim, ukupna količina p65 smanjena je u citoplazmi UV-om i vraćena BHCP-om (Slika 6c,d). Iako su razine ekspresije proteina p65 smanjene u citoplazmi i povećane u jezgri nakon UV indukcije, prethodni tretman s BHCP-om preokrenuo je te trendove na način ovisan o dozi. Prema tome, ovi rezultati sugeriraju da bi inhibicija p-p65 od strane BHCP mogla doprinijeti zaštitnim učincima na pigmentaciju kože i uništavanje kolagena od UV zračenja.

Slika 6. Učinci BHCP na razine ekspresije p-p65 (Ser536) u UV-induciranim Hs27 humanim fibroblastnim stanicama.

2.7. Učinak BHCP na ekspresiju MMP u Hs27 stanicama

MMP igraju vitalnu ulogu u starenju kože. UV zračenje mijenja vezivna tkiva kože pojačavajući ekspresiju MMP [30,31]. MMP-1 je enzim za razgradnju kolagena koji ubrzava razgradnju kolagena sintetiziranog iz prokolagena tipa I. MMP-9 je enzim za razgradnju želatine koji razgrađuje kolagenska vlakna presječena MMP-1, povećavajući stvaranje bora i gubitak elastičnosti. Kako bismo ispitali učinak BHCP-a protiv bora protiv UV indukcije, odredili smo razine proteina MMP-1 i MMP-9 metodom Western blotting. Nadalje, stanice inducirane UV zračenjem pokazale su značajno povišenu razinu MMP-13, koji pokreće razgradnju kolagena tipa I i III umjesto MMP-1 [32]. Istraživali smo povećanje MMP (MMP1, MMP9, MMP12 i MMP13) nakon tretmana UV-induciranih Hs27 stanica s BHCP od 1 i 10 μM. Kao što je prikazano na slici 7, razine ekspresije MMP-1, MMP-9, MMP-12 i MMP-13 porasle su nakon UV indukcije; međutim, liječenje BHCP-om smanjilo je ekspresiju u dozi -ovisni način. Naši rezultati sugeriraju da bi BHCP mogao doprinijeti prevenciji stvaranja bora smanjenjem abnormalne proizvodnje MMP-a uzrokovane izlaganjem UV zračenju. Ovi rezultati upućuju na to da BHCP inhibira ekspresiju MMP u fibroblastima Hs27 kako bi spriječio razgradnju kolagena, a time i stvaranje bora. Stoga BHCP pokazuje potencijal za upotrebu kao lijek za prevenciju i liječenje bolesti povezanih s kožom.

dobrobiti stabljike cistanche

3. Materijal i metode

3.1. Kemikalije i instrumentacija

Tirozinaza gljiva (EC 1.14.18.1), -MSH, L-tirozin, 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), dimetil sulfoksid (DMSO) i kojična kiselina kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Dulbeccov modificirani Eagleov medij (DMEM), fetalni goveđi serum, streptomicin i amfotericin kupljeni su od Gibco Life Technologies Inc. (Carlsbad, CA, SAD). Antitijela protiv MITF,CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, tirozinaza, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB , i -actin su kupljeni od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, SAD). Membrane od poliviniliden difluorida (PVDF) nabavljene su od Millipore Corporation (Bedford, MA, SAD). Sterilno plastično posuđe za kulture tkiva kupljeno je od SPL Labware (Seul, Koreja). Izvor UV svjetla osigurala je jedinica Crosslinker 800 serije (UVP, CA, SAD) od 6 lampi (8 vata po lampi). Tankoslojna kromatografija i silika gel 60 (mesh 230-400) izvedeni su na silika geluF{{27} } prethodno premazane ploče iz Merck Millipore (Darmstadt, Njemačka). NMR spektri su snimljeni korištenjem instrumenata Varian Unity INOVA 400 (400 MHz za 1H, 100 MHz za 13C) i Varian Unity AS 500 (500 MHz za 1H). Vrijednosti kemijskog pomaka (δ) navedene su u odnosu na dotične vrhove zaostalog otapala ili deuteriranog (δH 2,50 i δC 39,51 za DMSO). Podaci masene spektrometrije niske rezolucije dobiveni su Expression CMS masenim spektrometrom (Advion, Ithaca, NY, SAD).

3.2. Test inhibicije tirozinaze gljiva

Inhibicijska aktivnost tirozinaze gljiva određena je korištenjem L-tirozina i L-DOPA kao supstrata, na temelju postupka koji su opisali Jung et al. [23]. Ukratko, dodano je 190 μL enzima tirozinaze (1000 U razrijeđenih s puferom tirozinaze gljive, uključujući 1 mM L-tirozina i L-DOPA otopine), u prisutnosti ili odsutnosti spojeva (konačna koncentracija u rasponu od 1 do 20 μM, otopljenih u 100 posto DMSO), u svaku jažicu 96-ploče s jažicama, kako bi se dobio konačni volumen od 200 μL. Ploča je inkubirana na 37 ◦C 30 minuta. Aktivnost tirozinaze kvantificirana je mjerenjem apsorbancije na 492 nm pomoću čitača mikropločica (TECAN, Salzburg, Austrija), a postotak inhibicije (postotak) dobiven je iz sljedeće jednadžbe:

postotak inhibicije=(Ac − As)/Ac × 100 (1)

gdje je Ac apsorbancija kontrole, a As apsorbancija uzorka. Vrijednosti IC50 izračunate su iz log-linearnih krivulja i njihovih jednadžbi. Prikazani su prosječni rezultati za tri određivanja. Kojična kiselina korištena je kao pozitivna kontrola.

3.3. Kinetička analiza inhibicije tirozinaze

Za određivanje kinetičkih mehanizama komplementarno su korištene dvije kinetičke metode (Lineweaver–Burk i Dixon plots) [21,22,33]. Za dvostruke recipročne krivulje Lineweaver–Burk (grafikon 1/brzina enzima (1/V) u odnosu na 1/koncentracija supstrata (1/[S])), tip inhibicije je određen korištenjem različitih koncentracija L-tirozina (1, 2, i 4 mM) i L-DOPA (0.5, 1 i 2 mM) kao supstrati u prisutnosti različitih koncentracija BHCP. Koncentracije BHCP bile su sljedeće: 0, 0.5, 1.{{20}} i 2.0 μM za L-tirozin; i 0, 2,5, 5 i 10 μM za L-DOPA. Dixonov dijagram je grafička metoda (grafikon 1/brzina enzima (1/V) u odnosu na koncentraciju inhibitora (I)) za određivanje tipa inhibicije enzima i korišten je za određivanje konstante disocijacije ili Ki za kompleks enzim-inhibitor. Dixonovi dijagrami (pojedinačni recipročni dijagrami) inhibicije dobiveni su u prisutnosti supstrata L-tirozina pri 1, 2 i 4 mM i {{40}}, 0.5, 1.{ {47}} i 2.0 μM za BHCP; i L-DOPAsupstrat na {{50}}.5, 1.0 i 2,0 mM i 0, 2,5, 5,0 i 10,0 μM za BHCP.

biljka cistančaje inhibitor tirozinaze.

3.4. Stanične linije i kultura stanica

Mišje stanice melanoma B16F10 dobivene su iz Korejske banke staničnih linija. Stanična linija fibroblasta ljudske kože Hs27 kupljena je od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Ove su stanice održavane u DMEM-u s dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma, 100 U/mL penicilina i 100 mg/mL streptomicina u ovlaženom 5 postotnom CO2 inkubatoru na 37 ◦C. Dermalni fibroblasti na posudi od 100 mm tretirani su BHCP-om i izloženi 50 mJ/cm2UV u DMEM-u bez seruma (izvor UV svjetla, UVP). Stanice Hs27 uzgajane su do 70-80 posto konfluencije u ploči promjera 100 mm i korištene su između pasaža 5 i 15.

3.5. Ispitivanje vitalnosti stanica

Vijabilnost stanica procijenjena je korištenjem EZ-Cytox kit testa. Ukratko, stanice B16F10 i fibroblasti Hs27 nasađeni su u 96-ploču s jažicom gustoćom od 1 × 104 stanica/jažici i inkubirani na 37 ◦C tijekom 24 sata. Stanice su hranjene svježim DMEM-om bez seruma koji je sadržavao različite koncentracije (0, 1, 2, 5 i 10 μM) BHCP-a i inkubirane su 24 i 48 h. Potom je u svaku jažicu stavljeno 10 µL otopine EZ-Cytoxa i stanice su inkubirane 2-4 h. Mjerenje apsorbancije stanica u odsutnosti bilo kakvog tretmana smatralo se 100-postotnim preživljavanjem stanica. Svaki tretman je izveden u tri primjerka i svaki eksperiment je ponovljen tri puta.

3.6. Određivanje sadržaja melanina

Učinak BHCP-a na -MSH-induciranu melanogenezu u stanicama B16F10 temeljio se na prethodno korištenoj metodi s malim modifikacijama [34]. Ukratko, stanice B16F10 (5 × 104 stanica/jažici) u 6-pločama s jažicama ostavljene su da rastu do 70-80 posto konfluencije. Stanice su zatim tretirane različitim koncentracijama BHCP (1, 5 i 10 μM) ili kojične kiseline (5 mM) tijekom 24 sata, a zatim stimulirane s -MSH (5 μM) tijekom 48 sati. Nakon tretmana, stanice su isprane dva puta s ledeno hladnim PBS-om, otopljenim u 90 μL 1 M otopine NaOH uključujući DMSO (5 posto) na 60 ◦C tijekom 1 sata, a apsorbancija je izmjerena na 405 nm spektrofotometrom za mikroploču (TECAN, Salzburg , Austrija). Za mjerenje količine melanina u eksperimentu, stopa inhibicije u tretiranim skupinama izračunata je iz apsorbancije poznatih koncentracija sintetskog melanina, koje su korigirane na ukupnu količinu proteina koji je bio prisutan u supernatantu staničnih lizata. Apsorpcija netretiranih stanica mjerena je tri puta.

3.7. Ispitivanje aktivnosti stanične tirozinaze

Određivanje aktivnosti stanične tirozinaze provedeno je mjerenjem brzine oksidacije L-DOPA [35]. B16F10 stanice pri gustoći od 5 × 104/stanici stavljene su u 6-jažice i inkubirane preko noći. Stanice su zatim tretirane različitim koncentracijama BHCP (1, 5 i 10 μM) ili kojične kiseline (5 mM) tijekom 24 sata, a zatim stimulirane s -MSH (5 μM) tijekom 48 sati. Stanice su isprane PBS-om i lizirane u otopini koja je sadržavala 100 μL 50 mM fosfatnog pufera (pH 6,5), 0,1 mM fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) i 1 posto Tritona X-100. Zatim su stanice stavljene u uređaj za duboko zamrzavanje (-80 ◦C) na 30 minuta. Nakon odmrzavanja stanica, stanični ekstrakti su pročišćeni centrifugiranjem na 12,000 okretaja u minuti tijekom 30 minuta na 4 ◦C. Ukupno 80 μL supernatanta i 20 μL L-DOPA (2 mg/mL) dodano je u 96-ploču s jažicama, a apsorbancija na valnoj duljini od 492 nm mjerena je svakih 10 minuta tijekom 1 sata na 37 ◦ C s čitačem ELISA ploča (TECAN, Salzburg, Austrija).

3.8. Priprema citosolnih i jezgrinih ekstrakata Hs27 stanica

Hs27 stanice su isprane s ledeno hladnim PBS-om i sakupljene. Pufer koji je sadržavao 10 mM Tris(pH 8.0), 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 posto NP-40 i inhibitore proteaze korišten je za ekstrakciju citosolnih frakcija pomoću centrifugiranje na 12,000 okretaja u minuti na 4 ◦C tijekom 15 minuta, a jezgrene frakcije ekstrahirane su iz peleta pomoću pufera koji sadrži 10 mM Tris, 50 mM KCl, 100 mM NaCl i inhibitore proteaze, inkubirane na ledu 30 minuta, a zatim centrifugirano na 13,000× g 30 minuta na 4 ◦C da se dobiju nuklearne frakcije.

3.9. Western Blotting

Uzorci lizata kuhani su 10 min u puferu za punjenje gelom (125 mM Tris-HCl, 4 posto natrijevog dodecil sulfata (SDS), 10 posto 2-merkaptoetanola i 0,2 posto bromofenola plava; pH 6,8) u volumenskom omjeru 1:1. Ukupni proteinski ekvivalenti za svaki uzorak odvojeni su SDS-poliakrilamidnom gelelektroforezom (PAGE) korištenjem akrilamidnih gelova prema proceduri koju je opisao Laemmli [36] i prebačeni na PVDF membrane na 80 V tijekom 2 sata korištenjem sustava mokrog prijenosa. Membrane su odmah stavljene u pufer za blokiranje (5 posto nemasnog mlijeka) u 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mMNaCl i 0,1 posto Tween-20. Mrlje su blokirane kako bi se spriječilo nespecifično vezanje na 25 ◦C tijekom 2 sata. Nakon toga, membrane su inkubirane sa specifičnim primarnim protutijelom na 4 ◦C preko noći, nakon čega je uslijedila inkubacija sa sekundarnim protutijelom konjugiranim s peroksidazom hrena na 25 ◦C tijekom 1 sata. . Označavanje protutijela detektirano je pojačanom kemiluminiscencijom u skladu s uputama proizvođača. Kvantifikacija proteina provedena je korištenjem Davinch-Chemi TM.Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Seoul, Koreja). Prethodno obojeni proteinski markeri korišteni su za određivanje molekularne težine.

3.10. Statistička analiza

Svi podaci prikazani su kao srednja vrijednost ± SEM. Podaci su analizirani jednosmjernom analizom varijance (ANOVA) za razlike između tretmana nakon čega je slijedio Bonferroni post-hoc test. Vrijednost p < 0.05="" smatrana="" je="" statistički="">

4. Zaključci

Ukratko, nalazi ove studije pokazali su da BHCP ima učinak izbjeljivanja kože putem inhibicije tirozinaze, koja je ključni enzim za biosintezu melanina u -MSH-induciranim B16F10melanocitima. Nadalje, BHCP je smanjio ekspresiju razine MMP proteina u fibroblastima izazvanim UV zračenjem, za što se očekuje da ima učinak protiv bora. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se potvrdili učinci BHCP-a na izbjeljivanje i bore putem studija na životinjama i kliničkih studija. Konačno, utvrđeno je da BHCP ima i izbjeljivanje i učinak protiv bora, što ukazuje na njegov potencijal za razvoj terapeutskih sredstava za bolesti povezane s hiperpigmentacijom i borama.

što je cistanche

Za više informacija kliknite ovdje.