Antialergijski i protuupalni učinci neferina na RBL-2H3 stanice

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Sažetak:Mastociti igraju vrlo važnu ulogu u kožnim alergijama i upalama, uključujući atopijski dermatitis i psorijazu. U prošlosti je utvrđeno da referenca djeluje protuupalno i usporava starenje kože, no njezino djelovanje na mastocite još nije detaljno istraženo. U ovoj smo studiji upotrijebili mastocite (RBL-2H3 stanice) i modele miševa za proučavanje antialergijskih i upalnih učinaka referentnog uzorka. Prvo, otkrili smo da referenca inhibira degranulaciju mastocita i ekspresiju citokina. Osim toga, primijetili smo da kada su mastociti stimulirani A23187/forbol 12-miristat-13-acetatom (PMA), porast intracelularnog kalcija je inhibiran referencom. Fosforilacija MAPK/NF-KB puta također je smanjena prethodnom obradom referentnog uzorka. Rezultati in vivo studija pokazuju da referenca može poboljšati pojavu dermatitisa i infiltracije mastocita uzrokovane dinitroklorobenzenom (DNCB). Štoviše, obnavlja se ekspresija proteina barijere u koži.cistanchKonačno, utvrđeno je da referenca može smanjiti ponašanje češanja uzrokovano spojem 48/80. Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da je referenca vrlo dobar antialergijski i protuupalni prirodni proizvod. Njegov učinak na mastocite doprinosi njegovom farmakološkom mehanizmu.

Ključne riječi:referenca; prirodni proizvod; mastocita; dermatitis; svrbež

Kliknite ovdje da saznate više

1. Uvod

Mnoga su istraživanja potvrdila da su alergijske bolesti rezultat ne samo urođene imunološke aktivacije, već i adaptivne aktivacije. Među njima, mastociti imaju vrlo važnu ulogu u raznim alergijskim bolestima kao što su alergijski rinitis, astma i alergijski dermatitis. Mastociti izražavaju IgE receptore (FceRI) na svojim staničnim membranama, a FceRI receptori imaju visok afinitet za IgE antitijela [1,2]. Kada se antigen-specifični IgE veže za FceRI, dolazi do interakcije i alergijske reakcije. Agregacija FceRI može aktivirati receptorske tirozin kinaze, pokrenuti nizvodne reakcije i pospješiti fosforilaciju raznih ključnih proteina (kao što je protein kinaza aktivirana mitogenom; MAPK), što u konačnici dovodi do priljeva kalcijevih iona (Ca2 plus), što je ključni događaj u degranulaciji mastocita [3].cistanche AustralijaAktivirane mastocite degranuliraju i otpuštaju kemijske medijatore. Ovi kemijski medijatori koji se koriste u alergijskim reakcijama mogu izazvati upalu [4], tako da liječenje alergijskih simptoma uključuje inhibitore degranulacije mastocita. Stoga se inhibicija degranulacije mastocita posredovane IgE često koristi za identifikaciju novih spojeva za prevenciju i liječenje alergijskih bolesti. Utvrđeno je da anti-dinitrofenil (DNP)IgE antitijela i antigeni mogu izazvati reakcije pasivne kožne preosjetljivosti (PCA) kao tipičan in vivo model neposredne preosjetljivosti i kao lijek za istraživanje potencijala anti-antigenskih alergija [5,6]. ]. Osim toga, degranulaciju mastocita također mogu uzrokovati neimuni stimulansi, kao što su spojevi 48/80 i A23187. A23187 kalcijev ionofor, dugo je poznato da stimulira izlučivanje mastocita s otpuštanjem prethodno formiranih medijatora, kao što je histamin iz njihovih granula, što služi kao primjer [4] Spoj 48/80 je miješani polimer p-metoksi-N-metilfenetilamina umrežen formaldehidom, koji se naširoko koristi za neovisnu stimulaciju mastocita [7,8] Stoga se odgovarajuće količine spoja 48/80 i A23187 obično koriste kao reagensi za proučavanje mehanizma alergijskih reakcija. Prema statističkim procjenama, oko 15-20 posto stanovništva boluje od atopijskog dermatitisa. Bez obzira radi li se o djeci ili odraslima koji boluju od ove bolesti, bez odgovarajućeg liječenja atopijski dermatitis može uzrokovati psihičke poteškoće oboljelima te opteretiti njihovu obitelj i društvene zdravstvene troškove [9]. Nažalost, ne postoji odgovarajuća metoda liječenja za izlječenje alergijskog dermatitisa. Trenutačne mogućnosti liječenja još uvijek izbjegavaju alergene koji uzrokuju bolest, a stalna uporaba steroida je zlatni standard liječenja. Neizbježni alergeni i nuspojave lijekova potaknuli su hitan razvoj novih terapijskih lijekova. Prirodni spojevi izolirani iz ljekovitog bilja i biljaka potencijalni su izvori terapeutskih sredstava za prevenciju i liječenje upalnih bolesti te poboljšanje kvalitete života bolesnika s alergijskim poremećajima.

Cistanche može spriječiti starenje

Referenca dolazi iz jezgre lotosa (embrija sjemena) biljke Nelumbo nucifera i glavni je bisbenzilizokinolinski alkaloid. Postoje dokazi da referenca ima širok raspon farmakoloških svojstava, kao što su antikancerogeno, antioksidativno, protuupalno i neuroprotektivno djelovanje u mnogim bolestima [10-15].cistanche koristiKhan i sur. otkrili da referenca proizvodi učinke protiv fotostarenja inhibicijom porasta ROS-a i malondialdehida (MDA) posredovanog UV zračenjem u ljudskim keratinocitima i fibroblastima [16,17] Nedavno smo otkrili da referenca ima potencijal kao alternativni lijek za liječenje atopijskog dermatitis ili druge upalne bolesti povezane s kožom[18]. Međutim, još uvijek ostaje neizvjesno ima li referenca antialergijski učinak na mastocite. U ovoj studiji, cilj nam je bio istražiti učinke reference na alergijske bolesti posredovane mastocitima, koristeći ljudske linije mastocita (RBL-2H3 stanice) i spoj 48/80-i anafilaksiju izazvanu DNCB-om model miševa.

La reference proviene del núcleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un importante alcaloide de bisbencilisoquinolina. Existe evidencia de que la referencia tiene una amplia gama de propiedades farmacológicas, como fectos anticancerígenos, antioxidantes, antiinflamatorios y neuroprotectores, en muchas enfermedades [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan et al. encontró que la referencia produce efectos anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS y malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] Recientemente, descubrimos que la referencia tiene potencijal como medicina alternativa para el tratamiento de atópica dermatitis u otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, nuestro objektivo fue investigar los efectos de referencia en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, utilizando líneas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) y un modelo de ratones con anafilaxia inducida por compuesto 48/80 y DNCB .

2. Rezultati

2.1. Test citotoksičnosti neferina na mastocitima štakora (RBL-2H3)

Budući da su štakorske bazofilne leukemije (RBL)-2H3 stanice, analog mastocita koji otpuštaju histamin, prikladne stanice za ispitivanje učinaka upale posredovane mastocitima [19], te smo stanice upotrijebili za istraživanje antialergijskog učinci reference. Prvo smo testirali može li referenca proizvesti citotoksičnost u mastocitima. Kada se stanice prethodno tretiraju referentnom koncentracijom od 1 do 30 µM tijekom 24 sata, referentni tretman neće utjecati na vitalnost stanica (Slika 1).

2.2. Neferin smanjuje učinak degranulacije RBL-2H3 stimuliran različitim aktivatorima

RBL-2H3 stanice obično se koriste za in vitro studije degranulacije [20-22]Stimulacija RBL-2H3 stanica s anti-dinitrofenolom (DNP)IgE i DNP-konjugiranim ljudskim serumskim albuminom (HSA) izaziva degranulaciju. Osim toga, poznato je da mastociti degranuliraju kao odgovor na sintetske spojeve, kao što su spoj 48/80 i kalcijev ionofor A23187, a ti spojevi se koriste kao prikladni reagensi za izravna istraživanja mehanizama in vitro alergijskih odgovora [23, 24]. Rezultati su pokazali da citoplazma RBL-2H3 koju aktivator nije aktivirao sadrži ograničene sekretorne granule.cistanche kolesterolSam tretman referentnom dozom （10 μM） nije utjecao na aktivnost RBL-2H3 (Slika 2A, B). Međutim, dodavanje različitih aktivatora, uključujući spoj 48/80, A23187 i anti-DNP/IgE plus DNP/HSA, jasno je ispunilo citoplazmu sekretornim granulama. Pod elektronskim mikroskopom može se vidjeti da u citoplazmi postoji velik broj sekretornih granula, a neke sekretorne granule čak stapaju sa staničnom membranom, što dovodi do degranulacije (Slika 2C-E). Nakon predtretmana s referentnim 10 uM, sekretorne granule u citoplazmi značajno su smanjene (Slika 2F-H). Ovi rezultati pokazuju da referenca može učinkovito inhibirati aktivaciju i degranulaciju RBL-2H3 stimuliranu aktivatorom.

2.3. Neferin inhibira PMA/A23187-inducirano povećanje intracelularnog kalcija u RBL-2H3

Ioni kalcija igraju ulogu sekundarnog glasnika u procesu aktivacije stanica. A23187 je najučinkovitiji način za povećanje prodora kalcijevih iona kroz stanične membrane i poticanje aktivacije mastocita. Forbol miristat acetat (PMA) može aktivirati protein kinazu Cand i povećati intracelularne kalcijeve ione kako bi se pojačao učinak A23187. Povećanje iona kalcija u mastocitima također se smatra važnim čimbenikom u induciranju aktivacije mastocita tako da utječe na degranulaciju mastocita i oslobađa više upalnih citokina i kemokina.nuspojave cistanche deserticola,Stoga je ova studija nastojala istražiti može li referenca inhibirati koncentraciju kalcijevih iona u RBL-2H3 kada inhibira upalu. Eksperimentalna skupina podijeljena je na s ili bez referentnog prethodnog tretmana tijekom 20 minuta, te su dodani 1 mM CaClz i PMA/A23187 da stimuliraju i aktiviraju RBL-2H3. Eksperimentalni rezultati pokazali su da tretiranje RBL-2H3 različitim referentnim koncentracijama nije utjecalo na povećanje unutarstanične koncentracije iona kalcija. U skupini s PMA/A23187-induciranim priljevom Ca2t, koncentracija intracelularnih kalcijevih iona značajno se povećala. Stanice RBL-2H3 prethodno su tretirane 20 minuta s referentnim koncentracijama (3 μM i 10 μM), a koncentracija iona kalcija značajno je smanjena (Slika 3).

2.4. Neferin je smanjio ekspresiju mRNA proupalnih citokina u PMA/A23187 stimuliranih s RBL-2H3

Imunološki odgovor kože povećat će broj mastocita u tijelu, a mastociti će tada proizvoditi proupalne citokine i ubrzati napredovanje bolesti. Proupalni citokini, posebno TNF-a, IL-6, IL-1 i IL-8, ne samo da izazivaju upalu, već uzrokuju i infiltraciju leukocita, stvaranje granuloma i fibrozu tkiva. PMA/A23187 djeluje na mastocite i potiče ih da proizvode IL-16, IL-6, TSLP i TNF-, uzrokujući upalu povezanu s alergijom. Stoga smo prethodno tretirali RBL-2H3 referencom 20 minuta i stimulirali s PMA/A23187 6 h kako bismo otkrili može li referenca smanjiti ekspresiju mRNA IL-1, IL{{ 19}}, TSLP i TNF-a. Rezultati su pokazali da u skupini koja je tretirana samo referencom ekspresija mRNA citokina nije bila pogođena, a ekspresija mRNA u skupini koja je inducirala upalu pomoću PMA/A23187 značajno se povećala. U skupini koja je tretirana referentno, uočeno je da su razine ekspresije mRNA IL-1, IL-6, TSLP i TNF-a bile značajno potisnute (Slika 4).

2.5. Neferin inhibira PMA/A23187-fosforilaciju MAPK putanje u RBL-2H3

Prethodne studije ukazale su na to da mastociti moraju otpustiti intracelularne kalcijeve ione kako bi aktivirali MAPK. Osim toga, MAPK signalni put regulira ekspresiju monocita, T limfocita, B limfocita, citokina i kemokina i inducira autoimunost. Ovaj mehanizam je sličan aktivacijskom putu PMA/A23187. U ovoj smo studiji istražili može li referenca sudjelovati u regulaciji MAPK putova. Tretirali smo različite referentne koncentracije (1,3 i 10 uM) s RBL-2H3 20 minuta, a zatim stimulirali s PMA/A23187 30 minuta kako bismo izazvali upalu. Rezultati su pokazali da kada je RBL-2H3 tretiran samo različitim koncentracijama referentne vrijednosti, nije utjecalo na aktivaciju proteina p38, JNK i ERK. U skupini liječenoj samo PMA/A23187, otkrili smo da su proteini p38, JNK i ERK aktivirani i imaju značajnu fosforilaciju. U skupini prethodno tretiranoj referencom, uočeno je da je za više referentne koncentracije fosforilacija p38, JNK i ERK proteina značajno smanjena (Slika 5A-C).

2.6. Neferin inhibira PMA/A23187-induciranu fosforilaciju NF-B puta u RBL-2H3

Ekspresija proupalnih citokina ovisi o aktivaciji transkripcijskog faktora NF-kB u mastocitima. Kada je IKB protein fosforiliran i razgrađen, NF-kB je oslobođen i migrirao u jezgru, vežući se sa svojim odgovarajućim elementima koji reagiraju na DNA i promiču transkripciju proupalnih medijatora. Proizvedeni su mnogi citokini i kemokini koji reguliraju imunološki odgovor, diferencijaciju i upalu. Stoga smo istražili utječe li prethodni tretman s referencom na fosforilaciju proteina induciranu s PMA/A23187. Obradili smo različite referentne koncentracije（1,3 i 10 μM） prema RBL-2H3. Nakon 20 minuta, PMA/A23187 stimulirao je RBL-2H3 1 h ili 2 h da izazove upalu. Rezultati su pokazali da tretiranje RBL-2H3 različitim referentnim koncentracijama nije utjecalo na fosforilaciju IKBa i NF-KB. Kada je PMA/A23187 korišten za stimulaciju, uočeno je značajno povećanje fosforilacije IkBo i NF-KB. U skupini koja je prethodno tretirana referencom, utvrđeno je da je fosforilacija IkBa (Slika 6A) i NF-KB (Slika 6B) značajno smanjena.

2.7. Učinak Neferina na 2,4-dinitroklorobenzenom (DNCB) izazvan atopijski dermatitis

Životinjski model za istraživanje bolesti, DNCB je reprezentativni iritant koji uzrokuje atopijski dermatitis[25]. Naš eksperiment koristi 1 posto dinitroklorobenzena (DNCB) otopljenog u 75 posto alkohola kako bi inducirao prvu fazu reakcije osjetljivosti. Referentni (3mg/kg i 10 mg/kg) i deksametazon (Dexa,{{10}}.2 mg/kg) otopljeni u DMSO primijenjeni su intraperitonealno petog dana tijekom deset dana . 8., 1. i 14. dan primijenjen je 0,5 postotni DNCB kao drugi stupanj izazivanja upale. Miševi su podijeljeni u četiri skupine - kontrolna skupina, DNCB skupina, referentna skupina liječena i skupina liječena deksametazonom - a zatim su, nakon usporedbe među skupinama, zabilježene razlike. Uočili smo da je DNCB izazvao reakciju atopijske upale kože na koži miševa. Nakon primjene DNCB-a, ustanovljeno je da je koža miševa pojačano crvenilo i ljuskanje. Sve su to posljedica abnormalne proliferacije keratinocita, infiltracije i agregacije imunoloških stanica. Grupa liječena s referentnom dozom od 3 mg/kg i deksametazonom od 0,2 mg/kg četiri dana ublažila je crvenilo. Nastavili smo promatrati stanje dorzalne kože miševa do 15. dana. U usporedbi s kontrolnom skupinom, DNCB skupina imala je jako crvenu i natečenu kožu, a bilo je i prhuti i rana koje su izgledale uzrokovane svrbežom i bolom . Možemo pronaći trend smanjenja stupnja nakon tretmana referentnim lijekom i deksametazonom (Slika 7A). Boja toluidin plavim korištena je za promatranje broja agregiranih mastocita. Mastociti su izgledali ljubičasti kada su promatrani pod mikroskopom. Može se kvantitativno pokazati da su se mnoge mastocite infiltrirale i akumulirale u dermisu u DNCB eksperimentalnoj skupini, značajno povećane u usporedbi s kontrolnom skupinom. U skupini liječenoj referentnim lijekom i deksametazonom smanjeni su infiltracija, agregacija i broj mastocita (Slika 7B, C).

2.8. Neferin poboljšava ekspresiju mRNA molekula povezanih s barijerom nakon tretmana DNCB-a

Upala povezana s kožom uzrokovana AD-om može uzrokovati abnormalnu funkciju kožne barijere. Ako je kožna barijera neispravna, antigenima ili iritansima je lakše prodrijeti u epidermis kože i ući u tijelo kako bi izazvali reakcije povezane s imunološkim sustavom. U isto vrijeme, proizvodnja diferencijacijskih proteina, uključujući filaggrin, loricrin i involucrin, bit će potisnuta. Stoga je obnavljanje oštećene kožne barijere vrlo važno za prevenciju i liječenje AD [26]. U našem smo istraživanju koristili reference kako bismo intervenirali na životinjskom modelu atopijskog dermatitisa izazvanog DNCB-om. Nakon žrtvovanja miševa, dorzalno kožno tkivo je uzemljeno za RI-qPCR analizu kako bi se procijenilo može li referenca poboljšati smanjenje ekspresije mRNA u filagrinu, lorikrinu i involukrinu nakon liječenja DNCB-om. Rezultati su pokazali da je DNCB eksperimentalna skupina imala značajno smanjenu ekspresiju mRNA filagrina, lorikrina i involukrina u usporedbi s kontrolnom skupinom. Ekspresija mRNA filagrina, lorikrina i involukrina bila je značajno povećana u skupini liječenoj referentnim lijekom i deksametazonom u usporedbi sa skupinom koja je primala DNCB (Slika 8).

Dodatno smo dokazali da referenca ima antialergijski učinak češanja. Koristili smo sredstvo za degranulaciju mastocita, spoj 48/80, da potaknemo ponašanje češanja u BALB/c miševa. Kao što je prikazano na slici 9, otkrili smo da je referentni tretman inhibirao ponašanje grebanja uzrokovano spojem 48/80（50 ug/mjestu）. Ponovljena primjena nižih i viših referentnih doza (3 i 10 mg/kg) tijekom 5 uzastopnih dana značajno je smanjila broj ogrebotina uzrokovanih spojem 48/80.