Poli- i oligosaharid Ulva Sp. Frakcije iz enzimski potpomognute ekstrakcije moduliraju metabolizam 2

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

3. Rasprava

Naš glavni cilj je procijeniti potencijalne biološke aktivnosti poli- i oligosaharidnih frakcija iz Ulon sp. dobiven nakon inovativnog postupka ekstrakcije potpomognutog enzimima (EAE), za koji je poznato da poboljšava prinos ekstrakcije [5] i omogućuje značajno obogaćivanje frakcija u ulvanima u usporedbi s maceracijom [36], na metabolizam dermalnih fibroblasta ljudske kože u Kultura.

Kliknite ovdje da saznate više

Usredotočen je na ekspresiju komponenti izvanstaničnog matriksa kože (ECM) uključenih u anabolički put (osobito kolagena tipa I i Ⅲ, GAG i TIMP-1) i u kataboličkom putu (MMP-1). na proteomskoj i transkriptomskoj razini. U ovom smo radu pretpostavili da je zbog visokog sastava ugljikohidrata i uronskih kiselina frakcija, aktivnost povezana s ulvanovim (poli- i oligosaharidnim) sastavom. Ipak, autori ne bi smjeli zanemariti da polisaharidi ulvani iz Uloa sp. stanična stijenka usko je povezana s proteinima, za koje je također poznato da in vitro potiču proizvodnju ukupnog kolagena i hijaluronske kiseline u ljudskim dermalnim fibroblastima [39]. Stoga autori sugeriraju da bi te aktivnosti mogle biti povezane sa sinergijom između ulvana i proteina, iako je u ovom rukopisu naglasak stavljen na ulvane. 3.1. Djelovanje poli- i oligosaharidnih Uloa frakcija iz EAE na metabolizam ECM fibroblasta

Prethodne studije su pokazale da frakcije iz Uloa sp.Ekstrakt Cistanche protiv zračenja(sirovi ulvani i ulvani niske molekularne težine) imaju sposobnost moduliranja normalne proliferacije ljudskih dermalnih fibroblasta [36-38]. Naši rezultati pokazuju da su i poli- i oligosaharidne frakcije iz EAE inducirale značajno povećanje metaboličke aktivnosti fibroblasta (do plus 68 posto). Ovi rezultati potvrdili su prethodne preliminarne objavljene podatke autora [36] i prethodni rad na hidroliziranom ekstraktu Uloa pertusa pri 250 ug/mL koji je inducirao značajnu pre- i senescentnu proliferaciju fibroblasta [38]. Povećanje metaboličke aktivnosti nije bilo popraćeno citotoksičnim učinkom frakcija (procijenjenim LDH testom), što znači da rezultati bioaktivnosti frakcija poli- i oligosaharida Uloa iz EAE nisu pristrani citotoksičnim učinkom u rasponu testiranih koncentracija. Naš rezultat je u skladu s prethodnim studijama koje ističu ulvane kao necitotoksične spojeve na različitim tipovima stanica (stanične linije makrofaga, crijevne stanice, fibroblasti, stanice miša i Vero stanice)[13,14,4]

cistanche može spriječiti starenje

Kao što je spomenuto u uvodu, kolageni tipa I i III i GAG međusobno djeluju kako bi uspostavili molekularnu mrežu za sklapanje ECM-a u dermisu. Stoga je u ovoj studiji sinteza proteina i ekspresija na razini mRNA glavnih komponenti ECM-a dermisa (kolagena tipa I i Ⅲ i GAG-ova bilo sulfatiranih i nesulfatiranih) istražena u prisutnosti poli- i oligosaharida Ullon sp. frakcije iz EAE. Nadalje, MMP-1, ključni enzim uključen u razgradnju kolagena tipa I (put katabolizma ECM-a) i njegov tkivni inhibitor TIMP-1 uključen u njegovu regulaciju također su procijenjeni na razini proteina i mRNA.

Rezultati su otkrili da su i poli- i oligosaharidne Ulva frakcije iz EAE poboljšale ukupnu sintezu kolagena na 1000 ug/mL (do plus 2 posto procijenjeno Red sirius testom i značajnim rezultatima osim za DEP-AD PP-UE). Ovi se rezultati razlikuju od prethodne studije u kojoj sirovi vans i ulvans niske molekularne težine nemaju značajan učinak na ukupnu sintezu kolagena [37]. Međutim, naši su rezultati u skladu s prethodnim radom, koji je pokazao da pripravci polisaharida bogati L-ramnozom (ROPs) iz sojeva Klebsiella pneumonia stimuliraju sintezu kolagena[45]. Doista, ljudski dermalni fibroblasti sadrže mjesto lektina koje može prepoznati -L-ramnozu [46]. Na ovaj način ljudski dermalni fibroblast može prepoznati ramnozni dio ulvanove frakcije i zatim potaknuti sintezu kolagena. Konkretno, sinteza kolagena tipa I bila je povećana za sve frakcije u ELISA (značajno za UE i DS-UE) i u Western blot testovima (NS). Ovaj rezultat je u skladu s prethodnom literaturom o hidroliziranim ekstraktima Ulva pertusa [38] i depolimeriziranim galaktofukanima (<10kda)from saccharina="" longicruris[47]="" which="" respectively="" increased="" the="" synthesis="" of="" type="" i="" pro="" and="" mature="" collagen.="" in="" our="" study,="" steady-state="" levels="" of="" col1al="" and="" col1a2="" were="" reduced="" after="" exposure="" to="" poly-and="" oligosaccharide="" ulva="" fractions(significant="" for="" col1a1="" at="" 1000="" ug/nnl="" for="" all="" fractions).expression="" in="" coordinated="" manner="" of="" col1al="" and="" col1a2="" genes="" complies="" with="" the="" fact="" they="" are="" both="" subunits="" of="" type="" i="" collagen="" protein="" [48].="" regulation="" between="" type="" i="" collagen="" protein="" production="" and="" mrna="" are="" different="" at="" the="" same="" observation="" time="" of="" 48="" h,="" which="" suggests="" a="" different="" potential="" time="" response="" regulation="" between="" protein="" and="" mrna[49].="" nevertheless,="" protein="" is="" the="" functional="" unit="" in="" ecm="" and="" exhibits="" an="" important="" increase="" after="" treatment="" with="" ulvans-derived="" eae="" fractions.="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" was="" increased="" (significantly="" for="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 1000="" ug/ml)="" and="" correlated="" to="" an="" ns="" increase="" of="" type="" iii="" collagen="" synthesis="" evaluated="" by="" wb.="" moreover,="" the="" results="" showed="" that="" polysaccharide="" uloa="" fractions="" from="" eae="" (ue="" and="" ds-ue)="" boosted="" significantly="" gags(sulfated="" and="" non-sulfated)="" synthesis="" at="" 1000="" ug/ml,="" while="" both="" oligosaccharide="" fractions="" had="" no="" effect.="" our="" observations="" are="" in="" partial="" accordance="" with="" the="" work="" of="" adrien="" etal.="" (2017)="" in="" which="" the="" increase="" in="" hyaluronic="" acid="" production="" in="" fibroblasts="" occurred="" with="" both="" ulvans="" extracts="" (crude="" and="" low="" molecular="" weight="" ulvans)="" [37].="">cistanche herbaDoista, u našoj studiji, ulvani niske molekularne težine nisu imali učinka na proizvodnju GAG-ova (uključujući nesulfatiziranu GAG-ove hijaluronske kiseline).

Budući da je starenje kože karakterizirano neravnotežom komponenti ECM (smanjene razine kolagena tipa I i II i GAG-ova), frakcije poli- i oligosaharida dobivene iz Uloa sp. nakon EAE tretmana su od interesa za strategije protiv starenja, budući da potiču sintezu kolagena tipa I i III i GAG-a.

Međutim, naši su rezultati također istaknuli povećanje sinteze MP-1, aktivnosti i ekspresije gena u prisutnosti frakcija izvedenih iz poli- i oligosaharida Uloa EAE. Porast razine mRNA MMP-1 bio je u korelaciji s povećanjem sinteze MMP-1 u prisutnosti frakcija EAE izvedenih iz Ulona i značajno za frakcije polisaharida (UE i DS-UE). Porast MMP -1 sinteza enzima također je povezana s neznačajnim povećanjem aktivnosti MMP-1 u prisutnosti frakcija. Naš se rezultat razlikuje od prethodne literature jer hidrolizirani ekstrakti Uloa pertusa inhibiraju ekspresiju i izlučivanje MMP-1 u starim fibroblastima[38], ili polisaharidi koji sadrže fukozu (nazvani fukoidani) inhibiraju ekspresiju MMP-1 izazvanu UVB zračenjem u fibroblastima ljudske kože [50]. Međutim, naš je rezultat u skladu sa studijom FRiouxa i sur. (2013.), budući da su sirovi galaktofukani (638-1529 kDa) povećali ukupnu katalitičku aktivnost MMP (uključujući MMP-1) fibroblasta tretiranih 6 dana[47]. Naši podaci o porastu razine MMP-a također su u skladu s radom Andresa i sur. (2006), budući da RROPs (oligo- i polisaharidni pripravci bogati ramnozom iz sojeva Klebsiella pneumonia i K. planticola) pojačavaju ekspresiju MMP-9 [45]Pojačana sinteza MMP-1 obično rezultira smanjenjem ECM-a komponente kao što je kolagen tipa I zbog degradativne aktivnosti MMP-1, ali to nije istaknuto u našoj studiji, jer je došlo do povećanja kolagena tipa I. Nadalje, frakcije izvedene iz Uloa EAE nisu imale utjecaja (povećanje ili smanjenje NS) na razinu ekspresije mRNA i proizvodnju proteina TIMP-1, tkivnog inhibitora MP-1 (osim za DEP-HD PP- UE sa značajnim povećanjem proteina, str<0.05,at 1000="" μg/ml）.it="" appears="" that="" the="" anabolic/catabolic="" balance="" of="" ecm="" could="" be="" in="" favor="" of="" collagen="" synthesis="" despite="" mmp-1="" synthesis="" stimulation="" and="" activity.="" in="" this="" study,="" the="" authors="" thus="" showed="" that="" both="" poly-="" and="" oligosaccharide="" fractions="" derived="" from="" ulloa="" sp.="" after="" eae="" treatment="" are="" promoting="" fibroblast="" metabolism="" activity,="" ecm="" protein="" synthesis,="" and="" skin="" matrix="" renewal="" and="" remodeling,="" which="" is="" of="" interest="" for="" dermo-cosmetic="" applications="" in="" anti-aging="">

3.2. Uloga količine ulvana, sastava sulfata i molekularne težine u ECM modulaciji fibroblasta

Poznato je da strukturna značajka ulvana koja obuhvaća stupanj sulfatacije, obrazac sulfatiranja, sastav monosaharida, glikozidne veze, stupanj grananja, kao i molekularna težina utječe na njegovu biološku aktivnost [10,1,37,40,44,51 ].

Prethodne studije pokazale su da je molekularna težina bioaktivnih spojeva kao što su polisaharidi ili proteini ključni čimbenik za njihov učinak na proliferaciju fibroblasta i ECM modulaciju [37,39,47]. U našem istraživanju frakcije polisaharida, UE i DS-UE, visoke molekularne težine (Mw > 670 kDa) povećale su proliferaciju fibroblasta. Iako frakcije oligosaharida (Mw<10 kda)="" also="" raise="" fibroblast="" proliferation,="" a="" dep-ad="" pp-ue="" fraction="" with="" lower="" molecular="" weight="" (mw="" of="" 1.5="" kda)="" has="" lower="" activity="" than="" dep-hd="" pp-ue="" (mw="" of="" 8="" kda).="" similar="" results="" were="" obtained="" on="" fibroblasts="" treated="" with="" rrops,="" since="" lower="" rrops="" exhibited="" similar="" or="" lower="" proliferation="" activity="" compared="" to="" higher="" mw="" rrops[45].="" polysaccharide="" fractions="" treatment="" also="" enhanced="" gags="" synthesis,="" total="" and="" especially="" type="" i="" and="" iii="" collagen="" synthesis,="" mp-1="" synthesis="" by="" human="" skin="" fibroblasts,="" whereas="" oligosaccharide="" fractions="" (low="" molecular=""><10 kda)="" and="" in="" particular="" dep-ad="" pp-ue="" (1.5="" kda)="" have="" lower="" capacities.="" only="" dep-hdpp-ue="" stimulated="" significatively="" total="" collagen="" synthesis="" and="" mp-1="" synthesis,="" while="" dep-ad="" pp-ue="" with="" lower="" molecular="" weight="" had="" no="" significant="" boost="" effect.="" these="" results="" are="" in="" accordance="" with="" work="" of="" kidgell="" et="" al.="" (2020)="" where="" higher="" molecular="" weight="" ulvan="" fractions="" elicited="" a="" greater="" biological="" activity="" (immunomodulatory="" response)="" compared="" to="" lower="" mw="" van="" fractions[44].="" these="" results="" are="" also="" in="" agreement="" with="" work="" of="" bodin="" et="" al.="" (20),="" since="" enzymatic="" hydrolyzed="" proteins="" from="" uloa="" intestinalis="" did="" not="" stimulate="" ecm="" material="" biosynthesis="" (collagen="" and="" hyaluronic="">

Autori su istaknuli da je bolja bioaktivnost na sintezu GAG-a pripisana frakcijama sulfatiranih polisaharida visoke molekularne težine obogaćenim sirovim ulvanima. To bi moglo biti povezano s intrinzičnim sastavom ulvana u sulfatima i njegovom molekularnom težinom, budući da oligosaharid Ulva sp. frakcije, djelomično potpuno bez sulfata, nemaju sposobnost stimuliranja sinteze GAG-a.cistanche rast penisaDruga studija o Ulku sp. pokazalo je važnost stupnja sulfatiranja ulvana na biološku aktivnost budući da je kemijski sulfatirana Alvan frakcija, udvostručen sadržaj sulfata iz prirodnog polisaharida, snažno poboljšana antikoagulantna aktivnost [10] Štoviše, DS-UE je povećao više ECM modulacije u pogledu GAG-ova, ukupnog i kolagena tipa I i Ⅲ sinteza, u usporedbi s UE. Ova bolja bioaktivnost mogla bi se povezati s većom zastupljenošću ulvana i većim sadržajem sulfatnih skupina u dijaliziranoj frakciji u usporedbi s drugim frakcijama.

Naši podaci su pokazali da poli- i oligosaharid Uloa sp. frakcije su pokazale različite metaboličke aktivnosti, što se može pripisati obilju ulvana, njegovom stupnju sulfatizacije i kemijskoj strukturi. Ovaj je rad također istaknuo bolju aktivnost za vanove visoke molekularne težine koji prikazuju sulfatne skupine. Činjenica da su frakcije polisaharida bogate sirovim ulvanima (tj. nedepolimerizirani) imale najveći učinak na metabolizam ECM fibroblasta idealna je za nadolazeće studije i njegove buduće potencijalne primjene u dermo-kozmetičkoj njezi, jer minimalna obrada smanjuje proizvodne troškove i vrijeme.

4. Materijali i metode

4.1. Makroalgalni materijal

Zelena morska trava, Ulva sp. (Chlorophyta, Ulvales, Ullvaceae), potječe s međuplimne plaže Landrezac (47 stupnjeva 30 stupnjeva 17,9" N stupnja 2 stupnja 42 stupnja 37,1" O) u Sarzeau (Bretanja, Francuska) 28. svibnja 2018. tijekom poslijepodneva za vrijeme oseke. Materijal je ispran vodom iz slavine, samljeven na promjer od 3 mm, zamrznut na -25 stupnjeva, osušen smrzavanjem (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Njemačka) i pohranjen na sobnoj temperatura u mraku.

4.2. Proizvodnja i karakterizacija poli- i oligosaharidnih frakcija

U prethodnom radu Fourniere et al. (2019.) opisana je detaljna proizvodnja poli- i oligosaharidnih frakcija iz enzimski potpomognute ekstrakcije (EAE) (vidi sliku 9 i tablicu 3)[36].

Da ukratko rezimiramo, endo-proteaza Protamex [(Novozymes, Bagsverd, Danska) korištena je u koncentraciji od 6 posto (w/w) na osušenoj Uloa sp. alge. Enzimska hidroliza je provedena 3 sata na 50 stupnjeva. Zatim je vodeni ekstrakt podvrgnut etanolnom taloženju (1:5, v Fisher Scientific, Illkirch, Francuska) na 4 stupnja tijekom 244 sata kako bi se dobila frakcija bogata sirovim ulvanima (UE).

Zatim je proizvedena frakcija DS-UE nakon dijalize frakcije bogate sirovim Evansom (10 mg/mL) tijekom 7 dana na 4 stupnja (granična vrijednost 12-14 kDa, Spectra/Por94 dijalizna membrana, Spectrum Laboratories, Fisher Scientific , Illkirch, Francuska).

Dva postupka depolimerizacije (radikalska depolimerizacija pomoću H-OZ i depolimerizacija ionsko-izmjenjivačkom smolom) provedena su na otopini etanolnog taloga iz frakcije bogate sirovim ulvanima (25 mg/mL). Za radikalsku depolimerizaciju, vodikov peroksid (8 posto, v/v , Fisher Scientific, Illkirch, Francuska) miješan je s otopinom 24 sata na 50 stupnjeva, a proizvod je podvrgnut 48-satnoj dijalizi na 4 stupnja (cut-off of 500-1000 Da, Biotech CE Tubing , Spectra/Por@, Fisher Scientific, IIllkirch, Francuska). Za kiselu depolimerizaciju, smola Amberlite" FPC23H (ekvivalent 10 mL, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francuska) miješana je s otopinom tijekom 24 sata na 80 stupnjeva, a proizvod je neutraliziran s NaOH (0,1 i 1 M) prije nego što je prošao 48 sati dijaliza na 4 stupnja (cut-off od 500-100 Da, Biotech CE Tubing, Spectra/Por", Fisher Scientific, Illkirch, Francuska).dobrobiti cistanche salseOva dva postupka dovela su do oligosaharidnih frakcija nazvanih DEP-HD PP-UE i DEP-AD PP-UE za H2OZ odnosno postupak kisele smole.

Sve frakcije su osušene zamrzavanjem (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanla-gen GmbH, Osterode am Harz, Njemačka) i pohranjene na 4 stupnja prije analize. Karakterizacija ovih frakcija: distribucija molekularne mase polisaharida visokotlačnom kromatografijom za isključivanje veličine (HPSEC, UHPLC Ultimate 300, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD), biokemijski sastav, sastav monosaharida pomoću anionsko-izmjenjivačke kromatografije visoke učinkovitosti s pulsnom amperometrijom detekcija (HPAEC-PAD, Dionex" ICS-5000* DC, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, Francuska) i matrično potpomognuta laserska desorpcija spektrometrija masa mase s vremenom leta (MALDI-TOF, Bruker, Billerica, Waltham, MA , SAD) također su provedene u prethodnoj studiji [36].

4.3. Kultura stanica

Uzorke ljudskih dermalnih fibroblasta osigurao je "Laboratoire Interactions Ep-itheliums Neurones" (LIEN, EA 4685), Brest, Francuska. Ljudski dermalni uzorci dobiveni su iz biopsija kože zdravih donora koji su bili podvrgnuti abdominoplastičnom zahvatu. Studija je provedena u skladu s Helsinškom deklaracijom, a svi su pacijenti potpisali obrazac za informirani pristanak. Zbirke uzoraka pridržavaju se lokalnog sporazuma ("Comite de protection des personnes" Ouest VI) i navode se pod DC 2016-2833.

Normalni ljudski dermalni fibroblasti (NHDF) uzgajani su u Dulbecco modificiranom orlovskom mediju (DMEM, Lonza, Basel, Švicarska) s 10 posto (v/v) fetalnog goveđeg seruma (FBS, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francuska ), 1-postotnu otopinu antibiotika (v/v) (Penicillin, Streptomycin 10,000 U/mL, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francuska) i 1-postotni antimikotik (v/v) (Fungizone, amfotericin B, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francuska), u inkubatoru s kontroliranom temperaturom s 5 posto CO2 na 37 stupnjeva (Forma Steri-Cyclei160, Thermo Fisher Scientific Langenselbold, Njemačka). Stanice su subkultivirane tripsinizacijom (0,05 posto) i EDTA (etilendiamintetraoctena kiselina) otopinom ((Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francuska) nakon postizanja konfluencije. Svi eksperimenti su izvedeni između 3. i 8. prolaza.

Stanice su nasađene na 96-mikroploče s jažicama gustoćom od 400 stanica po jažici za testove WST-1 i LDH (laktat dehidrogenaza) na 12-ploče s jažicama, gustoćom od 5{{8 }} stanica/jažici za bojenje Red sirius i Blue Alcian i RT-qPCR test, te na 6-ploče s jažicom pri gustoći od 200 000 stanica/jažici za ELISA i Western blot analize.

U svim eksperimentima, nakon postizanja 80 posto konfluentnosti, stanice su inkubirane u DMEM s 2 posto FBS-a u odsutnosti ili prisutnosti poli- i oligosaharidnih frakcija tijekom 48 sati pri 50 i 1000 ug/mL.

4.4.WST-1 Test proliferacije stanica

WST-1, in vitro, analiza se temelji na pretvorbi tetrazolijeve soli WST-1 (4-[3-(4-lodofenil){{5 }}(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzen disulfonat) u formazan (narančasta boja) pomoću staničnih mitohondrijskih dehidrogenaza. Promjena boje izravno je proporcionalna vitalnosti i proliferaciji stanica u kulturi.

Nakon 48 h inkubacije, medij je uklonjen i 100 uL WST-1 reagensa (WST-1 set za proliferaciju stanica, Roche Diagnostics, Meylan, Francuska; razrjeđenje 1:40 u DMEM s 2 posto FBS) dodati u svaku jažicu. Nakon 45 minuta inkubacije na 37 stupnjeva s 5 posto CO2, izmjerena je apsorbancija na 450 prema 630 nm s čitačem mikropločica (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finska). 4.5. Test citotoksičnosti LDH

Test citotoksičnosti LDH temelji se na mjerenju laktat dehidrogenaze (LDH), koji je stabilan citosolni enzim koji se oslobađa nakon lize stanice. Oslobođeni LDH u supernatantima kulture mjeri se pretvorbom tetrazolijeve soli (jodonitrotetrazolijevo ljubičasto) u produkt crvenog formazana.cistanche tubulosa doziranje redditIzmjerena količina crvenog formazana proporcionalna je broju liziranih stanica.

Određivanje LDH (CytoTox96@, Promega, Madison, WI, SAD) provedeno je prema uputama dobavljača. Pozitivna kontrola (maksimalno oslobađanje LDH) provedena je dodavanjem 10 uL otopine za lizu 10×(Triton X-100 na 0,8 posto) tijekom 45 minuta prije dodavanja reagensa CytoTox969. Nakon inkubacije, 50 μL supernatanta stanične kulture preneseno je na novu 96-mikroploču s jažicama （nesterilnu）. Zatim je dodano 50 μL reagensa CytoTox96 stupanj. Mikroploča je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Zatim je reakcija zaustavljena dodatkom 50 μL "Stop otopine". Oslobađanje LDH mjereno je kvantifikacijom apsorbancije s čitačem mikropločica na 490 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finska).

4.6.Bojanje Alcian Blue za kvantifikaciju glikozaminoglikana

Alcian plavo bojanje je metoda bojanja koja omogućuje kvantificiranje dviju vrsta glikozaminoglikana (GAG): sulfatnih (heparan sulfat, keratan sulfat, kondroitin sulfat i dermatan sulfat) i nesulfatiranih (hijaluronska kiselina). Alcian plava otopina pri pH 1 boji sulfatne GAG-ove, dok otopina pri pH 2,5 boji nesulfirane GAG-ove.

Na kraju inkubacije, medij kulture je uklonjen, a stanice su isprane dva puta s PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Irance). Zatim su stanice isprane 5 minuta s 0.1N HCl (pH1, Fisher Scientific, Illkirch, Francuska) ili s 3M octenom kiselinom (pH2,5, Fisher Scientific, Illkirch, Francuska) kako bi se smanjio pH i otkrivaju sulfatirane i nesulfatirane glikozaminoglikane. Zatim su stanice obojene s 1 posto Alcian Blue (8GX, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francuska) u otopini HC10.1N (pH1) ili u 3 posto otopini octene kiseline (pH 2.5) tijekom 30 minuta. Stanice su isprane dva puta vodom iz slavine 5 minuta, osušene ispod poklopca i isprane destiliranom vodom 5 minuta. Zatim je vezana boja solubilizirana otopinom gvanidin hidroklorida 6M (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francuska) 5 minuta uz miješanje na sobnoj temperaturi. Obojena otopina je prebačena u novu 96-mikroploču s jažicama, a očitavanje apsorbancije je obavljeno na 600 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finska).

4.7.Bojanje crvenim Siriusom za kvantifikaciju ukupnog kolagena

Postupak bojenja Red Sirius omogućuje kvantificiranje ukupnog kolagena. Picrosirius crvena, jaka linearna anionska boja koja se sastoji od šest sulfonatnih skupina, asocira duž kationskih kolagenih vlakana.

Nakon inkubacije, medij kulture je uklonjen, a stanice su isprane dva puta s PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Francuska). Zatim je u svaku jažicu dodan 1 mL Bouinove otopine Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francuska) i stanice su bojene 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim su stanice dvaput isprane destiliranom vodom i osušene ispod poklopca. Stanice su obojene s 1 mL otopine Red Sirius (Sirius Red 80 u zasićenoj vodenoj otopini pikrinske kiseline, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francuska) tijekom 1 sata. Nakon bojenja, otopina je uklonjena, a stanice su uzastopno isprane destiliranom vodom i HC10.01N da se ukloni nevezana boja. Vezana boja je otopljena s NaOH 0,1 N 30 min. Obojena otopina je prebačena u novu 96-mikroploču s jažicama, a očitavanje apsorbancije je obavljeno na 550 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finska). 4.8. ELISA testovi kolagena tipa I i MMP-1

Nakon inkubacije, stanice su isprane dva puta s PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Francuska). Fibroblasti su lizirani u RIPA (radioimunoprecipitacijski test) puferu (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francuska) dopunjenom koktelom inhibitora proteaze (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francuska) na 4 stupnja tijekom 1 h. Stanice su ostrugane, a uzorci su vrtloženi 30 minuta i centrifugirani (12,00xg 30 minuta na 4 stupnja). Supernatanti koji sadrže unutarstanične proteine ​​sakupljeni su i zatim pohranjeni na -80 stupnjeva do analize za određivanje proteina i Western blot analize. Koncentracija proteina određena je Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) koristeći goveđi serumski albumin (BSA) kao standard.

Supernatant stanične kulture je sakupljen i centrifugiran kako bi se uklonili stanični ostaci (200 x g tijekom 10 minuta na 4 stupnja) i pohranjen na -80 stupnja do analize.

Mjerenja kolagena tipa I i MMP-1 procijenjena su u mediju kulture s Abcam kitovima (ab210966 Human Pro-Collagen I alpha 1 SimpleStep ELISA Kit i ab215083 Human MMP1 SimpleStep ELISA Kit, Cambridge, MA, SAD) prema uputama proizvođača . Apsorbancija je mjerena na 450 nm s čitačem mikropločica (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finska). Rezultati su normalizirani s prethodno određenim koncentracijama staničnih proteina. 4.9.Western BlotEkstrakcija uzoraka proteina opisana je u prethodnom odjeljku 4.8. Uzorci proteina s Laemmli puferom (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska) kuhani su 5 minuta na 95 stupnjeva i potom centrifugirani na 16,000×g 1 minutu. Jednake količine proteina (10 ug) stavljene su u jažice od 7,5 posto ili 4-15 posto TGX Stain-Free gela (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska), zajedno s Precision Plus Protein "Unstained Protein standard (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska). Gel je pušten na 200 V tijekom 30 minuta (PowerPac"Basic s Mini-PROTEAN Tetra System, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska). Prijenos proteina iz gela u mini PVDF (poliviniliden fluorid) membranu (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska) izveden je pomoću Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska) ). Membrana je blokirana 3 postotnim BSA Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francuska) ili 5 postotnim nemasnim suhim mlijekom u TBST (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska) 1 sat na sobnoj temperaturi i isprano s TBST. Membrana je ispitivana kolagenom tipa I (Novotec, Reuver, Nizozemska), kolagenom tipa III (Novotec, Reuver, Nizozemska), MMP-1 (EnoGene, New York, NY, SAD) ili TIMP{{43 }}(RayBiotech, Peachtree Corners, GA, SAD) antitijela; zatim je ispran nekoliko puta s TBST i inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi sa sekundarnim antitijelima konjugiranim s peroksidazom (Jackson ImmunoResearch, Ely, UK). Zatim je bistri Western ECL supstrat (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska) nanesena 5 minuta na membrane i otkrivenje je izvedeno pomoću ChemiDoc XRS plus Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska). Razina proteina kvantificirana je pomoću softvera ImageLab v6.01.1.

4.10.Zimografija

Zimografija je provedena za analizu aktivnog oblika kolagenaze MMP-1 prema Inanc et al. (2017) prilagođena metoda [52].

SDS-PAGE gelovi (10 posto poliakrilamida, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska) kopolimerizirani su s 1 mg/mL kolagena štakorskog repa tipa I Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francuska). Protein uzorci (5 ug) pomiješani su s nereducirajućim puferom za uzorke (62,5 mM Tris HCl pH 6,8, 20 posto glicerola, 4 posto SDS-a, 0,01 posto bromofenol plavo), centrifugirani 1 min na 4 stupnja, stavljeni u jažice gela, zajedno s Precision Plus Protein" All Blue Standards (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska), a zatim podvrgnut elektroforezi na 110 V na 4 stupnja tijekom 2 sata. Gel je ispran dva puta u 2,5 posto Triton X{{26 }} (v/v) 15 min svaki put kako bi se uklonio SDS. Zatim je gel inkubiran u Zymogram Development Buffer (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska) 48 h na 37 stupnjeva. Nakon inkubacije , gel je bojan 1 sat s 0,5 postotnom otopinom Coomassie Blue R-250 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska) (w/v), a zatim je odbojan u 40 postotnom metanolu i 10 postotnoj ledenoj octenoj kiselini riješenje (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francuska). Aktivnost MMP-1 otkrivena je kao jasna traka na pozadini gela obojenog Coomassie Blue. Kvantifikacija je provedena na ChemiDoc XRS plus Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska) sa softverom Image Lab verzija 6.01.1 (Bio-Rad). 4.11. Izolacija RNA i RT-PCR u stvarnom vremenu

Nakon 48 h inkubacije, ukupna RNA ekstrahirana je TRIzolom (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) i kloroformom (Acros Organics, Fisher Scientific, Illkirch, Francuska), istaložena izopropanolom (Fisher Scientific, Illkirch, Francuska), isprana etanolom 75 postotaka, osušen ispod poklopca prije resuspendiranja u vodi tretiranoj DEPC (dietilpirokarbonatom) (Fisher Scientific, IIlkirch, Francuska). Količina RNK i razina čistoće (između 1,8 i 2.0) procijenjeni su mjerenjem apsorbancije na čitaču mikropločica (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finska) na 260 i 280 nm pomoću drop TM Plate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD).

Jedan mikrogram ukupne RNK tretiran je s DNazom I (iScript Dnase Master Mix, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska) 5 minuta na 25 stupnjeva kako bi se uklonili kontaminanti DNK. Enzim je inaktiviran 5 minuta na 75 stupnjeva.

Reverzna transkripcija izvedena je na 1 ug ukupne RNA, prethodno tretirane s DNazom I, koristeći iScript Reverse Transcription (RT) Supermix (Bio-rad, Marnes-La-Coquette, Francuska). Koraci koji su slijedili za sintezu cDNa bili su 5 minuta na 25 stupnjeva ,20 min na 46 stupnjeva i 1 min na 95 stupnjeva.

Kontrole bez uzorka uključene su u PCR eksperimente. qPCR je izveden u 96-pločama s jažicama za ukupni volumen od 20 μL koji sadrži 1 uL 1∶15 razrijeđenih uzoraka cDNA sa sobne temperature, 1 μL primera（vidi tablicu 4, Bio-Rad, Marnes -La-Coquette, Francuska）, 10 μL iTaq Universal SYBR Green Supermix （Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska） i 8 μL vode bez nukleaza. Uvjeti pojačanja bili su 2 minute na 95 stupnjeva nakon čega slijedi 40 ciklusa od 5 s na 95 stupnjeva i 30 s na 60 stupnjeva, a završavaju s 5 s na 95 stupnjeva i 5 s na 65 stupnjeva prije protokola za krivulju topljenja: povećanje od 0,5 stupnjeva od 65 stupnjeva do 95 stupnjeva. PCR eksperimenti izvedeni su na sustavu CFX 96 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francuska), a rezultati su prikupljeni iz softvera Bio-Rad CFX Manager v3.1 (Marnes-La-Coquette, Francuska). Količine mRNA normalizirane su na mRNA RPL13A, a analiza relativne ekspresije gena izračunata je pomoću 2-AACt metode.

4.12. Statistička analiza

Sve vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost od n eksperimenta ± standardna pogreška (SE).

Statističke analize provedene su pomoću Addinsofta (2020). Procjena normalne distribucije podataka procijenjena je pomoću Shapiro-Wilkovog testa. Značajne razlike između kontrolnih i pokusnih uzoraka analizirane su Studentovim t-testom (nezavisnim, dvostranim), kada je došlo do normalne distribucije, te Mann-Whitneyjevim testom, kada je normalna distribucija odbačena. Značajne razlike u usporedbi s kontrolom prema statističkom testu označene su zvjezdicama (*str<><0.01 and=""><0.001). differences="" that="" are="" not="" statistically="" significant="" are="" named="" "ns"="" in="" the="" text="" and="" are="" characterized="" by="" the="" absence="" of="" asterisks="" on="" the="">

5. Zaključci

Ovaj rad pokazuje da poli- i oligosaharidne frakcije, obogaćene ulvanima, oporavljene nakon zelene nove tehnologije EAE iz zelene morske alge Uloa sp., utječu na proliferaciju fibroblasta, sintezu ECM proteina, obnavljanje matriksa i remodeliranje. Mogla bi se pojaviti potencijalna primjena u kozmetičkim strategijama protiv starenja jer je starenje kože obilježeno smanjenjem sinteze kolagena. Stoga je obnova matriksa kože korisna u ovom kontekstu. Dakle, ulvani, od Ulva sp. frakcije dobivene nakon EAE, biološki su aktivne na metabolizam fibroblasta ljudske dermalne kože. Autori sugeriraju da je ova aktivnost funkcija obilja ulvana, sastava sulfata i molekularne težine frakcija. Autori nagađaju da ove sulfatirane molekule bogate ramnozom odgovaraju signalnim molekulama, koje prepoznaju mjesta lektina membranskih fibroblasta i potom stimuliraju njihovu metaboličku aktivnost i s anaboličkog i s kataboličkog stajališta. Međutim, potrebna su daljnja istraživanja kako bi se dublje procijenio molekularni mehanizam aktiviran poli- i oligosaharidom Ulou sp. frakcije na razini transkripcijskih faktora, kapacitet prodiranja ulvana visoke i niske molekularne težine u 3D modele kože ili ex vivo eksplantata kože, i potvrđuju ove rezultate ECM modulacije s frakcijama izvedenim iz Uloa EAE u ovim modelima za metu protiv starenja.

Ovaj je članak izvađen iz Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs