Sveobuhvatno profiliranje formulacija sekretoma iz fetalnih i perinatalnih matičnih stanica ljudske amnionske tekućine

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Nadalje, kao što je prikazano na stupčastim dijagramima na slikama 5B i 6B, značajna je distribucija proteina u skladu s hipoksičnim predkondicioniranjem izlučujućih stanica. U ovom slučaju, za potpunu informaciju, također su prijavljeni proteini koji ne prelaze prag skupa DAve i DCI. Fetalni ima rezultate sekretoma obogaćene proteinom toplinskog udara od 60 kDa (HSPD1, slika 5B, lijeva ploča) u svojoj hipoksičnoj formulaciji, dok perinatalni pandan visoko eksprimira kontraktilni miozin glatkih mišićnih stanica [52]svjetlosni polipeptid 9(MYL9, slika 5B, desna ploča). Čini se da važan udio razlike između gestacijskih stadija više ovisi o hipoksijskom predkondicioniranju u hAFS-u. električna vozila; f-have-EV dobiveni pripremom hipoksičnih stanica obogaćeni su čimbenicima uključujući perlekan (HSPG2), agrin (AGRN), podjedinicu laminina -5 i -1(LAMA5 i LAMB1), trombospondin{{17 }} (THBS1, slika 6B, lijevi panel). Hipoksične p-hAFS-EV sadržavale su teški lanac feritina (FTH1), proteine ​​skele kao što su Flotillin-1(FLOT1), Fascin (FSCN1), Aneksin A6 (ANXA6), inhibitor disocijacije Rab GDP beta (GDI2), zajedno s Thy -1 membranski glikoprotein (THY1), neuropilin-1(NRP1) i matrični metaloprotein 14 (MMP14, slika 6B, desna ploča).

Kliknite ovdje da saznate više

Proteini su pronađeni s učestalošću od najmanje 2 u svakom ispitivanom stanju u f-hAFS. EV i p-hAFS-EV dalje su uspoređeni s bazom podataka Vesciclepedije [53]. Kao što se očekivalo, većina identificiranih proteina (96 posto) prethodno je opisana u EV-ima i egzosomima u referentnoj bazi podataka (Slika S3A).cistanche koristiU tom smislu, analiza obogaćivanja genske ontologije (GO) provedena je pomoću FunRicha [54]. Obilje pojmova GO u skupu podataka uspoređeno je s njihovom prirodnom količinom u referentnoj bazi podataka kako bi se pronašle statistički previše zastupljene skupine proteina, prema njihovoj uključenosti u biološke procese, molekularnu funkciju i stanične komponente (za ovaj posljednji aspekt podaci nisu prikazano, ali dostupno na zahtjev). Što se tiče analize molekularnih funkcija povezanih s identificiranim proteinima, frakcije hAFS-CM ukazale su na obogaćivanje strukturnim sastavnim dijelom izvanstaničnog matriksa i citoskeleta, vezanje proteina citoskeleta i aktivnost strukturne molekule (Slika S2), dok su hAFS-EVs obogaćeni strukturnim sastavni dio citoskeleta i ribosoma, vezanje DNA i RNA i čimbenici vezanja GTPaze i šaperona (slika S3C).

Analiza obogaćivanja bioloških procesa i za hAFS-CM i za have-EV pokazuje da većina proteina moduliranih u fetalnim i perinatalnim frakcijama hAFS sekretoma pripada staničnom rastu/održanju i metabolizmu proteina (slike 5C i 6C). Unutar hAFS-EV primijetili smo da je izraz "strukturni sastojci izvanstaničnog matriksa" isključivo povezan s hipoksičnim f-hAF-EV; pojmovi "vezivanje iona kalcija" i "strukturna molekularna aktivnost" uglavnom su obogaćeni u hipoksičnim f-hAFS i p-hAFS uzorcima (slika S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10,4I i DCI (pouzdanost diferencijalne ekspresije) Veći ili jednak I5I prošli su filtre i smatrali su se različito izraženim; vidi tablicu S3 za potpuni popis i detaljne parametre prijavljenih proteina. (C) Analiza obogaćivanja bioloških procesa proteina identificiranih s učestalošću od najmanje 2 u f-hAFS-EV (lijeva ploča) i p-hAFS-EV (desna ploča) nakon hipoksičnog predkondicioniranja. Na temelju alata FunRich, pojmovi genske ontologije prikazani su u trakastim dijagramima koji prikazuju postotak gena obogaćenih za svaku kategoriju (tamnožute trake za f-hAFS-EVsnormo, crvene trake za f-hAFS-EVShypo, svijetlozelene trake za p-hAFS -EVsnormo i tamnozelene trake za p-hAFS-EVShypo). Samo pojmovi genske ontologije s ispravljenim Bonferronijem*str<0.05 are="">

Cistanche može spriječiti starenje

2.6. Profiliranje citokina i kemokina fetalnih naspram perinatalnih has-CM i have-EV otkrilo je različite obrasce distribucije

Prethodno smo potvrdili regenerativni kapacitet f-hAFS-CMhypo na ozlijeđenim kardiovaskularnim stanicama putem parakrinih učinaka [34,35,49]. Ovdje smo usporedili sadržaj citokina i kemokina f-hAFS-CMHypo s odgovarajućim p-hAFS pandanom (Slika 7A, Slika S4A i Tablica S4) i pronašli neke diskriminirajuće faktore.

ANGIOGENIN, induktor metaloproteinaze izvanstaničnog matriksa (EMMPRIN), interleukin 8 (IL-8) i monocitni kemoatraktantni protein-1 (MCP-1) pronađeni su isključivo obogaćeni inf-hAFS-CMNypo i nisu otkriven u p-hAFS-CMhypo. Inzulinu sličan faktor vezivanja proteina 2 (IGFBP2) i osteopontina (OPN) značajno su povećani u f-hAFS-CMhypo u odnosu na p-hAFS-CMHypo za 3.5-i 3.8-puta (" str<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

Dok je fetalni u odnosu na perinatalni EV-CM pokazao različitu ekspresiju u svom profilu citokina i kemokina, odgovarajući fetalni u odnosu na perinatalni EV parnjaci bili su homogenije raspoređeni, iako s nižim profilima ekspresije (Slika 7B, Slika S4B i Tablica S5). Usprkos tome, neke su se razlike mogle cijeniti: DiPeptidil-Peptidaza IV (DPPIV), faktor rasta/diferencijacije 15 (GDF-15) i IL-8 bili su izraženi samo pomoću f-hAFS-EVSHypo, iako na niskim razine; ANGIOPOETIN2, CD40 LIGAND i vitamin D-vezujući protein (VDBP) pronađeni su samo u p-hAFS-EVShypo, unatoč ponovnom otkrivanju u malim količinama. Ostali citokini kao što je moždani neurotrofni faktor (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, inzulinu sličan faktor vezivanja proteina 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, stromalni faktor{ {23}} alfa (SDF-1a), pronađeni su i u f-hAFS-EVShypo i p-hAFS-EVSHvpo, pri čemu su PAI-1 i EMMPRIN jače izraženi (Slika 7B)

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 i SDF-lo bili su isključivo obogaćeni u svim hipoksičnim have-EV u usporedbi s odgovarajućim hAFS-CM, bez obzira na gestacijski stadij. Štoviše, iako EMMPRIN nije otkriven unutar p-hAFS-CMhypo, pronađeno je da je obogaćen odgovarajućom frakcijom EV; obrnuto, OPN je bio obilniji u f-have-CMhypo nego u f-have-EVShypo, dok je bio usporediv među odgovarajućim frakcijama sekretoma p-hAFS. FGF-19,MIF i PTX3 bili su slično izraženi u fetalnom i perinatalnom has-CM i u odgovarajućim hAFS-EVs. PAI-1 bio je visoko obogaćen frakcijama hipoksičnog sekretoma.

Slika 7. Profiliranje citokina i kemokina unutar formulacija fetalnog i perinatalnog hAFS sekretoma. (A) Ekspresija citokina i kemokina otkrivenih unutar hipoksičnog fetalnog u odnosu na perinatalni have-CM (f-hAFS-CMHypo vs p-hAFS-CMHypo) prikazana je u gustoći piksela proizvoljnom jedinicom [AU]. Vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ±sem neovisnih eksperimenata i prikazane u tablici S4;*p=0.0485;**p=0.006.(B)Sadržaj citokina i kemokina otkriven u hipoksičnom fetalnom u odnosu na perinatalne hAFS-EV (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) i izraženo gustoćom piksela u proizvoljnim jedinicama [AU].cistanche kolesterolVrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± sem od n=3 neovisnih eksperimenata i prikazane u tablici S5. CST3: Cistatin C; EMMPRIN: Induktor metaloproteinaze izvanstaničnog matriksa; FCFF-19: Faktor rasta fibroblasta-19; IGFBP2: Inzulinu sličan faktor rasta (IGF) koji veže protein 2; IL-8: Interleukin -8;IL-17a:Interleukin-17a; MCP-1: monocitni kemoatraktantni protein-1;MIF: inhibicijski faktor migracije makrofaga; PTX3: pentraksin 3; PAI-1: Inhibitor aktivatora plazminogena-1; BDNF: moždani neurotrofni faktor; DPPIV: dipeptidil peptidaza IV; GDF-15: Faktor diferencijacije rasta-15; IGFBP3: Inzulinu sličan faktor rasta (IGF) vezujući protein 3; SDF-1a: Faktor izveden iz strome-1 alfa; VDBP: protein koji veže vitamin D.

2.7. Fetalni i perinatalni imaju-EV obogaćeni su RNK informacijama u svom teretu

Budući da se male nekodirajuće RNA smatraju glavnim regulatorima parakrinog utjecaja EV na ciljne stanice [4,55], analizu sekvenciranja RNA uglavnom smo usmjerili na sadržaj mikroRNA (miRNA) unutar f-hAFS-EV i p-hAFS-EV. Profiliranje male RNA pokazalo je obogaćivanje miRNA u fetalnim i perinatalnim hAFS-EV (oko 35-36 posto) u usporedbi s ukupnom malom količinom RNA (Slika 8A). Komponenta miRNA doista je bila među dvije najzastupljenije vrste RNA u obje EV formulacije, zajedno s rRNA(***p) p < 0.0001).="" sljedeće="" mirna="" bile="" su="" najviše="" obogaćene="" u="" analiziranim="" ev="" uzorcima:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,neka-7a-5p,neka-7b-5p,neka-7f{="" {27}}p,neka-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" i="" mir-221-3p.="" treba="" napomenuti="" da="" fetalni="" i="" perinatalni="" imaju-ev="" dijele="" većinu="" takvih="" mirna="" (naime="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{{47="" }}f-5p,="" neka-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" i="" mir-221-3p,="" slika="" 7b).="" 15="" najobogaćenijih="" vrsta="" mirna="" pokriva="" više="" od="" 60="" posto="" ukupnog="" sadržaja="" mirna="" u="" svakom="" uzorku.="" s="" druge="" strane,="" oko="" 100="" mirna="" pronađeno="" je="" u="" preostalih="" 30="" posto="" sadržaja="" vezikularne="" mirna="" (slika="">

Kako bismo dodatno okarakterizirali sadržaj miRNA unutar hAFS-EVs, istražili smo mogu li hAFS gestacijski stadij ili in vitro predkondicioniranje hipoksičnih stanica utjecati na obogaćivanje specifičnih miRNA. Najjača modulacija je pronađena između gestacijskih stadija, gdje su gotovo sve modulirane miRNA bile obogaćene f-hAFS-EV-ovima u odnosu na perinatalni pandan (Slika 9A i Tablica 1). Hipoksičko predkondicioniranje imalo je blaži učinak na teret miRNA, dok je u ovoj usporedbi modulacija bila u oba smjera, s nekim miRNA obogaćenim u hipoksičnim, a drugima u normoksičnim kontrolnim uvjetima (Slika 9A).

Kao komplementarnu analizu, usredotočili smo se na identifikaciju istraživanih miRNA s najnižom varijabilnošću među različitim donorima i predkondicioniranje kulture, za EV-ove izvedene iz oba istražena gestacijska stadija. miRNA koje su nastale ovom analizom kretale su se od visokih do niskih razina ekspresije (Slika 9B). Unutar najstabilnije miRNA jezgre tereta hAFS-EVs, identificirane su neke zajedničke miRNA između f-hAFS-EV i p-hAFS-EV (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p na visokoj razini; miR-221-3p,miR-221-5p i miR-22-3p na slaboj razini, Tablica 2).

Slika 9. Analiza različitog obogaćivanja miRNA u fetalnim i perinatalnim hAFS-EVs. (A) Grafike vulkana za različito obogaćivanje hAFS-EV miRNA tereta prema gestacijskom stadiju (lijeva ploča) i in vitro hipoksičnom predkondicioniranju lučećih stanica (desna ploča). Za detalje o miRNA pogledajte tablicu 1. (B) Dijagram raspršenosti korelacije između varijabilnosti (X os) i razine obogaćenja (Y os) stabilnih miRNA unutar fetalnih hAFS-EV (lijeva ploča) i perinatalnih hAFS-EV (desna ploča) prema visokom (žute točke), tamno (zelene točkice) i nisko (tamnoljubičaste točkice) obogaćivanje. Za pojedinosti o miRNA pogledajte tablicu 2. RPM: čitanja na milijun.

3. Rasprava

Zaostali odbačeni uzorci ljudske amnionske tekućine identificirani su kao vrijedan izvor stromalnih stanica s obećavajućim potencijalom u regenerativnoj medicini i inženjerstvu tkiva. Etička zabrinutost povezana s njihovom izolacijom je minimalna, jer se mogu dobiti ili iz ostataka uzoraka rutinske prenatalne probirne amniocenteze, tijekom II trimestra trudnoće (fetalni hAFS), ili iz amnionske tekućine odbačene kao klinički otpad u III trimestru planiranog carskog reza postupci (perinatalni hAFS). Posljednjih godina hAFS su predloženi kao potencijalni terapeutici za popravak i regeneraciju ljudskog tkiva s obzirom na ohrabrujuće dokaze dobivene iz eksperimentalnih modela bolesti. Zanimljivo je da su također predloženi za in utero terapiju fetalno-neonatalnih neuroloških bolesti; doista, pretkliničke studije sugerirale su da hAFS primijenjen prenatalno putem intraamnionske dostave štiti leđnu moždinu tijekom gestacije putem parakrine aktivnosti u štakorskom modelu mijelomeningokele [56-58], i smanjuje oštećenje izloženog crijeva kod eksperimentalne gastroshize glodavaca[59]. ]. Iz translacijske perspektive, in utero transplantacija hAFS mogla bi se zamijeniti davanjem najprikladnijeg pripravka njihovog sekretoma (hAFS-CM o hAFS-EVs).cistanche deserticola nuspojaveOva bi strategija omogućila brzu i pravovremenu intervenciju tijekom gestacije prevladavanjem ograničenja kanonske stanične terapije (tj. dugotrajne in vitro stanične ekspanzije) uz pružanje gotovih farmaceutskih formulacija spremnih za upotrebu.

Nedavni razvoj manje invazivnih prenatalnih dijagnostičkih tehnika mogao bi rezultirati smanjenjem postupaka amniocenteze u bliskoj budućnosti, zagovarajući tako perinatalni hAFS kao pristupačniju opciju. Unatoč tome, budući da su fetalni hAFS razvojno nezreliji, mogu imati učinkovitiji parakrini potencijal. Unutar ovog scenarija, ovdje smo usporedili fetalni i perinatalni c-KITt hAFS i usredotočili smo se na profiliranje njihovih frakcija sekretoma. Naglasili smo relevantne razlike koje treba uzeti u obzir za mogući klinički prijevod njihovog parakrinog kapaciteta.

U skladu s prethodnim neovisnim studijama, pokazujemo da gestacijski stadij nije utjecao na heterogenu morfologiju hAFS i njihov mezenhimalni antigenski profil [25,26]. Zatim smo procijenili parametre za koje je vjerojatnije da utječu na sekretornu i parakrinu aktivnost stanica izvan kanonskog stromalnog imunofenotipa. Posebno je nedavno pokazano da prisutnost CD146-pozitivne, CD107a-visoke subpopulacije unutar mezenhimskih progenitora koštane srži korelira s izvanrednom modulatornom i terapijskom parakrinom aktivnošću [47]. Ovdje smo otkrili da su i fetalni i perinatalni hAFS snažno karakterizirani ovim molekularnim potpisom koji podržava njihovu sekretornu moć s relevantnim translacijskim implikacijama. Štoviše, fetalni hAFS karakteriziran je neučinkovitim aerobnim metabolizmom, dok su zreliji perinatalni pokazali veću stopu potrošnje kisika i sintezu ATP-a. Ovo može upućivati ​​na nezreliji metabolički profil hAFS u drugom tromjesečju koji nalikuje stromalnim stanicama pupkovine nedonoščadi, koje su pokazale isti trend [60].

Kako bi se pokrenuo parakrini potencijal, hAFS su bili izloženi 24-satnoj hipoksijskoj pripremi bez seruma, strategiji koju smo prethodno uspješno razvili [34,35,37] za fetalne stanice i koju smo ovdje prvi put istražili na njihovom perinatalnom dvojniku. Prekondicioniranje fetalnog i perinatalnog hAFS pod hipoksijom rezultiralo je pozitivnim trendom povećanja njihove koncentracije sekretoma i količine otpuštenih EV, dok gestacijski stadij nije imao nikakav učinak na prinos staničnog sekretoma niti na morfologiju i distribuciju veličine EV.

Naime, karakterizacija hAFS parakrinog tereta otkrila je neke specifične razlike, u skladu s različitim uvjetima koje smo procijenili. Proteomsko profiliranje fetalnog hAFS sekretoma otkrilo je uočljive distribucije faktora temeljene na gestacijskom stadiju i predkondicioniranju stanične hipoksije. Ovo ukazuje na to da parakrini potencijal hAFS može steći poseban identitet tijekom sazrijevanja od Ⅱ do Ⅲ trimestra trudnoće koji se zauzvrat može modulirati stimuliranjem lučećih stanica in vitro. Analiza obogaćivanja bioloških procesa hAFS-CM i hAFS-EVs sugerira da većina moduliranih proteina može pridonijeti staničnom rastu/održanju i metabolizmu proteina, podupirući na taj način do sada prijavljene korisne parakrine učinke na stanice. Konkretno, ukupni sekretom hAFS hipoksičnog fetusa nađen je obogaćen proteinom toplinskog šoka HSPD1 (HSP60), za koji je dokazano da podupire zacjeljivanje rana u modelu ozljede kože dijabetičkog miša i promiče iskrivljenje makrofaga u M2 fenotip [61] . Isto tako, hipoksični fetalni hAFS-EV obogaćeni su čimbenicima koji promiču neurogenezu (HSPG2[62], samoobnavljanje stanica i razvoj mozga i kardiovaskularnog sustava (LAMA5[63]i LAMB1[64]i migracija (THBS1 [2]). Proteoglikan AGRN je također pronađen u EV nakon hipoksičnog primanja fetalnog hAFS.cistanche dosage redditNaša su otkrića u skladu s prethodnim dokazima o povećanju AGRN u proteomu mezenhimalnih stromalnih stanica pod upalnim i hipoksičnim instruktivnim podražajima [65]. Također se pokazalo da je AGRN uključen u signaliziranje imunološke sinapse [66] i da se slaže s regeneracijom srca novorođenčadi [67], čime podupire izraženu predispoziciju razvojno mladog fetalnog hAFS-a prema regenerativnim parakrinim učincima. Štoviše, potvrđeno je da fetalni hAFS bolje reagira na predkondicioniranje hipoksije kao što je pokazano obogaćivanjem prediktora vaskularne regenerativne učinkovitosti, kao što su ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8 i MCP-1 citokin[68], u njihov uvjetovani medij. Ovo podupire prethodne dokaze o parakrinoj snazi ​​fetalnog hAFS-CM u poticanju endogene neo-arteriogeneze u pretkliničkim modelima infarkta miokarda, ishemije stražnjih udova i ishemijskog fasciokutanog režnja kod glodavaca [34,69-71]Nadalje, fetalni hAFS Utvrđeno je da je ukupni sekretom znatno više obogaćen IGFBP2 i OPN-om u usporedbi s perinatalnim, što ukazuje na izraženiji modulatorni profil za rješavanje i usporavanje starenja [72-75]. Perinatalni have-CM, iako je bio manje pojačan u parakrinim čimbenicima, na sličan je način dopunjen neurotrofnim i imunomodulatornim čimbenicima, kao što su CST3[76,77] i MIF[78].

U usporedbi s ukupnim hAFS-CM, odgovarajuće hipoksične fetalne i perinatalne EV pandane pokazale su nižu ekspresiju citokina i kemokina, s iznimkom medijatora vaskularnog preoblikovanja EMMPRIN [79], koji je uglavnom bio obogaćen u odjeljku vezikula. Prethodno prijavljeni kardioaktivni i pro-regenerativni profil fetalnih hAFS-EV[34,37] ovdje je potvrđen dokazima o njihovoj isključivoj ekspresiji kardioprotektivnog IL-8 [80] i GDF-15, ključni parakrini čimbenik koji pokreće endogenu neurogenezu hipokampusa kod odraslih [81,82], kao i suzbijanje kardiotoksičnosti izazvane antraciklinima [78]. I fetalni i perinatalni hAFS-EV pokazali su sličnu ekspresiju za regulator trgovine progenitor/matične stanice SDF-1 [83-85]. Proteomska analiza je prijavila povećanu ekspresiju proteina povezanih s angiogenezom, poput NRP1 [86] i MP14[87]u hipoksičnim perinatalnim hAFS-EVs; takav stimulacijski profil može objasniti prethodne rezultate o endotelnim regenerativnim svojstvima hAFS-a u Ⅲ tromjesečju u predkliničkom mišjem modelu ishemijske ozljede skeletnih mišića [25], unatoč dokazima da je njihov hAFS-CM manje pro-angiogen od odgovarajućeg fetalnog. Značajno je da je neuralni faktor rasta BDNF pronađen iu fetalnom i u perinatalnom EV teretu, iako u malim količinama, što ukazuje na pretpostavljenu neurotrofičku aktivnost za hAFS-EV u preživljavanju neurona i neurorazvojnim procesima, kao što je također primijećeno za izvanstanične vezikule koje izlučuje ljudska kost srž i krv iz pupkovine-MSC[8889]. Pokazalo se da su obje formulacije sekretoma iz fetalnog i perinatalnog hAFS-a koji su podvrgnuti hipoksičkoj stimulaciji obogaćene PAI-1, pomagačem endotelne aktivacije [90] koji je također uključen u polarizaciju M2 makrofaga u srcu i obdaren kardioprotektivnim djelovanjem i antifibrotički potencijal [91].

MikroRNK (miRNK) se općenito smatra ključnim regulatorima parakrine aktivnosti matičnih stanica i mezenhimalnih stromalnih stanica EV [92,93]. Ovdje smo otkrili da 15 najobogaćenijih vrsta miRNA unutar hAFS-EV pokriva više od 60 posto ukupnog sadržaja miRNA u svakom uzorku. Prijavljeno je da ove miRNA karakteriziraju molekularni teret mezenhimalnih stromalnih stanica-EV (neka -7a-5p [4,95]), štite od ishemije miokarda utječući na vaskularnu regeneraciju i inhibirajući fibrozu (neka -7b-5p, neka-7f-5p, miR-21-5p i miR-155-5p [96,97]), promovirati zacjeljivanje rana reguliranjem funkcije keratinocita (miR-16-5p [98]) i sprječavanje smrti neurona nakon ishemije prednjeg mozga (miR-29a-3p [99,100]). S druge strane, oko 1000 miRNA pronađeno je u preostalih 30 posto sadržaja vezikularne miRNA. Takva neuravnotežena distribucija je u skladu s prethodnim studijama [4] i naglašava uglavnom obogaćene miRNA kao pretpostavljene odgovorne za glavnu biološku aktivnost hAFS-EVs. Zanimljivo je da fetalni i perinatalni hAFS-EV dijele većinu od 15 miRNA. Treba napomenuti da smo također primijetili da i fetalni hAFS-EV i perinatalni sadržavaju skup vrlo stabilnih miRNA na različitim razinama obogaćivanja. Takvi dokazi mogu sugerirati širok raspon kandidata za "domaćinstvo" koji bi se koristili kao interna referentna kontrola u qPCR eksperimentima na hAFS-EV. Štoviše, konzistentan podskup takvih stabilnih miRNA (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) dijeli se između dva gestacijska stadija i preklapa se s 15 uglavnom obogaćenih, sugerirajući još konstantnije ponašanje i pouzdan molekularni potpis prije razlučivanja ([96,{{45 }}]). Treba napomenuti da je nekoliko kandidata unutar takve osebujne jezgre nedavno prijavljeno kao referentne miRNA unutar neuroprotektivnih EV-ova dobivenih iz mezenhimskih stromalnih stanica izvedenih iz amnionske tekućine u drugom tromjesečju (miR-29a-3p i miR{{ 49}}str [95]). Ipak, također smo primijetili da gestacijska dob može modulirati teret miRNA više od hipoksičnog predkondicioniranja. Razvojno juvenilniji EV dobiveni iz fetalnih hAFS u III tromjesečju obogaćeni su miRNA za koje je prethodno dokazano da podržavaju održivost embrionalnih matičnih stanica (miR-302-3p [101]), staničnu proliferaciju i osteogenu diferencijaciju stromalnih stanica koštane srži (miR -217 [102]), dok također ima potencijal za supresiju tumora (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).

Na temelju naših rezultata, ovdje potvrđujemo da fetalni i perinatalni hAFS mogu predstavljati atraktivne parakrine izvore koji se mogu iskoristiti za regenerativnu medicinu. Dok su njihov fenotip i sekretorna aktivnost bili slični, istaknuli smo neke osebujne aspekte u njihovim formulacijama sekretoma kao korisne uvide za njihov budući terapeutski prijevod.

4. Materijali i metode

4.1.Izolacija matičnih stanica ljudske amnionske tekućine i kultura in vitro

Matične stanice ljudske amnionske tekućine (hAFS) izolirane su iz ostataka uzoraka amnionske tekućine (AF) prikupljenih rutinskim prenatalnim probirom amniocentezom u 3 tromjesečju (fetalni hAFS, f-hAFS) ili kao klinički otpad tijekom planiranog poroda carskim rezom tijekom 3 tromjesečja (perinatalni hAFS,p-hAFS) u Jedinici za prenatalnu dijagnostiku i perinatalnu medicinu, IRCCS bolnica San Martino, u Jedinici za fetalnu i perinatalnu medicinu i kirurgiju i Laboratoriju za humanu genetiku u bolnici IRCCS Istituto Gaslini (Genova, Italija). Informirani pisani pristanak dobiven je od svih donatora u skladu s ovlaštenjem lokalnog etičkog odbora (protokol PR428REG2015) i u skladu sa smjernicama Helsinške deklaracije. Uzorci fetalne AF u II tromjesečju dobiveni su od donorica prosječne dobi od oko 37,42±0,32 godine (n=15 u rasponu od 36-do 41 godine); uzorci perinatalne AF u 3 trimestru dobiveni su od darivateljice prosječne dobi od 34,25±1,31 godina (n=10 u rasponu od 26- do 42 godine). Fetalni i perinatalni hAFS dobiveni su iz uzoraka validiranih za normalan kariotip i izoliranih imunomagnetskim sortiranjem za c-KIT ekspresiju (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, Italija) iz adherentnih mezenhimalnih stromalnih stanica AF[16].dobrobiti ekstrakta cistanchec-KIT* hAFS uzgajani su u minimalnom esencijalnom mediju (MEM)-alfa s 15 posto FBS (fetalni goveđi serum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), 18 posto Chang B i 2 posto Chang C medija (Irvine Scientific , Santa Ana, CA, SAD) s 1 posto L-glutamina i 1 posto penicilina/streptomicina (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), u inkubatoru na 37 stupnjeva s 5 posto CO2 i 20 posto atmosfere Oz i uzgojeno do 5 prolaza in vitro prije nego što se koriste za izolaciju njihovog sekretoma.

4.2. Biokemijska procjena metabolizma hAFS

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) stanica korišteno je za svaki eksperiment. Za procjenu bazalne respiracije, hAFS su permeabilizirani s 0.03 mg/mL digitonina tijekom 10 minuta i suspendirani u fosfatnom puferu slane otopine (PBS). Dodano je 10 mM piruvata plus 5 mM malata ili 20 mM sukcinata da se stimulira put -putevi sastavljeni od Kompleksa I, II i IV odnosno Kompleksa Ⅱ i IV [60].

Kako bi se procijenili relativni doprinosi respiraciji glutamina, dugolančane oksidacije masnih kiselina i glukoze, nakon permeabilizacije digitonina, stanice su suspendirane u mediju za rast i 4 uM BPTES-a, 4 uM Etomoksira i 4 uM UK5{{22} }99 su dodani da inhibiraju glutaminazu, karnitin palmitoil-transferazu 1A (CPT1A), odnosno mitohondrijskog piruvatnog nosača (MPC). Aktivnost Fi-F.ATP sintaze (ATP sintaze) otkrivena je mjerenjem proizvodnje ATP-a visoko osjetljivom metodom luciferin/luciferaza. Ispitivanja su provedena na 37 stupnjeva 2 minute, a podaci su prikupljani svake 30 s. U prvom nizu eksperimenata, stanice od 10 stupnja inkubirane su 10 min u mediju koji je sadržavao 50 mM KCl, 1mMEGTA, 2mMEDTA, 5mMKH2PO4, 2mMMgC12, 0,6 mMouabain, 1 mM P1P5-Di (adenozin-5')penta-fosfat, 0,040 mg/mL ampicilina i 10 mM Tris-HCl pH 7,4. Nakon toga, sinteza ATP-a je inducirana dodatkom respiratornih supstrata (10 mM piruvata plus 5 mM malata ili 20 mM sukcinata) i 0,1 mM ADP. Reakcija je mjerena korištenjem kompleta za ispitivanje bioluminiscencije luciferin/luciferaza ATP CLSII (Roche, Basel, Švicarska) u luminometru (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milano, Italija) standardnim otopinama ATP (Roche, Basel, Švicarska) u rasponu {{ 42}}/M korišteno je za kalibraciju. U drugom nizu eksperimenata, sinteza ATP-a procijenjena je u prisutnosti 4 uM BPTES-a, 4 uM Etomoksira ili 4 uM UK5099. U ovom slučaju, 10 stanica je inkubirano 10 minuta u mediju za rast u odsutnosti ili prisutnosti inhibitor metabolizma, a sinteza ATP-a inducirana je s 0,1 mM ADP. Učinkovitost OxPhos (oksidativne fosforilacije) (omjer P/O) izračunata je kao omjer između koncentracije proizvedenog ATP-a i količine utrošenog kisika u prisutnosti respiratornog supstrata i ADP-a. Kada je potrošnja kisika potpuno posvećena proizvodnji energije, omjer P/O trebao bi biti približno 2,5 odnosno 1,5 nakon dodavanja piruvata i malata ili sukcinata [48] Kako bi se procijenio doprinos anaerobne glikolize metabolizmu hAFS-a, procijenjene su koncentracije glukoze i laktata u mediju za rast. Potrošnja glukoze procijenjena je sustavom spajanja heksokinaze (HK) i glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (G6PD), nakon redukcije NADP na 340 nm. Medij za ispitivanje sadržavao je 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM ATP, 10 mMNADP, 2 mMMgC12, 2 IU heksokinaze i 2 IU glukoza-6-fosfat dehidrogenaze. Oslobađanje laktata ispitano je nakon redukcije NAD plus na 340 nm. Medij za ispitivanje sadržavao je 100 mM Tris-HCl (pH 8), 5 mM NAD plus i 1 IU/mL laktat dehidrogenaze. Uzorci su analizirani prije i nakon dodavanja 4 ug pročišćene laktat dehidrogenaze. U oba slučaja podaci su normalizirani na broj stanica i izraženi kao mM glukoze/10 stupnjeva stanica odnosno mM oslobođenog laktata/10 stupnjeva stanica [107].

4.3. Karakterizacija hAFS protočnom citometrijom

Sto tisuća (105)fetalnih-i p-hAFS stanica je odvojeno i inkubirano s mišjim anti-humanim-CD107a-Alexa Fluor 647-i anti-humanim CD146-FITC- konjugirana protutijela (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija). Stanična apoptoza procijenjena je pomoću FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Italija) prema uputama proizvođača. Događaji su prikupljeni na razvrstivaču i analizatoru BD Bioscience FACS Aria II, opremljenom softverom FACS Diva (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milano, Italija). Podaci su analizirani pomoću softvera FlowJo V9.0 (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milano). , Italija). 4.4. Bojanje starenja

Fenotip starenja hAFS uzgojenog do pasaže 5 u standardnim in vitro uvjetima procijenjen je s kompletom za bojenje galaktozidazom Senescence (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD): f-hand p-hAFS su fiksirani s 1x otopinom fiksatora na 70 posto konfluentnost i obojena na SA- -gal na 37 stupnjeva preko noći, prema uputama proizvođača. Događaji starenja snimljeni su na mikroskopu Leica DMil (opremljen softverom Leica Acquire V3.4.4, Leica Microsystems, Milano, Italija) i procijenjeni kao postotak SA- -gal-pozitivnih stanica u odnosu na ukupni broj stanica po polju.

4.5. Odvajanje i koncentracija frakcija hAFS sekretoma

f-hAFS i p-hAFS uzgajani su 24 sata u mediju bez seruma (SF) u 1 postotnoj O2 hipoksiji naspram 20 postotne O2 normoksije (kontrola), od kojih je potonja korištena kao osnovna referenca. Ova strategija predkondicioniranja korištena je za pojačano otpuštanje bioaktivnih parakrinih čimbenika, kao što smo ranije objavili [34,35,37,49]. hAFS su uzgajani 24 sata u mediju bez seruma (SF) (Dulbeccov modificirani Eagleov medij s visokim sadržajem glukoze, DMEM, s 1 posto L-glutamina i 1 posto penicilina/streptomicina, sve od Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), pod normoksicom (20 posto O2 i 5 posto CO2 na 37 stupnjeva) ili hipoksičnim (1 posto O2 i 5 posto CO2 na 37 stupnjeva u CO2 inkubatorima CellXpert C170i i Galaxy 48R, iz Eppendorfa, Milano, Italija) uvjetima.

f-hAFS-CM i p-hAFS-CM sakupljeni su i centrifugirani na 4 stupnja na 300x g tijekom 10 minuta i 2000× g tijekom 20 minuta kako bi se uklonili ostaci stanica; hAFS-CM je koncentriran korištenjem ultrafiltracijskih membrana sa 3kDa selektivnim odsiječenjem (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Njemačka) na 4 stupnja na 3000× g tijekom 90 minuta i zatim dalje koncentriran na 4 stupnja na 3000× g tijekom 30 min. hAFS-EV su odvojeni i koncentrirani serijskim ultracentrifugiranjem iz hAFS-CM. Ukratko, hAFS-CM je sakupljen i centrifugiran na 4 stupnja pri 300 x g tijekom 10 minuta i 2000 x g tijekom 20 minuta kako bi se uklonili ostaci stanica. Supernatant je zatim obrađen na 10,000 x g tijekom 40 minuta. Talog je odbačen, a supernatant je dalje obrađen ultracentrifugiranjem u Optima L-90K (Beckmann Coulter, Milano, Italija) na 10 000 × g tijekom 120 minuta korištenjem Beckman Coulterovih rotora centrifuge SW55Ti s okretnom kantom. Talog koji je sadržavao heterogene hAFS-EV ispran je u PBS uz konačno centrifugiranje na 100,000 x g tijekom 120 minuta i zatim resuspendiran u PBS filtriran s 0,22 um pora filter membrane. Koncentracije proteina u hAFS-CM i na površini hAFS-EVs izmjerene su korištenjem BiCinchoninic Acid (BCA) testa (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija). Uzorci su dobiveni na Gen5 čitaču mikropločica na 570 nm kako bi se procijenio prinos hAFS-CM i hAFS-EVs u smislu ug otopine/10 stupnjeva koje proizvode stanice.

4.6. Karakterizacija hAFS-EVs transmisijskom elektronskom mikroskopijom i analizom praćenja nanočestica

Analiza transmisijske elektronske mikroskopije (TEM) provedena je na Hitachi TEM mikroskopu (serija HT7800, Hitachi High Technologies, Monza, Italija). Digitalne slike snimljene su kamerom Mega view 3 i softverom Radius (EMSIS, Muenster, Njemačka). f-hAFS i p-hAFS su fiksirani u 3,7 postotnoj otopini paraformaldehida (PA) razrijeđenoj 1:1 s hAFS potpunim medijem, isprani u 0.1 M kakodilatnom puferu, a zatim odmah inkubirani 1 h na sobnoj temperaturi u 0,1 M kakodilatni pufer koji sadrži 2,5 posto glutaraldehida (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, SAD). Kuglice stanica su naknadno fiksirane u osmij tetroksidu tijekom 1 sata iu 1 postotnoj otopini uranil acetata tijekom 1 sata. Uzorci su dehidrirani 24 h na 42 stupnja i 48 h na 60 stupnjeva kroz seriju stupnjevanog etanola i umetnuti u epoksidnu smolu (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Njemačka). Ultratanki rezovi (50 nm) izrezani su mikrotomom Leica Ultracut (Leica Microsystems, Milano, Italija) i obojeni 5-postotnim uranil acetatom u 50-postotnoj otopini etanola. f-hAFS-EV i p-hAFS-EV resuspendirani su u 20 uL PBS otopine i fiksirani dodavanjem jednakog volumena 2 posto paraformaldehida u 0,1 M otopini fosfatnog pufera (pH 7,4). EV su zatim adsorbirani 10 minuta na bakrene rešetke obložene formvar-ugljikom plutajući rešetke na kapi od 5 μL na parafilmu. Zatim su rešetke s prianjajućim EV-ima isprane u PBS-u i negativno obojene 2-postotnom otopinom uranil acetata tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Obojane rešetke umetnute su u 2,5 posto metilceluloze radi boljeg očuvanja i osušene na zraku prije ispitivanja. Morfometrijska analiza hAFS-EV izmjerena je na 10 nasumično snimljenih mikrofotografija pri povećanju od 40.000× g. Veličina je izračunata pomoću funkcije proizvoljne linije ugrađene u dijaloški okvir mjerenja softvera Radius (EMSIS, Muenster Njemačka). Kako bi se vizualizirala distribucija veličine hAFS-EV, rezultati su iscrtani kao dijagram s raspršenim točkama i kao distribucija frekvencije u kojoj je svaka veličina predstavljena kao točka zajedno s linijama za srednju vrijednost i raspon.

f-hAFS-EV i p-hAFS-EV također su analizirani analizom praćenja nanočestica (NTA) kako bi se procijenile čestice koje oslobađaju stanice od 10 stupnjeva. hAFS-EV su razrijeđeni 1:100 u PBS otopini i snimljeni na NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, UK) koji je zabilježio najmanje 3 različita okvira od po 60 s. Tri različita preuzimanja svakog uzorka analizirana su pomoću opcije Batch Process u softveru. 4.7.LC-MS/MS analiza hAFS-CM i hAFS-EVs 4.7.1. Digestija u otopini

Proteomska analiza provedena je na 3 biološka replika hAFS-CM i hAFS. EV iz f-hAFS i p-hAFS nakon normoksičnog ili hipoksičnog predkondicioniranja (n=24 različitih uvjeta). Uzorci hAFS-CM i hAFS-EVs suspendirani su u 0.1M NHCO3 pH 7,9 i tretirani s RapigestIM SF reagens (Waters Co, Milford, MA, SAD) u konačnoj koncentraciji od 0.25 posto (w/v). Rezultirajuće suspenzije su inkubirane uz miješanje na 100 stupnja 2{{40}} min. Digestija je provedena na svakom uzorku dodavanjem tripsina modificiranog stupnja sekvenciranja (Promega Inc, Madison, WI, SAD) pri omjeru enzim/supstrat od 1:50 (w/w) preko noći na 37 stupnjeva u 0,1 M NH4HCO3 pH 7,9 pufer s 10 posto CHSCN. Ujutro je dodan dodatni alikvot tripsina (1:100 w/w) i probava je nastavljena 4 sata. Štoviše, dodavanje 0,5 posto trifluorooctene kiseline (TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, SAD) zaustavilo je enzimsku reakciju, a naknadna inkubacija na 37 stupnjeva tijekom 45 minuta dovršila je RapiGest kiselinsku hidrolizu[108]. Produkti razgradnje koji se ne miješaju s vodom uklonjeni su centrifugiranjem na 13.000 okretaja u minuti tijekom 10 minuta. Konačno, mješavine triptičnog digesta su odsoljene korištenjem PierceTM C-18 spin kolona (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), prema protokolu proizvođača, i resuspendirane su u 0,1 posto mravlje kiseline (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, SAD) u vodi (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, SAD) u koncentraciji od 0,1 ug/μL.

4.7.2.Tekućinska kromatografija

Smjese digestirane tripsinom analizirane su pomoću platforme koja se sastoji od nano-tekućinskog kromatografskog sustava, Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D System (Eksigent, dio AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, SAD) konfiguriranog u načinu rada zamke-eluiranja, zajedno s masenim spektrometrom visoke rezolucije. Ukratko, uzorci (0.8 ug ubrizgano) prvo su napunjeni na peptidnu zamku (200 um × 500 um ChromXP C18- CL,3 um,120 A) i isprana pumpom za punjenje koja radi u izokratskom načinu rada s 0,1 posto mravlje kiseline u vodi 10 minuta pri protoku od 3 μL/min. Automatsko prebacivanje ventila s deset otvora zatim je eluiralo zarobljenu smjesu na stupcu nano-reverzne faze (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL, 3 um, 120 A) kroz 150 min gradijenta eluensa B (eluens A, 0,1 posto mravlja kiselina u vodi; eluens B, 0,1 posto mravlja kiselina u acetonitrilu) pri brzini protoka od 300 nL/min. U dubini, gradijent je bio: od 5-10 posto Bin 3 min, 10-40 posto Bin 130 min, 40-95 posto Bin 10 min i držanje na 95 posto B 7 min. 4.7.3. Masena spektrometrija

MS/MS analize provedene su na LTQ-OrbitrapXL masenom spektrometru (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija) opremljenom ionskim izvorom nanospreja. Napon kapilare spreja postavljen je na 1,7 kV, a temperatura kapilare za prijenos iona održavana je na 22 0 stupnja. Puni MS spektri snimljeni su preko 400-1600 m/z raspona u modu pozitivnih iona, sa snagom razlučivosti od 60000 (puna širina na pola maksimuma) i brzinom skeniranja od 2 spektra/s. Nakon ovog koraka uslijedilo je pet MS/MS događaja niske rezolucije koji su sekvencijalno generirani na način ovisan o podacima na prvih pet iona odabranih iz punog MS spektra (pri 35 posto energije sudara), korištenjem dinamičkog isključenja od 0,5 min za MS/MS analiza. Funkcije skeniranja masenog spektrometra i gradijenti otapala za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti kontrolirani su podatkovnim sustavom Xcalibur verzije 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija).

4.7.4.Proteomska obrada podataka i rudarenje podataka

Svi generirani podaci pretraženi su pomoću tražilice Sequest HT koja se nalazi u softveru Thermo Scientific Proteome Discoverer, verzija 2.1. Eksperimentalni MS/MS spektri povezani su sa sekvencama triptičkih peptida usporedbom s teorijskim masenim spektrima dobivenim in silico digestijom baze podataka Uniprot Homo Sapiens proteoma (74600 unosa), preuzetih 2. siječnja 020 (www.uniprot.org, pristupljeno 10 2. ožujka021.). Sljedeći kriteriji korišteni su za identifikaciju peptidnih sekvenci i srodnih proteina: tripsin kao enzim, tri propuštena cijepanja po peptidu, tolerancije mase od ±50 ppm za ione prekursore i ±0,8 Da za ione-fragmente. Čvor perkolatora korišten je sa strategijom cilja-varalice kako bi se dobila konačna stopa lažnog otkrivanja (FDR) na razini podudaranja peptidnog spektra (PSM) od 0,01 (striktno) na temelju q-vrijednosti, uzimajući u obzir maksimalni deltaCN od 0,05 [109]. Razmatrani su samo peptidi s minimalnom duljinom peptida od šest aminokiselina i rangom 1. Primijenjeni su principi grupiranja proteina i stroge štedljivosti. MS podaci pohranjeni su u ProteomeXchange Consortium putem PRIDE [10]partnerskog repozitorija (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, pristupljeno 10. ožujka 2021.) 48 proteina dobivenih iz algoritma SEQUEST je poravnato, normalizirano , i bez naljepnica u usporedbi. Interni algoritam, naime, Multidimensional Algorithm Protein Map (MAProMa) korišten je za ovaj cilj, koristeći prosječne podudaranja spektra peptida (aPSM) [111,112] koji odgovaraju prosjeku svih spektara identificiranih za protein i, posljedično, , na njegovu relativnu brojnost, u svakom analiziranom stanju. Detaljno, kako bi se odabrali različito eksprimirani proteini, podskupine (i za fetalne u odnosu na perinatalne-hAFS-CM i hAFS-EV, uzimajući u obzir i stimulaciju predkondicioniranja hipoksičnih stanica), uspoređivane su u parovima primjenom praga od 0,4 i 5 na dva MAProMa indekse DAve (Differential Average) i DCI (Differential Confidence Index), redom. DAve, koji procjenjuje promjene u ekspresiji proteina, definiran je kao (XY)/(X＋Y)/0,5, dok je DCI koji procjenjuje pouzdanost diferencijalne ekspresije definiran kao (X plus Y)×(XY)/2 X i Y izrazi predstavljaju PSM danog proteina u dva uspoređena uzorka. Osim toga, popisi prosječnih proteina, dobiveni iz svakog ispitanog stanja, podvrgnuti su linearnoj diskriminantnoj analizi (LDA), a proteini s najvećim F omjerom (Većim ili jednakim 4,5) i najmanjom p-vrijednošću (Manjim ili jednakim 0,001) zadržani su i obrađeni hijerarhijskim klasteriranjem, primjenom Wardove metode i metrike Euklidove udaljenosti korištenjem softvera JMP 15.2. Konkretno, F omjer je predstavljao srednji kvadrat modela podijeljen sa srednjim kvadratom pogreške, dok je p-vrijednost ukazivala na vjerojatnost dobivanja F vrijednosti veće od one izračunate ako, u stvarnosti, nije bilo razlike između srednjih vrijednosti grupe stanovništva. 4.8. Profiliranje citokina i kemokina hAFS-CM i have-EV

Profiliranje citokina i kemokina hAFS-CM i have-EV dobivenih pomoću f-hAFS i p-hAFS nakon hipoksičnog predkondicioniranja procijenjeno je pomoću kompleta Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array (R&D System, Minneapolis, MN, SAD) prema upute proizvođača. Korišteno je dvadeset ug uzoraka hAFS-CM i hAFS-EVs. Slike membrana dobivene su Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge, UK) Specifični sadržaj citokina/kemokina procijenjen je kvantifikacijom intenziteta pozitivnog piksela (pomoću proizvoljne jedinice) za svaki detektabilni citokin pomoću softvera ImageJ (dostupnog na https: //imagej.nih.gov/ij/, pristupljeno 10. ožujka 2021. [13]). 4.9. Ekstrakcija RNK iz hAFS-EV i Dalje

Sekvenciranje generacija

RNA je izolirana iz f-hAFS-EV i p-have-EV s miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Milano, Italija) prema uputama proizvođača. Integritet RNA i raspodjela veličine procijenjeni su pomoću Agilent Small RNA Kita s malim nekodirajućim RNA čipom kako bi se procijenio sadržaj malih RNA u rasponu od 6 do 150 nukleotida (nt). Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija) korišten je za kvantificiranje sadržaja mikroRNA (miRNA), prema uputama proizvođača. Biblioteke za sekvenciranje miRNA pripremljene su i umnožene korištenjem kompleta QIAseq miRNA Library (Qiagen, Milano, Italija) korištenjem 18,5 ng izoliranih miRNA kao ulaznih podataka i prema uputama proizvođača. Knjižnice su objedinjene nakon što je TapeStation (Agilent Technologies, Foster City, CA, SAD) izvršio provjeru kvalitete i kvantificiranje koristeći Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. Skupljene biblioteke procijenjene su za kontrolu kvalitete qPCR-om u stvarnom vremenu u skladu s Vodičem za kvantificiranje qPCR biblioteke sekvenciranja (Illumina Inc, San Diego, CA, SAD) i sekvencirane platformom Illumina NextSeq koristeći High Output Hit v2.5 (75 ciklusa) ( Illumina Inc, San Diego, CA, SAD). Pozivanje baze izvedeno je sa zadanim tijek rada Illumina NextSeq500.

4.10. Bioinformatska analiza podataka sekvenciranja miRNA

Datoteke Fastq prvo su obrađene rezanjem 3' adaptera i baza niske kvalitete pomoću Cutadapta [114]. Nakon podrezivanja identificirane su sekvence umetaka i UMI sekvence. Čitanja bez adapterske sekvence, čitanja s manje od 16 bp umetnutih sekvenci i čitanja s manje od 10 bp UMI sekvenci su odbačena. Kako bi se označile umetnute sekvence, očitanja su bila usklađena sa sklopom ljudskog genoma GRCh38 pomoću leptir mašne [15] Za svaki uzorak izbrojana su sva očitavanja dodijeljena određenoj miRNA, a pridruženi UMI-ji su agregirani za brojanje jedinstvenih molekula. Sekundarna analiza izvršena je prilagođenim R skriptama dostupnim na razuman zahtjev. Analiza diferencijalnog obogaćivanja provedena je pomoću Limma [116] i EdgeR Bioconductor paketa [117].

4.11. Statističke analize

Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ±sem najmanje tri (n{{0}}) neovisna eksperimenta. Usporedbe su napravljene jednosmjernom ANOVA praćenom posthoc Tukeyevim testom višestrukih usporedbi ili Studentovim t-testom. Analize su provedene pomoću Graph-Pad Prism Version 8.0.2 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, pristupljeno 10. ožujka 2021.) sa statističkom značajnošću postavljenom na* p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

U zaključku, utvrđeno je da su fetalni i perinatalni hAFS fenotipski ekvivalentni s usporedivom sekrecijskom snagom i EV obogaćenjem u veličini i distribuciji; ipak se mogu uvažiti neke razlike u njihovom profilu sekretoma. Točnije, razvojno nezreli profil fetalnog hAFS-a može se rekapitulirati njihovim formulacijama sekretoma obdarenih izraženijim pro-vaskulogenim, pro-regenerativnim i pomlađujućim sekretomom. Međutim, perinatalni hAFS i dalje zadržava relevantan parakrini profil putem ekspresije čimbenika povezanih s migracijom endotelnih stanica, imunomodulatornim, protuupalnim i neurotrofnim potencijalom sličnim fetalnom hAFS. Ova otkrića mogu pružiti korisne uvide koji podupiru buduću parakrinu terapiju bolesti povezanih s ozljedama i upalnih/ishemičnih bolesti. Stoga bi se odabir bilo fetalnog ili perinatalnog hAFS-a kao najidealnijeg izvora stanica trebao ocijeniti uzimajući u obzir specifičan klinički scenarij.

Ovaj je članak izvađen iz Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms