Kako kalcij liječi oštećenje bubrega izazvano luoridom?

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Ključne riječi: Kalcij, Bubreg, Apoptoza

SAŽETAK

Dugotrajno prekomjerno uzimanje fluorida (F) može uzrokovati koštana i nekoštana oštećenja. Thebubregje glavni organ za izlučivanje fluorida u tijelu. Ovo je istraživanje imalo za cilj istražiti je li dijetetskikalcijsuplementacija može ublažitibubregoštećenja uzrokovana fluorozom i dodatno istražiti učinkeKalcijo mehanizmu ublažavanjabubregćelijaapoptozapokrenuo F. Procijenili smo histopatološku strukturu,bubregpokazatelji funkcije i razine ekspresije gena i proteina smrti posredovane receptorimaapoptozaputeva kod štakora Sprague Dawley (SD) tretiranih natrijevim fluoridom (NaF) i/ilikalcijkarbonata (CaCO3) 120 dana. Rezultati su pokazali da je 100 mg/L NaF izazvalobubreghistopatološka ozljeda iapoptoza, povećao koncentracije kreatinina (CRE), mokraćne kiseline (UA), dušika uree u krvi (BUN), kalija (K), fosfora (P) i F (p < {{0}}).05)="" ,="" te="" smanjuju="" razinu="" serumskog="" magnezija="" (mg)="" (p="">< 0,05).="" štoviše,="" naf="" je="" povećao="" razinu="" ekspresije="" mrna="" i="" proteina="" fas="" receptora="" stanične="" smrti="" (fas),="" faktora="" nekroze="" tumora="" (tnf),="" povezanog="" s="">apoptoza-inducirajući ligand (TRAIL), kaspaza 8, kaspaza 3 i poli ADP-riboza polimeraza (PARP) (p < 0.01),="" koji="" su="" konačno="" aktivirali="" put="" receptora="" smrti.="">Kalcijsuplementacija je preokrenula pad razina CRE, BUN, UA, F i P izazvan F, ublažila histopatološka oštećenja iapoptoza, i smanjio razinu ekspresije gena i proteina markera povezanih s putevima receptora smrti. Zaključno, 1 postoKalcijublažava F-induciranbubregapoptozakroz FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL signalne putove.

Thebubregje glavni organ za izlučivanje fluorida u tijelu,cistanchemože zaštititibubregi poboljšatibubregfunkcija.

Uvod

Fluor je široko prisutan u tlu, vodi i hrani. Međutim, neki prirodni čimbenici (trošenje minerala i stijena, nastanakkalciji magnezijeve soli, infiltracija podzemnih voda itd.) i ljudske aktivnosti (industrijske otpadne vode, agrokemikalije, kućanski proizvodi itd.) uzrokuju onečišćenje okoliša fluorom (Daiwile et al., 2019). Trenutno je najveći čimbenik izloženosti fluoridu (F) pitka voda, a preporučena koncentracija F u pitkoj vodi od strane Svjetske zdravstvene organizacije je manja od 1,5 mg/L (Guidelines for Drinking-Water Quality, 2017). Epidemiološki dokazi upućuju na to da koncentracije veće od ove povećavaju rizik od dentalne fluoroze, a sve veća koncentracija će povećati rizik od fluoroze kostura (Guidelines for Drinking-Water Quality, 2017; National Research Council, 2006). Dugotrajno izlaganje visokim koncentracijama fluorida može povećati tjelesnu apsorpciju fluora putem dišnih puteva.

i probavnog trakta. Pretjerani unos F može uzrokovati oštećenje koštanih i nekoštanih organa u tijelu. Oštećenje mekog tkiva izvan kosti općenito se naziva nekoštano oštećenje. Trenutno je utvrđeno da oštećenje nekoštanog tkiva uzrokovano F uključuje probavni trakt, jetru,bubreg, mozak itd. (Jha i sur., 2011.; Perumal i sur., 2013.).

Thebubreg, glavni organ za izlučivanje u tijelu, odgovoran je za metabolizam toksičnih tvari i egzogenih toksina u tijelu. Studije su pokazale da se oko 50-80 posto fluorida unesenog u tijelo filtrira i ponovno apsorbira.bubrega, a preostali fluor se akumulira u drugim tkivima i organima (Chen i sur., 2013.; Dharmaratne, 2019.). Mnoge vrste literature pokazale su da izloženost 50 i 100 mg/LF može dovesti do povećanja šupljine bubrežne kapsule, atrofijebubregtubuli, nepravilan raspored papilarnih stanica, sužavanje lumena, što rezultiraapoptozaodbubregstanica i pogoršanje biokemijskih funkcija kao što su kreatinin (CRE), mokraćna kiselina (UA),kalcij(Ca) i fosfor (P) (Song i sur., 2014.; HW Wang i sur., 2020.; Wei i sur., 2018.a).

Apoptoza, vrsta stanične smrti kontrolirane genima, koja se dijeli na endogenuapoptozai egzogeniapoptoza. Nedavna izvješća su to pokazalaapoptozauzrokovan visokim F uglavnom uključuje puteve posredovane mitohondrijima, endoplazmatskim retikulumom posredovane stresom i puteve posredovane receptorima smrti (Wei et al., 2018a). Prethodni eksperimenti u našoj skupini ukazali su da NaF inducira kosti i jetruapoptozaputem unutarstaničnog endoplazmatskog retikuluma (ER) i mitohondrijskog puta (Li i sur., 2021.; J. Wang i sur., 2020.; Wang i sur., 2019.). Osim toga, studije su također pokazale da je mitohondrijski put uključen u NaF-induciranapoptozaod mišabubrega(Wei i sur., 2018.b). Međutim, ne postoji sustavna studija o putu posredovanom receptorom smrti kod F-induciranogbubregapoptoza. Put receptora smrti dominira svakom fazom egzogenogapoptoza, uključujući put Fas receptora stanične smrti (FAS), put faktora nekroze tumora (TNF) i put povezan s TNF-omapoptoza-inducirajući ligand (TRAIL) put (Grunert i sur., 2012.; Lu i sur., 2017.; Wang i Su, 2018.). FAS put je primitivni sustav prijenosa signala koji posredujeapoptoza. FAS ima karakteristike membranskog receptora i formira trimer nakon vezanja s FAS ligandom (FAS-L). Zatim se specifična domena trimera veže s domenom smrti (DD) odgovarajuće molekule koneksina FAS-povezane s proteinom domene smrti (FADD) kako bi se formirao signalni kompleks izazvan smrću (DISC) (Wang i Su, 2018.). U sljedećem procesu transdukcije biološkog signala, FADD može aktivirati Caspase 8 i Caspase obitelj u isto vrijeme, i na kraju dovesti doapoptozasudjelovanjem kaspaze 3 i učinka poli ADP-riboza polimeraze (PARP) (Kischkel i sur., 2000.; Meynier i Rieux-Laucat, 2019.). Nedavne studije su pokazale da put FAS posredujeapoptozau T stanicama i tijekombubregneuspjeh izazvan cisplatinom (Djiadeu i sur., 2017.; Linkermann i sur., 2011.). Osim toga, studija je također izvijestila da NaF izazivaapoptozakod miševa kroz FAS put (Sun i sur., 2017.). TRAIL je priznati citokin u superobitelji TNF-a. Veže se na svoje homologne agonističke receptore, odnosno receptore smrti (DR4 i DR5). Postoji DD u njegovoj staničnoj regiji. DD je neophodan za regrutiranje adaptivnog proteina FADD. FADD zauzvrat inducira otpuštanje kaspaza u citoplazmu, aktivirana kaspaza 3 cijepa PARP i inhibira njegov potencijal popravka DNK, što rezultiraapoptoza(Bodmer i sur., 2000.; Micheau, 2018.). Pretpostavlja se da je put TRAIL/DR5 uključen u NaF-induciranapoptozakod miševa (Song i sur., 2021.). Osteoprotegerin (OPG) je slobodni topljivi receptor koji nema transmembransku domenu. Može obuzdati posredovanje TRAIL-omapoptozainhibicijom vezanja TRAIL-a i drugih receptora smrti (Duiker i sur., 2006.; Kiraz i sur., 2016.; Micheau, 2018.). Vezanje TNF-a i TNF receptora (TNF-R1) može aktivirati regrutiranje proteina domene smrti povezane s TNFR-om (TRADD) kroz njegov DD. Nakon toga, TRADD stupa u interakciju s FADD-om, što dovodi do regrutiranja pro-kaspaze 8, koja se proteolitičkim enzimima cijepa u aktivnu kaspazu 8. Kaspaza 8 zatim aktivira kaspazu 3, koja je odgovorna za stanicuapoptoza(Kiraz i sur., 2016.; Sedger i McDermott, 2014.). Objavljeno je da NaF inducira hepatociteapoptozakod miševa kroz signalni put TNF-R1 (Lu i sur., 2017.)

Kalcijigra različite uloge u sastavu kostiju i zuba, a također može kontrolirati prijenos živaca i oslobađanje materijala (Cao et al., 2016), sudjeluje u sustavnomkalcijhomeostaze (Carmeliet i sur., 2003.; Yang i sur., 2016.), mijenjaju propusnost membrane (Lappe i sur., 2017.), aktiviraju lučenje niza enzima i hormona (Kim i sur., 2012.) itd. Mnoge prethodne studije otkrile su da F i Ca imaju antagonistički učinak u biologiji (Dure-Smith i sur., 1996.; Nobrega i sur., 2019.). Nakon što tijelo apsorbira F, on će ući u krv i formirati netopljive taloge CaF2. Ako je opskrba Ca hranom nedovoljna i Ca u krvi ne dosegne potrebnu razinu, doći će do patoloških promjena kao što su hipokalcemija i osteoliza, stoga dodatak prehrani Ca ima važnu ulogu u prevenciji i poboljšanju fluoroze (Dure-Smith i dr. sur., 1996.; Li i sur., 2021.; Yang i sur., 2021.). Naša grupa je potvrdila da dijetetskikalcijmože ublažitiapoptozakostiju i jetre kroz signalni put PI3K-AKT, ER put i mitohondrijski put (Li i sur., 2021; J. Wang i sur., 2020; Wang i sur., 2019; Yang i sur., 2021). Kako bi se dodatno dokazalo da liKalcijsmanjuje nefrotoksičnost F preko receptora smrti posredovanogapoptozaPutem smo uspostavili štakorski model prehrane s visokim udjelom fluoridakalciji ocijenilibubregindeks ozljede, stupanj ozljedeapoptoza, i promjene gena markera i ekspresije proteina u smrti posredovane receptoromapoptozaput.

Materijali i metode

Kemikalije i instrumenti

Destiliranu vodu pripremio je sustav za pročišćavanje vode Heal Force (Shanghai, Kina). Pufer za lizu radioimunoprecipitacijske analize (RIPA) i natrijev fluorid (NaF) osigurao je Sigma-Aldrich (Šangaj, Kina). 10-postotni formalin, glicin, natrijev dodecil sulfat (SDS), TRIS, fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF), CaCO3, nitrocelulozna (NC) membrana, pribor za bicinhoninsku kiselinu (BCA) i pribor za bojenje hematoksilin-eozinom (H&E) nabavljeni su od tvrtke Solarbio Technology Co. ., Ltd. (Peking, Kina). Trizol reagens je nabavljen od Takara Biological Engineering Company (Dalian, Kina). Kompleti CRE, UA, uree u krvi (BUN), magnezija (Mg), P i kalija (K) kupljeni su od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina). In situapoptozakomplet za detekciju, FAS zečje poliklonsko antitijelo (BA0484) i FAS-L zečje poliklonsko antitijelo (PB0042) kupljeni su od Boster Biotechnology (Wuhan, Kina). -aktin zečje poliklonsko antitijelo (20536-1-AP), FADD zečje poliklonsko antitijelo (14906-1-AP), kaspaza 8 zečje poliklonsko antitijelo (13423-1-AP), kaspaza 3 zečje poliklonsko antitijelo ({{9 }}AP) i HRP konjugirani Affinipure kozji anti-zečji IgG(H plus L) (SA00001–2) nabavljeni su od Proteintech Group (Wuhan, Kina). TRAL zečja poliklonska protutijela (bs-1214R), TNF alfa zečja poliklonska protutijela (bs2081R), PARP zečja poliklonska protutijela (bs-55164R) kupljena su od Biossa (Peking, Kina). Elektrokemijska luminiscencija (ECL) i 3,3'-diaminobenzidin (DAB) kupljeni su od KeyGen Biotech (Jiangsu, Kina). PrimeScript® RT Master Mix i SYBR® Premix Ex Taq™ II Kit osigurao je Promega Biotechnology (Peking, Kina).

Životinje i tretmani

Četrdeset zdravih {{0}}tjedno starih mužjaka Sprague-Dawley (SD) štakora (120 ± 20 g) dobiveno je iz Centra za eksperimentalne životinje Medicinskog sveučilišta Shanxi (Shanxi, Kina). Štakori su aklimatizirani tjedan dana, nasumično podijeljeni u četiri skupine (10 štakora po skupini): kontrolna skupina (C), skupina NaF (F), skupina NaF plus 0,5 posto CaCO3 (F plus 0,5 posto Ca), NaF plus 1 posto CaCO3 skupina (F plus 1 postoKalcij) i tretirani kao u Tablici 1. Svi štakori su bili smješteni u plastičnim kavezima na 22-25 ◦C (55 ± 5 posto vlažnosti, 12 h ciklus svjetlo/tama), hrana i voda za piće su slobodno dostupni.

Nakon 17 tjedana uzgoja, štakori su postili 24 sata, a voda je bila besplatna za piće. Zatim su štakori anestezirani natrijevim pentobarbitalom i žrtvovani dislokacijom cerviksa nakon što je krv prikupljena iz očnih jabučica. Nešto krvi prikupljeno je epruvetama koje sadrže antikoagulans heparin natrij za BUN test. Dio krvi stavljen je u uobičajene epruvete, stavljen na sobnu temperaturu 2 h, a zatim centrifugiran na 3000 okretaja u minuti 10 minuta kako bi se odvojio serum. Serum je odvojen za CRE, UA, Mg, P, K i F testove. Osam uzorakabubregaiz svake skupine nasumično su odabrani i brzo zamrznuti u tekućem dušiku, a zatim pohranjeni na -80 ◦C za qRT-PCR i Western blotting eksperimente. Ostali uzorcibubregafiksirani su u 10 postotnom formalinu za histopatološki pregled i eksperimente dUTP nick end označavanja (TUNEL) posredovanog terminalnom deoksinukleotidil transferazom. Sve eksperimentalne operacije povezane sa životinjama strogo su provedene prema propisima Institucije za skrb o životinjama i Odbora za korištenje Poljoprivrednog sveučilišta Shanxi, Shanxi, Kina.

Bubregkoeficijent

Prvo su izvagani štakori; ondabubregtkivo je uklonjeno i izvagano. Thebubregkoeficijent je dobiven sljedećom formulom.

Bubregkoeficijent=[bubregmokra težina (g) / tjelesna težina (g)] ×100 posto.

Histopatološki pregled

Bubreguzorci su bili utopljeni u parafin. Sekcija (5 μm debljine) odbubregobojan je H&E. Zatim su stakalca promatrana svjetlosnim mikroskopom (Olympus, Tokyo, Japan). Ozbiljnostbubregozljeda je ocijenjena histopatološkim rezultatom.Bubregtubularna ozljeda se definira kaobubregtjelešca su atrofirana i deformirana,bubregšupljina kapsule proširena,bubregtubuli koji tvore odljev, a epitelne stanice otpadaju. Pri povećanju od 200 puta, korišteni su sljedeći kriteriji za procjenu stupnja ozljede jetre. 1: 0–25 posto štete; 2: 25–50 posto štete; 3: 50–75 posto štete; 4: 75-100 posto oštećenja (Baranova i sur., 2016.).

Određivanjebubreg-povezani pokazatelji

Razina F izmjerena je elektrodom specifičnom za F ion (Quadri et al., 2018.). Razine CRE, UA, BUN, Mg, P i K izmjerene su korištenjem komercijalno dostupnih kitova. Svi povezani postupci izvedeni su prema uputama proizvođača.

Otkrivanjeapoptozarazina prema TUNEL-u

Kako bi se kvantificiraloapoptozaububregstanica, eksperimentalna analiza je provedena korištenjem situapoptozakomplet za otkrivanje. Thebubregsekcije su deparafinizirane i zatim podvrgnute probavi pomoću proteinaze K. Terminalna deoksinukleotidil transferaza može obilježiti dUTP obilježen digoksinom (DIG-dUTP) do 3'-OH kraja, a DIG-dUTP se veže na točku prekida DNK nakon reakcije s biomarkerom anti -kopati-biotin. Zaslon je dodan u kombinaciji s DAB-om. Za vizualizaciju

sve jezgre, rezovi su obojeni hematoksilinom. Tamno smeđi signali označavaju pozitivne stanice, a plavi označavaju stanice koje ne reagiraju. Theapoptozaindeks je izračunat prema sljedećoj formuli.

Udio apoptotičkih stanica=(broj apoptotičkih stanica po čvoru / ukupan broj stanica po čvoru) × 100 posto.

Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu (qRT-PCR)

Ukupna RNA izbubregje ekstrahiran korištenjem Trizol reagensa. Koristili smo ND{{0}} spektrofotometar (nano-drop, SAD) i elektroforezu u agaroznom gelu za provjeru kvalitete i količine RNA. Reverzna transkripcija (RT) izvedena je na 500 ng ukupne RNA korištenjem PrimeScript® RT Master Mix. Specifični primeri za -aktin i FAS, TRAIL, TNF i druge gene dizajnirani su pomoću softvera Primer Premier 7.0 (tablica 2), a sintetiziran od strane Sangon Biotech (Šangaj, Kina). Quantstudio 7 flex real-time PCR sustav (thermo-fisher, SAD) i SYBR® Premix Ex Taq™ II Kit korišteni su za RT-PCR. Volumen PCR reakcije bio je 20 μL, a uvjeti RT-PCR bili su: 95 ◦C 10

min, 40 ciklusa od 95 ◦C 15 s, 55 ◦C 30 s, 72 ◦C 30 s, i na kraju jedan ciklus od 95 ◦C 15 s, 60 ◦C 15 s, 95 ◦C 15 s. Sve reakcije ponovljene su tri puta. Relativna 2-ΔΔCt metoda korištena je za izračunavanje relativnih razina ekspresije mRNA, a -aktin je korišten kao kalibrator. U procesu je razlika u učinkovitosti manja od 5 posto.

Ukupna ekstrakcija proteina i Western blotting analiza

Thebubregtkivo je isprano PBS-om, osušeno filter papirom i razloženo u RIPA lizi (koja sadrži PMSF), pri 12,000 rpm/min, 4^◦C za 10 min. Koncentracija proteina određena je korištenjem kompleta Bicinchoninic Acid (BCA) (Solarbio Science & Technology, Peking, Kina). Uzorak proteina od 35 ng uspješno je ekstrahiran i elektroforezom odvojen na 8 postotnom SDS-poliakrilamidnom gelu. Ciljani protein je prenesen na NC membranu, a NC membrana je blokirana s 5 posto nemasnog mlijeka na sobnoj temperaturi tijekom 2 sata. Nakon toga je NC membrana inkubirana s primarnim antitijelima -aktina (1:1000), TRAIL (1:500), FAS (1:500), FAS-L (1:100), TNF (1:500), FADD (1:500), kaspaza 8 (1:500), kaspaza 3 (1:500) i PARP (1:1000) na 4 stupnja preko noći. Nakon ispiranja 3 puta s PBST, NC membrana je inkubirana s HRP-konjugiranim sekundarnim kozjim anti-zečjim IgG protutijelima (1:2000) na sobnoj temperaturi 2 sata. ECL je korišten za vizualizaciju ciljnih proteinskih vrpci. Optička gustoća izračunata je softverom AlphaView (verzija: 3.2.2.0) na sustavu FluorChem Q (Alpha Innotech, CA, SAD).

Statistička analiza

Program GraphPadPrism{{0}} korišten je za organiziranje i analizu eksperimentalnih podataka, a svaki je podatak predstavljen srednjom vrijednosti ± SEM. Značajnost razlike između srednjih vrijednosti određena je analizom varijance (ANOVA) nakon koje je slijedio Tukeyjev test s P < 0,05="" koji="" se="" smatra="">

Rezultati

Izmjene ububregkoeficijent i pokazatelji biokemijske funkcije

Thebubregkoeficijent i razine F, CRE, BUN, UA, Mg, P, K prikazan je na slici 1. U usporedbi sa C skupinom,bubregkoeficijent je značajno smanjen u F skupini (p < 0.05).="" međutim,="" koeficijent="" bubrega="" u="" f="" plus="" 1="">Kalcijskupina pokazala značajan porast u usporedbi s F skupinom (p < {{0}}.05).="" razina="" f="" u="" f="" skupini="" bila="" je="" izrazito="" viša="" nego="" u="" c="" skupini="" (p="">< 0,001).="" zanimljivo,="" u="" usporedbi="" sa="" skupinom="" f,="" razina="" f="" u="" skupini="" f="" plus="" 1="" posto="" ca="" bila="" je="" značajno="" smanjena="" (p=""><>

CRE, BUN i UA procijenjeni su kako bi odražavali stupanjbubregoštećenja i funkcionalne promjene. Razine CRE, BUN i UA bile su izrazito povećane u skupini F u usporedbi s onima u skupini C (p < 0.05),="" međutim,="" u="" odnosu="" na="" skupinu="" f,="" gornja="" tri="" pokazatelja="" bila="" su="" značajno="" smanjen="" u="" f="" plus="" 1="">Kalcijskupina (p < 0.05).="" mg,="" p="" i="" k="" bili="" su="" usko="" povezani="" indikatori="">bubregfunkcija. U usporedbi s C skupinom, razina serumskog Mg bila je značajno smanjena, razine P i K dramatično su povećane u F skupini (p < 0,05).="" ipak,="" dodajući="" 1="">kalcijprehrani značajno povećao serumske razine Mg za 15,3 posto (p < 0.05)="" i="" značajno="" smanjio="" serumske="" razine="" p="" za="" 16,9="" posto="" (p="">< 0,05).="" sadržaj="" serumskog="" k="" pokazao="" je="" silazni="" trend="" bez="" značaja="" nakon="" tretmana="" dodatkom="" 1="" posto="">

Promjene ububregmorfologija

Morfološke promjenebubregtkiva su ispitani pomoću H&E (sl. 2I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ). U C skupini,bubregtubularne stanice bile su kompaktno raspoređene, morfologija je bila pravilna, a morfologija glomerula bila je netaknuta. Međutim, granice između stanica bile su nejasnebubregtjelešca su atrofirana i deformirana,bubregšupljina kapsule proširena,bubregtubuli su formirali odljev, a epitelne stanice su se odvojile u F skupini. U usporedbi s F skupinom, s porastom odKalcijkoncentracija, rasporedbubregstanice su postupno postajale sve urednije, morfologijabubregtjelešca su se postupno oporavljala, a stupanj ozljede postupno se smanjivao. Osim toga, procijenili smo štetu pomoćububregrezultat (slika 2Ⅴ). Rezultat F skupine bio je značajno viši od onog C skupine (p < 0.01);="" ipak,="" rezultat="" u="" f="" plus="" 1="">Kalcijskupina značajno smanjila u usporedbi s F skupinom (p < 0.05).

TUNEL otkrivabubregćelijaapoptoza

Proveli smo TUNEL test kako bismo otkrili i analizirali je libubregstanice su pretrpjeleapoptozau ovoj studiji (sl. 3I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ).Bubregtkiva u skupini C bila su uredno raspoređena, s manje apoptotskih stanica (4,67 ± 1,15 posto). Grupa F pokazala je veliki broj TUNEL-pozitivnihbubregtubularnih epitelnih stanica (48,17 ± 3,94 posto). Nasuprot tome, F plus 1 postoKalcijskupina pokazala je dramatičan pad u broju TUNEL-pozitivnih stanica (28,83 ± 4,81 posto) (Slika 3Ⅴ).

Učinci odKalcijna F-induciranim promjenama u genima povezanim s putem receptora smrti

Relativne razine ekspresije mRNA uzvodnih faktora povezanih s posredovanjem receptora smrtiapoptozaput (TRAIL, DR5, TNF, TNFR1, TNF-R2, FAS, FAS-L, OPG) otkriveni su na slici 4a. U odnosu na skupinu C, razine ekspresije mRNA TRAIL-a, DR5, TNF-a, TNF-R1, TNFR2, FAS-a i FAS-L bile su znatno povećane u štakora tretiranih F-om (p < 0.01).="" nasuprot="" tome,="" relativna="" ekspresija="" mrna="" trail-a,="" tnf-a,="" tnf-r2,="" fas-a="" i="" fas-l-a="" bila="" je="" značajno="" smanjena="" u="" f="" plus="" 1="">Kalcijskupinu u usporedbi s F skupinom (p < {{0}}.05).="" u="" usporedbi="" s="" c="" skupinom,="" uočeno="" je="" očito="" smanjenje="" razine="" ekspresije="" mrna="" opg="" u="" f="" skupini="" (p="">< 0,01).="" no,="" u="" odnosu="" na="" f="" skupinu,="" opg="" u="" f="">Kalcijgrupe su povećane. Nizvodni faktori FADD, TRADD, kaspaza 8, kaspaza 3 i PARP relativne razine ekspresije mRNA prikazane su na slici 4b. Proteinske ekspresije FADD, TRADD, kaspaze 8, kaspaze 3 i PARP bile su očito pojačane u F skupini u usporedbi s C skupinom (p < 0.01),="" ali="" su="" očito="" smanjene="" u="" f="">Kalcijskupine, u usporedbi s F skupinom (p < 0.05).

Učinci odKalcijna F-inducirane promjene uapoptoza-srodnih proteina

Ekspresija proteina TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, kaspaza 8, kaspaza 3 i PARP detektirana je Western blotingom (sl. 5a, b). U usporedbi sa skupinom C, ekspresija proteina TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, kaspaza 8, kaspaza 3 i PARP u skupini F bila je izrazito povišena (p < 0.01).="" proteinska="" ekspresija="" svih="" gore="" navedenih="" čimbenika="" značajno="" je="" smanjena="" u="" f="" plus="" 1="">Kalcijskupinu u usporedbi s F skupinom (p < 0.05).

Rasprava

Najnoviji dokazi pokazali su da F može uzrokovati lezije na mekim tkivima, a stupanj oštećenja F ovisi o koncentraciji F, vremenu izloženosti i vrsti organa (Wei et al., 2019.). U ovoj studiji, 100 mg/L NaF korišteno je 17 tjedana kako bi se uspostavio životinjski model subakutne izloženosti pitke vode NaF. Doziranje NaF odabire se prema stupnju onečišćenja F u okolišu i nesigurnim čimbenicima različitih vrsta. S obzirom da je prirodna koncentracija F- izmjerena u lokalnoj podzemnoj vodi oko 4,5 mg/L, destilirana voda sa 100 mg/L NaF korištena u ovoj studiji (koncentracija F- je oko 45 mg/L) izračunata je prema nesigurnom faktoru za ekstrapolacija s životinje na čovjeka na 10 (Smjernice za kvalitetu pitke vode, 2017.; Mukherjee i Singh, 2021.; Wen i sur., 2013.; Zhang i sur., 2020.). Rane studije su otkrile da dijetetskikalcijmogu utjecati na apsorpciju fluora, pospješiti izlučivanje fluora u tijelu, smanjiti stopu apsorpcije fluora i tako smanjiti toksičnost F (Harrison i sur., 1984.; Larsen i sur., 1981.). Naše nedavne eksperimentalne studije pokazale su da Ca ublažava ozljede kostiju i jetre uzrokovane F inhibiranjem unutarnjeg putaapoptoza(Li i sur., 2021.; J. Wang i sur., 2020.; Wang i sur., 2019.). Međutim, do sada je istraživanje o zaštitnom učinku Ca na F-induciranu nefrotoksičnost i s njim povezanim mehanizmom bez presedana. Ovdje izvješćujemo da Ca ublažava F-induciranbubregšteta. Osim toga, također smo otkrili da Ca preokreće F-induciranbubregćelijaapoptozaposredstvom receptora smrtiapoptozaput (putevi FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL). Dugotrajna akumulacija F ububregmože dovesti do oštećenja strukture tkiva i funkcije. U ovoj studiji otkrili smo da je izloženost NaF uzrokovalabubregćelijaapoptozau štakora, praćeno glomerularnom atrofijom i deformacijom,bubregproširenje šupljine kapsule,bubregtubuli koji stvaraju odljeve, a epitelne stanice otpadaju. Međutim,bubregoštećenje je značajno ublaženo nakon dodatka 1 posto Ca. Ovi rezultati bili su slični rezultatima dobivenim u prethodnim izvješćima (Cao i sur., 2015.; HW Wang i sur., 2020.).

CRE je metabolit mišića, UA je konačni proizvod metabolizma purina, a BUN je glavni krajnji proizvod tjelesnog metabolizma proteina, koji se izlučuje glomerularnom filtracijom i obično se koristi za otkrivanjebubregfunkciju (Myers i sur., 2006.; HW Wang i sur., 2020.). Biokemijsko istraživanje visoke regije F pokazalo je da su stope glomerularne filtracije značajno smanjene, a F, UA i BUN značajno su se promijenili (Malin i sur., 2019.). Testovi na životinjama pokazali su da serumski CRE,Kalcij, a koncentracije P bile su značajno smanjene u miševa izloženih 100 mg/L NaF, što sugerira da je F poremećenbubregfunkciju kao i metabolizam Ca i P (HW Wang i sur., 2020.). F-inducirana nefrotoksičnost povezana je sbubregdisfunkcija. Kadabubregfunkcija se pogoršava, izlučivanje F u tijelu je smanjeno, što dovodi do prekomjernog nakupljanja fluora ububregi pogoršanje toksičnosti F (Kido i sur., 2017.). Kadabubregasu ozbiljno oštećeni,

izlučivanje F urinom se smanjuje, a koncentracija F u serumu dodatno raste (Dharmaratne, 2019.). U ovoj smo studiji primijetili da su se razine BUN i serumskih CRE, UA, P, K kod štakora tretiranih sa 100 mg/L NaF značajno povećale, što sugerira da je visoka izloženost F uzrokovala promjene ububregbiokemijskih pokazatelja u štakora i dovela dobubregnedostatnost. Nadalje, istaknuli smo da različiti pokazatelji obubregimaju tendenciju da budu normalni nakonKalcijdopunu. Pokazuje da Ca (osobito 1 postoKalcij) ima značajno ublažavajuće djelovanje na F-induciranobubregoštećenja kod štakora.

Cistanchemože pomoći sbubregšteta.

Apoptozaje autonomna i uredna stanična smrt kontrolirana genima, koju karakterizira degradacija DNA bez očite stanične lize. Ovo je istraživanje pokazalo da je fluoroza uzrokovalabubregćelijaapoptozakod štakora. FAS ima glavnu ulogu u nastankuapoptozai razne bolesti. Novija literatura otkriva da FAS posredujeapoptozaububreginducirana ishemijom-reperfuzijom i ljudskim leukocitimaapoptozaizazvane N-nitrosodimetilaminom (Iwaniuk i sur., 2019; Xu

i sur., 2019). Kada se FAS i FAS-L spoje u trimer, aktivira se pro-apoptotski signal. Nedavna studija je pokazala da F inducira staniceapoptozakroz FAS/FAS-L put (Xu i sur., 2011.). U ovoj studiji, F je značajno povećao ekspresiju mRNA i proteina FAS i FAS-L ububreg. Povećana regulacija razina FAS i FAS-L sugerira da apoptotski putovi povezani s FAS/FAS-L mogu biti uključeni u F-induciranuapoptoza. FAS/FAS-L trimer regrutiranje FADD-a dovodi do cijepanja Pro-kaspaze 8 kako bi se proizvela aktivna kaspaza 8, koja zauzvrat aktivira kaspazu 3 i zatim dovodi doapoptoza(Li i sur., 2011.; Xu i sur., 2011.). Ova je studija potvrdila da 100 mg/L NaF uzrokujeapoptozakod štakorabubregakroz FAS/FAS-L put. Najvažniji rezultat je da dodatak kalcija u prehrani smanjujeapoptoza-poticajni učinak F, koji se pripisuje smanjenoj regulaciji aktivacije FAS/FAS-L i sekundarne aktivacije kaspaza.

TNF je pleiotropni citokin koji sudjeluje u širokom rasponu staničnih odgovora, uključujući diferencijaciju, proliferaciju, upalu i staničnu smrt. TNF signal pokreće obojeapoptozai anti-apoptotičkih puteva. Mnoge vrste literature izvještavaju da TNF dominira induciran lipopolisaharidimabubregoštećenja i cisplatinom izazvane akutnebubregozljeda (Lee i sur., 2016; Li i sur., 2018). TNF se veže za TNF-R1, njegov DD regrutira TRADD, a zatim TRADD stupa u interakciju s FADD, što dovodi do stvaranja DISC-a (Kiraz i sur., 2016.; Sun i sur., 2003.). Studije su otkrile da F može inducirati jetru, neurone ibubregleukocitaapoptozakroz TNF signalni put (Lu i sur., 2017.; Singh i sur., 2017.; Yan i sur., 2016.). Slično rezultatima ovih izvješća, relativne ekspresije TNF-a, TNF-R1, TNF-R2 i TRADD-a u F skupini značajno su povećane u ovom eksperimentu. Nasuprot tome, ekspresija ovih gena značajno se smanjila nakon 1 postoKalcijdodatak, sugerirajući intervencijuKalciju TNF putu.

TRAIL je uključen u regulacijuapoptoza, proliferacija, imunološko-upalni odgovor, itd. Trenutno se vjeruje da je TRAIL usko povezan s pojavom i prognozombubregbolesti (Candido, 2014). Sve više literature potvrđuje da TRAIL reguliraapoptozaodbubregtubularne epitelne stanice kod glomerulonefritisa povezanog s HBV-om ibubregapoptozau Uromodulin-povezanobubregbolest (Johnson i sur., 2017.; Yang i sur., 2018.). Nadalje, studija je objavila da je ekspresija TRAIL-a općenito promijenjena tijekom homeostaze i raznihbubregozljede (Devarapu i sur., 2017.). TRAIL se veže za receptor smrti DR5 i regrutira FADD kroz interakciju DD-a, a zatim se veže za pro-kaspazu 8 kroz domenu učinka smrti koja postoji u FADD-u kako bi formirao DISC (Yuan et al., 2018). Ova je studija pokazala da je ekspresija TRAIL-a i DR5 značajno povećana u F skupini. Nakon dopune saKalcij, ekspresija TRAIL-a i DR5 je bila inhibirana. Predlaže se daKalcijinhibira TRAIL put kako bi se smanjio F-induciraniapoptoza.

Zaključak

Izlaganje 100 mg/L NaF aktiviralo je posredovanje receptora smrtiapoptozaput (putevi FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL) i potom induciranibubregćelijaapoptozakod štakora, uzrokujućibubregmetabolički poremećaji ibubregnedostatnost, što rezultirabubregtjelešca su atrofirana i deformirana,bubregšupljina kapsule proširena,bubregtubuli formirali gips. Međutim, dodatak od 1 postoKalcijprehrani smanjio sadržaj fluorida u krvi, dodatno ublažiobubregmetabolički poremećaj ibubreginsuficijencije putem putem posredovanog receptorom smrti, i značajno smanjiobubregozljeda (komponenta sl. 6).

Reference

Izvor je Haojie Li, College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, NR Kina itd.