Učinak izbjeljivanja nove mješavine peptida reguliranjem biogeneze, prijenosa i razgradnje melanosoma 1. dio

SAŽETAK

Peptidi su kratki lanci aminokiselina povezani peptidnim vezama. Naširoko se koriste kao učinkoviti i biokompatibilni aktivni sastojci u kozmetičkoj industriji. U ovoj smo studiji razvili novu mješavinu peptida i identificirali njezin učinak protiv pigmentacije na melanocite i keratinocite. Naši su rezultati otkrili da mješavina peptida inhibira biogenezu melanosoma putem regulacije transkripcijskog faktora povezanog s mikroftalmijom, ključnog čimbenika melanogeneze u melanocitima. I primijetili smo da je mješavina peptida inhibirala unos melanosoma kroz smanjenje proteazom aktiviranog receptora 2, receptora povezanog s fagocitozom u keratinocitima. Nadalje, mješavina peptida aktivirala je sustav autofagije što je rezultiralo razgradnjom prenesenih melanosoma u keratinocite. Antipigmentacijski učinak mješavine peptida s više ciljanja procijenjen je na modelu ekvivalenta ljudske kože (MelanoDerm). Sadržaj melanina u epidermalnom sloju značajno je smanjen lokalnim tretmanom mješavine peptida, što sugerira da se može primijeniti kao novi kozmetički materijal koji imaizbjeljivanjefunkcija.

Prema relevantnim studijama,cistancheje uobičajena biljka poznata kao "čudotvorna biljka koja produžuje život". Njegova glavna komponenta jecistanozid, koji ima različite učinke poput antioksidativnog, protuupalnog i promicanja imunološke funkcije. Mehanizam između cistanhe iizbjeljivanje koželeži u antioksidativnom učinkucistancheglikozidi. Melanin u ljudskoj koži nastaje oksidacijomtirozinkataliziran od stranetirozinaza. Thereakcija oksidacije zahtijeva sudjelovanje kisika, tako da radikali bez kisika u tijelu postaju važan čimbenik koji utječe na proizvodnju melanina. Cistanche sadrži cistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijelu, takoinhibiranje proizvodnje melanina.

Kliknite On cong rong Cistanche For Whitening

Pitajte za više:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ključne riječi

Autofagija ·Melanosom ·Transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom ·PAR-2· Peptid

UVOD

Melanin proizvode melanociti koji se nalaze u bazalnom sloju epidermisa kako bi zaštitili stanice kože od štetnih vanjskih agenasa, uključujući ultraljubičaste (UV) zrake, finu prašinu i razne kemijske spojeve [1]. Čimbenici koji se luče iz keratinocita uglavnom UV zračenjem, uključujući hormon koji stimulira alfa-melanocite (MSH), adrenokortikotropni hormon, faktor matičnih stanica, endotelin 1, faktor rasta hepatocita, osnovni faktor rasta fibroblasta i faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga, stimuliraju svaki receptor na površini melanocita i melanina proizvodi se u organelu povezanom s lizosomom koja se naziva melanosom [2-7]. Među tim čimbenicima, MSH je mali peptidni hormon izveden iz proopiomelanokortina. Vezanje -MSH na receptor melanokortina 1 povećava razinu cikličkog adenozin monofosfata (cAMP) koji aktivira protein kinazu A (PKA) [8,9]. PKA zatim fosforilira cAMP-responsive element binding protein (CREB) i transkripciju transkripcijskog faktora povezanog s mikroftalmijom (MITF) inducira fosfo-CREB [10]. MITF djeluje kao faktor transkripcije za tirozinazu, protein 1 (TYRP1) i dopakrom tautomerazu (Dct ili TYRP2), ključne enzime u melanogenezi, i inducira njihovu ekspresiju [11]. Sazrijeli melanosom kreće se prema vrhu dendrita, a motorni proteinski kompleks melanosoma koji se sastoji od Rab27a, melanofilina i miozina Va igra ulogu u ovom procesu [12-14]. Melanofilin, koji ima vezne domene za Rab27a, miozin Va i aktin, istovremeno se veže za Rab27a na površini melanosoma i za miozin Va u interakciji s aktin filamentom. Sastavljanje ovih motoričkih proteina potrebno je za transport melanosoma do vrhova dendrita duž aktinskog filamenta [15- 19]. Nakon toga, melanosomi prebačeni s vrhova dendrita melanocita na susjedne keratinocite i ugrađeni melanosomi lociraju se u perinuklearnom području keratinocita [20,21]. Iako je pravilno stvaranje melanina važno za normalnu zaštitu stanica, prekomjerno stvaranje melanina uzrokuje hiperpigmentaciju, uključujući melazmu, pjege i solarni lentigo, što može dovesti do psihičkog stresa i loše kvalitete života [22,23]. Stoga postoje zahtjevi za razvojem zadovoljavajućih sredstava za izbjeljivanje bez nuspojava kao što su iritacija kože, indukcija alergija i karcinogeneza, a provedena su mnoga istraživanja usmjerena na različite mehanizme izbjeljivanja [24,25].

Peptidi su kratki lanci aminokiselina, najmanja jedinica proteina, međusobno povezani peptidnim vezama. Nedavno su u kozmetičkoj i farmaceutskoj industriji provedena opsežna istraživanja i razvoj u vezi s peptidima kao aktivnim sastojcima zbog njihove visoke biokompatibilnosti i sposobnosti oponašanja proteina [26,27].

Pregledali smo našu biblioteku peptida i pronašli četiri peptida koji utječu na inhibiciju sinteze, migracije i prijenosa melanina, kao i na aktivnost koja potiče razgradnju melanosoma. Nakon toga, ova je studija imala za cilj istražiti aktivnost izbjeljivanja mješavine peptida koja sadrži četiri peptida s istim molarnim omjerom.

METODE

Materijali

2-CTC smola korištena u sintezi peptida kupljena je od BeadTech (Seul, Koreja). Fmoc-amino kiselina, hidroksi benzotriazol (HOBt) i N, N, N´, N´-tetrametil-O-(1H-benzotriazol- 1-il)uronijev heksafluorofosfat (HBTU) kupljeni su od CS Bio Co. ( San Francisco, CA, SAD). Reagensi korišteni u sintezi, uključujući dimetilformamid (DMF), N,N-diizopropiletilamin (DIEA), piperidin, trifluoroctenu kiselinu (TFA), tioanizol, fenol, etan ditiol (EDT), triizopropilsilan (TIS) i dietil eter, bili su kupljen od Daejung Chemical & Metal Co., Ltd. (Seul, Koreja).

Dulbeccov modificirani Eagle Medium (DMEM) prašak za melanocite i fetalni goveđi serum (FBS) kupljeni su od Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, SAD), a tekući DMEM mediji i penicilin/streptomicin kupljeni su od Welgene Inc. (Gyeongsan, Koreja) . Natrijev bikarbonat, natrijev hidroksid, arbutin, 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolijev bromid (MTT), 3,{{ 7}}dihidroksi-L-fenilalanin (LDOPA), tripsin i rapamicin kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD), a Solvable je kupljen od PerkinElmera (Waltham, MA, SAD). Antitijela protiv Rab27A, Melanophilin, MITF, Tyrosinase i Actin kupljena su od Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA), a antitijela protiv Beclin-1, LC3, p62, p-CREB i p-ERK1/2 kupljeni su od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAD). Sinteza primera provedena je u Cosmo GENETECH-u (Seoul, Koreja) i dalje korištena u eksperimentu (Tablica 1).

Sinteza peptida

CTC smola s kapacitetom od 0.84 mmol/g podvrgnuta je reakciji bubrenja u reaktoru koji sadrži DMF otapalo. Zatim su 2 ekvivalenta Fmoc-C terminalne aminokiseline i 2,5 ekvivalenta DIEA dodani u DMF u reaktor i dalje podvrgnuti reakciji 2 sata. Završetak reakcije je potvrđen s Kaiser test kitom (Sigma-Aldrich), a smola je isprana s DMF-om. Fmoc je uklonjen dodavanjem 20 posto piperidina/DMF dva puta u ispranu smolu. Završetak reakcije je potvrđen s Kaiser test kitom, a smola je isprana s DMF-om. Nakon toga, sljedeći proces je ponovljen prema slijedu aminokiselina u smjeru od C terminala do N terminala. Nakon što su 2 ekvivalenta Fmoc-amino kiseline, 2 ekvivalenta HBTU, 2 ekvivalenta HOBt i 2,5 ekvivalenta DIEA dodana u DMF, reakcija je izvedena 2 sata. Završetak reakcije je potvrđen s Kaiser test kitom, a smola je isprana s DMF-om. Fmoc je uklonjen iz aminokiseline dodavanjem 20 posto piperidina/DMF dva puta u ispranu smolu. Završetak reakcije je potvrđen s Kaiser test kitom, a smola je isprana s DMF-om. U slučaju Pep-3, konjugacija ferulinske kiseline provedena je sljedećim postupkom. Nakon dodavanja 2 ekvivalenta ferulinske kiseline, 2 ekvivalenta HBTU, 2 ekvivalenta HOBt i 2,5 ekvivalenta DIEA u DMF, reakcija je izvedena 2 sata. Završetak reakcije je potvrđen s Kaiser test kitom, a smola je isprana s DMF-om. Nakon završetka konačne sinteze, dodana je otopina za cijepanje (TFA:H2O: Ohioans ole:fenol:EDT: TIS=81.5:5:5:5:2.5:1) kako bi se odvojio peptid od smole . Peptid je zatim istaložen pomoću dietil etera i ispran pet puta. Zatim je izvedeno sušenje da se dobije konačni peptidni produkt.

Čistoća sintetiziranog peptida identificirana je analizom HPLC (Thermo Fisher Scientific/U{{0}}), a detektiran je na UV 214 nm pri brzini protoka od 1 ml/min pod mobilnom fazom {{ 5}}.1 posto TFA u vodi/0,1 posto TFA u acetonitrilu korištenjem C18 (Agilent, Pursuit XRs, 250 × 4,6 mm, 5 m, 100 A) kolone.

Kako bi se identificirala molekularna težina, provedena je LC-MS/MS (AB SCIEX, 3200 Q-trap) analiza, a detektirana je pomoću MS/MS pri brzini protoka od {{7 }}.25 ml/min pod mobilnom fazom 0.1 posto mravlje kiseline u vodi/0,1 posto mravlje kiseline u acetonitrilu gradijentu korištenjem C18 (Agilent, Pursuit XRs, 100 × 2,0 mm, 5 m, 100Å) kolone . Uvjeti MS/MS analize uključivali su ESI pozitivan način, izvor/plin: CUR=20, CAD=visoko, IS=5500, TEM=350, GS1=50 , GS2=50/Spoj DP=50–80, EP=10, CE=10–50 i CES=1–10 (Tablica 2).

Kultura stanica

Stanice melanoma B16F10 korištene u ovom eksperimentu kupljene su od ATCC (Manassas, VA, SAD). B16F10 stanice su inkubirane u DMEM mediju koji je sadržavao 10 posto toplinski inaktiviranog FBS-a, 1 posto penicilina/streptomicina i 1,5 g/L natrijevog bikarbonata na 37 stupnjeva i pod uvjetima od 5 posto CO2.

HaCaT keratinociti su kupljeni od CLS (Eppelheim, Njemačka). HaCaT stanice su inkubirane u DMEM mediju koji sadrži 10 posto toplinski inaktiviranog FBS-a i 1 posto penicilina/streptomicina na 37 stupnjeva i pod uvjetima od 5 posto CO2.

Viabilnost stanica

Stanice B16F10 posađene su u 48-ploču s jažicom u gustoći od 8 × 103 stanica/jažici i inkubirane 16 sati. Zatim su tretirani različitim koncentracijama smjese peptida u mediju koji je sadržavao 2 posto FBS-a tijekom 3 dana. Nakon inkubacije, 20 ul 4 mg/ml MTT tretirano je u svakoj jažici 4 sata i medij je uklonjen. Nakon toga, stanice su tretirane s 500 ul DMSO da se otopi formazan. Apsorbancija je mjerena na 570 nm pomoću spektrofotometra (Molecular Devices, San Jose, CA, SAD).

Određivanje sadržaja melanina

Stanice B16F10 posađene su u 6-ploču s jažicom u gustoći od 5 × 104 stanica/jažici i inkubirane 16 h. Zatim su tretirani različitim koncentracijama smjese peptida u mediju koji je sadržavao 2 posto FBS-a tijekom 3 dana. Da bi se inducirala proizvodnja melanina, 100 ng/ml -MSH je zajedno tretirano i 200 M arbutina je korišteno kao pozitivna kontrola. Stanice su sakupljene i lizirane tretiranjem s 200 1 1 M NaOH i spektrofotometrom je izmjerena apsorbancija za lizat na 490 nm.

Test aktivnosti tirozinaze

Stanice B16F10 posađene su u 6-ploču s jažicom u gustoći od 5 × 104 stanica/jažici i inkubirane 16 h. Zatim su tretirani različitim koncentracijama smjese peptida u mediju koji je sadržavao 2 posto FBS-a tijekom 3 dana. Da bi se inducirala proizvodnja melanina, 100 ng/ml-MSH je zajedno tretirano i 200 M arbutina je korišteno kao pozitivna kontrola. Svaka jažica je tretirana sa 200 ul pufera za lizu (Sigma-Aldrich) da se sakupi lizat. Nakon kvantifikacije proteina korištenjem BCA kompleta (Thermo Fisher Scientific), 90 g proteina iz svake skupine inkubirano je s 20 l 10 mM L-DOPA u 96- jažičnoj ploči 30 minuta na 37 stupnjeva. Apsorbancija smjese pri 475 nm izmjerena je spektrofotometrom.

Izolacija melanosoma

B16F1{{10}} stanice su nasađene u 6-pločicu s jažicom u gustoći od 5 × 104 stanica/jažici i inkubirane 16 h. Stanice su tretirane sa 100 ng/ml-MSH tijekom 72 sata kako bi se inducirala sinteza melanina i sakupljene tretmanom tripsin/EDTA. Stanice su zatim isprane s 10 ml 0,25 M saharoze (u 10 mM HEPES puferu) i resuspendirane u 10 ml 0,25 M otopine saharoze. Nakon toga, nakon zamrzavanja tekućim dušikom, izvršeno je odmrzavanje na 37 stupnjeva, što je ponovljeno 10 puta. Nakon centrifugiranja na 1,000 g tijekom 10 minuta, supernatant je sakupljen i dalje centrifugiran tijekom 45 minuta na 20,630 g i 4 stupnja. Zatim je peleta podvrgnuta resuspendiranju s DPBS-om i pohranjena na –80 stupnjeva prije upotrebe.

Test preuzimanja melanosoma

Stanice HaCaT nasađene su u 6-pločicu s jažicom u gustoći od 1 × 105 stanica/jažici i inkubirane 16 h. Zatim su tretirani smjesom peptida u mediju bez seruma tijekom 1 sata i dalje tretirani izoliranim melanosomima tijekom 40 sati. Stanice su lizirane tretiranjem s 200 1 1 M NaOH i spektrofotometrom je izmjerena apsorbancija za lizat na 490 nm. Nadalje, bojanje melanosoma provedeno je korištenjem Fontana-Masson Stain Kit (ScyTek Laboratories, Logan, UT, SAD), a slike stanica detektirane su svjetlosnim mikroskopom.

Test razgradnje melanosoma

Stanice HaCaT nasađene su u 6-pločicu s jažicom u gustoći od 1 × 105 stanica/jažici i inkubirane 16 h. Prethodno su tretirani izoliranim melanosomima u mediju bez seruma tijekom 48 sati i dodatno tretirani smjesom peptida tijekom 72 sata. Kao pozitivna kontrola korišten je jedan mikromol rapamicina. Stanice su lizirane tretiranjem s 200 1 1 M NaOH i spektrofotometrom je izmjerena apsorbancija za lizat na 490 nm. Nadalje, bojenje melanosoma provedeno je korištenjem Fontana-Masson Stain Kita, a slike stanica detektirane su svjetlosnim mikroskopom.

Analiza ekspresije gena (RT-PCR)

Stanice B16F10 posađene su u 6-ploču s jažicom u gustoći od 5 × 104 stanica/jažici i inkubirane 16 h. Zatim su tretirani različitim koncentracijama smjese peptida u mediju koji je sadržavao 2 posto FBS-a tijekom 3 dana. Da bi se inducirala proizvodnja melanina, 100 ng/ml-MSH je zajedno tretirano i 200 M arbutina je korišteno kao pozitivna kontrola. RNA je izolirana iz stanica korištenjem kompleta za ekstrakciju RNA (Qiagen, Njemačka), a sinteza cDNA izvedena je korištenjem RT-PCR premiksa (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Koreja). Nakon pripreme reakcijske smjese s PCR premiksom (iNtRON Biotechnology) i primerima za svaki gen, PCR je proveden pomoću PCR stroja (Eppendorf, Njemačka). Nakon toga, uzorci ekspresije mRNA određeni su elektroforezom u agaroznom gelu.

Stanice HaCaT posađene su u 6-ploču s jažicom u gustoći od 3 × 105 stanica/jažici i inkubirane 16 h. Zatim su tretirani različitim koncentracijama mješavine peptida u mediju bez seruma tijekom 1 sata i dodatno tretirani s 4U tripsina tijekom 16 sati. Stanice su sakupljene i RT-PCR je izveden na isti način kao što je gore opisano.

Analiza ekspresije proteina (Western blotting)

Stanice B16F10 posađene su u 6-ploču s jažicom u gustoći od 5 × 104 stanica/jažici i inkubirane 1 dan. Zatim su tretirani različitim koncentracijama smjese peptida u mediju koji je sadržavao 2 posto FBS-a tijekom 3 dana. Da bi se inducirala proizvodnja melanina, 100 ng/ml -MSH je zajedno tretirano i 200 M arbutina je korišteno kao pozitivna kontrola. Stanice su lizirane puferom za lizu, a protein je kvantificiran korištenjem BCA kompleta. Dvadeset mikrograma proteina izdvojeno je na 8-postotnom poliakrilamidnom gelu i elektroforetski preneseno na membrane od poliviniliden fluorida. Membrane su blokirane u 5 posto w/v obranom mlijeku u PBS-u s 0,5 posto Tween 20 (PBS-T). Inkubacija s primarnim antitijelima razrijeđenim u otopini za blokiranje izvedena je preko noći na 4 stupnja, nakon čega je slijedilo ispiranje s PBS-T. Odgovarajuća sekundarna protutijela razrijeđena su u otopinama za blokiranje i inkubirana s membranama 1 sat na sobnoj temperaturi nakon čega je slijedilo ispiranje s PBS-T. Membrane su vizualizirane pomoću Western reagensa za detekciju (Elpis Biotech, Daejeon, Koreja) s Gel Doc (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD).

Za analizu p-CREB i p-ERK, stanice B16F10 posađene su u 6-ploču s jažicom u gustoći od 3 × 105 stanica/jažici i inkubirane 1 dan. Zatim su tretirani različitim koncentracijama smjese peptida u mediju koji je sadržavao 2 posto FBS-a. Vrijeme inkubacije bilo je 30 minuta za analizu p-CREB i 10 minuta za analizu p-ERK. Za induciranje proizvodnje melanina, 100 ng/ml -MSH je kotretirano, a 200 M arbutina je korišteno kao pozitivna kontrola. Western blot je izveden korištenjem izoliranih proteina na isti način kao što je gore opisano.

Stanice HaCaT posađene su u 6-ploču s jažicom u gustoći od 3 × 105 stanica/jažici i inkubirane 16 h. Zatim su tretirani različitim koncentracijama peptidne smjese u mediju bez seruma tijekom 3 dana. Dvije stotine nanograma rapamicina tretirano je 3 sata kao pozitivna kontrola. Western blot je izveden korištenjem izoliranih proteina na isti način kao što je gore opisano.

Analiza ekvivalenta kože

Za testiranje učinka izbjeljivanja mješavine peptida pomoću ekvivalenta kože, pripremljen je uzorak liposoma kako slijedi. Smjesa peptida je otopljena u destiliranoj vodi u koncentraciji od 2,000 g/ml i podešena na pH 7. Nakon filtracije pomoću 0.22-m filtra veličine pora, 1 posto hidrogenirani fosfatidilkolinski pufer pomiješan je u omjeru od 10 posto. Uzorak liposoma nano veličine pripremljen je prolaskom kroz 75-m stanice pet puta pri 1,000 bara pomoću mikrofluidizatora.

MelanoDerm MEL-300-B (MatTek Corporation, Ashland, MA, SAD) lokalno je tretiran s 25 l ili 50 l liposoma koji sadrži 2,000 g/ml mješavine peptida tri puta tjedno tijekom 2 tjedna. Isti volumen nosača primijenjen je za kontrolno tkivo. Tretirani ekvivalenti kože isprani su DPBS-om i izvedena je svjetlosna mikroskopija da se provjeri morfologija melanocita. Nakon toga, kako bi se analizirala proizvodnja melanina, ekvivalenti kože zamrznuti su na –80 stupnjeva 30 minuta i odmrznuti na sobnoj temperaturi. Uzorci tkiva su inkubirani s 1 postotnim natrijevim bikarbonatom 30 minuta i osušeni. Nakon tretmana s 300 l Solvabla, uzorci su ostavljeni preko noći na 95 stupnjeva i zatim ohlađeni na sobnoj temperaturi. Apsorpcija ekstrakta tkiva pri 490 nm mjerena je spektrofotometrom.

Kako bi se promatrala distribucija melanina unutar tkiva kroz histologiju, svi su uzorci fiksirani u 4 postotnom fosfatnom puferiranom formalinu tijekom 24 sata. Fiksirani uzorci su ugrađeni u parafin i izrezani u 5-m rezove pomoću mikrotoma (Leica Biosystems, Wetzlar, Njemačka). Parafinske sekcije obojene su korištenjem Fontana-Masson Stain Kit-a prema uputama proizvođača i izvedena je svjetlosna mikroskopija.

Statistika

Eksperimenti provedeni u ovoj studiji ponovljeni su tri puta ili više. Statistička značajnost podataka testirana je Studentovim t-testom. Dobivene vrijednosti izražene su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija i smatrane su statistički značajnim kada je p-vrijednost manja od 0.05.

REZULTATI

Mješavina peptida inhibira sintezu melanina izazvanu MSH-om i aktivnost tirozinaze u stanicama B16F10

Kako bi se odredio učinak mješavine peptida na vitalnost stanica, stanice melanoma B16F10 i keratinociti HaCaT tretirani su smjesom peptida u koncentracijama od 10, 50, 100 i 200 M, te je proveden MTT test. Rezultati su pokazali da smjesa peptida nije bila citotoksična u ukupnim koncentracijama tretmana, a naknadni eksperimenti su izvedeni u gornjem rasponu koncentracija (slika 1A).

Kako bi se identificirao inhibitorni učinak mješavine peptida na sintezu melanina, stanice B16F10 tretirane su koncentracijama od 10, 50, 100 i 200 M da bi se usporedile stope proizvodnje melanina. Rezultati su pokazali o dozi ovisnu inhibiciju proizvodnje melanina mješavinom peptida. Stope inhibicije bile su 3 posto pri najnižoj koncentraciji od 10 M i 26 posto pri najvišoj koncentraciji od 200 M (slika 1B).

Tirozinaza je jedan od ključnih enzima u sintezi melanina. Ispitivanje aktivnosti tirozinaze provedeno je kako bi se potvrdilo da je inhibitorni učinak mješavine peptida na melanogenezu uzrokovan regulacijom tirozinaze. Rezultati su pokazali značajnu inhibiciju aktivnosti tirozinaze mješavinom peptida u stanicama B16F10. Stope inhibicije bile su 8 posto pri najnižoj koncentraciji od 10 M i 33 posto pri najvišoj koncentraciji od 200 M (slika 1C).

Zatražite više: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501