Urinarne metabolomičke promjene koje prate remisiju albuminurije nakon operacije želučane premosnice za dijabetičku bubrežnu bolest tipa 2

Sažetak:U randomiziranom kliničkom ispitivanju Microvascular Outcomes after Metabolic Surgery (MOMS RCT, NCT01821508), kombinirana metabolička kirurgija (želučana premosnica)plus medicinska terapija(CSM) bio je bolji od samo medicinske terapije (MTA) kao sredstva za postizanje remisije albuminurije nakon 2-godišnjeg praćenja u bolesnika s pretilošću irana dijabetička bolest bubrega(DKD). U ovoj studiji procijenili smo urinarni 1H-NMR metabolom u podskupini pacijenata iz obje strane MOMS RCT-a na početku i 6-mjesečnom praćenju. Dok su CSM i MTA smanjili izlučivanje šećera mokraćom, CSM je stvorio osebujni metabolomski profil mokraće karakteriziran povećanjem ko-metabolita domaćina i mikroba (N-fenilacetilglicin, trimetilamin N-oksid i 4-aminobutirat (GABA)) i aminokiseline (arginin i glutamin). Nadalje, smanjenje aromatskih aminokiselina (fenilalanin i tirozin), kao i aminokiselina razgranatog lanca (BCAA) i srodnih katabolita (valin, leucin, 3-hidroksibutirat, 3-hidroksiizovalerat i {{11 }}metil-2- izovalerat), primijećeni su nakon CSM, ali ne i MTA. Poboljšanja BMI-a nisu bila u korelaciji s poboljšanjima metaboličkih i bubrežnih indeksa nakon CSM-a. Suprotno tome, urinarni metaboliti koje je promijenio CSM nakon 6 mjeseci bili su umjereno do snažno povezani s poboljšanjima krvnog tlaka, glikemije, triglicerida i albuminurije do 24 mjeseca nakon početka liječenja, naglašavajući potencijalnu uključenost ovih pomaka u metabolomičkom profilu urina u metaboličkom i renoprotektivne učinke CSM-a.

Ključne riječi: albuminurija; želučana operacija; BCAA;kronična bolest bubrega;dijabetička bolest bubrega; želučana premosnica; metabolomika; NMR spektroskopija; pretilost;dijabetes tipa 2 

Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Kupite za više pojedinosti o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE S 25% EHINAKOSIDA I 9% AKTEOZIDA ZA FUNKCIJU BUBREGA

1. Uvod

Dijabetička bolest bubrega (DKD) pogađa do 40% ljudi s dugotrajnom šećernom bolešću tipa 2 i vodeći je uzrok završnog stadija bubrežne bolesti [1,2]. Dok je blokada renin-angiotenzin-aldosteronskog sustava bila okosnica liječenja DKD-a u posljednja dva desetljeća [3], značajan rezidualni rizik od progresivne bubrežne bolesti i ubrzane kardiovaskularne bolesti ostao je u osoba s DKD-om unatoč intenzivnom liječenju [4]. Nedavno su farmakološkom naoružanju dodane dvije nove klase lijekova, naime inhibitori kotransportera-2 natrij-glukoza [5,6] i analozi GLP-1 receptora [7]. Baza dokaza za antagonist endotelin-A receptora atrasentan [8] i nesteroidni, selektivni antagonist mineralokortikoidnog receptora finer enon [9] slijedi u stopu iza. Zajedno, ovi lijekovi obećavaju poboljšanje rezultata.

Epidemiološki podaci iz zdravstvenih registara, longitudinalnih kohorti i analiza blizanaca utvrđuju pretilost kao neovisni čimbenik rizika za nastanak i progresiju kronične bubrežne bolesti (CKD), uključujući DKB [10-13]. S obzirom na visoku prevalenciju pretilosti u osoba s KBB-om, s prijavljenim stopama u rasponu od 35-44% [14,15], namjensko liječenje pretilosti predstavlja obećavajuće sredstvo za poboljšanje kardiovaskularnih i bubrežnih ishoda u ovom okruženju. Kao najučinkovitiju intervenciju mršavljenja, sve veći broj istraživanja usmjeren je na renoprotektivne i kardioprotektivne učinke barijatrijske kirurgije u bolesnika s DKD [16-18].

Nedavno smo izvijestili o 2-godišnjim rezultatima randomiziranog kliničkog ispitivanja (RCT) Microvascular Outcomes after Metabolic Surgery (MOMS), uspoređujući učinak kombinirane metaboličke kirurgije i medicinske terapije (CSM) naspram samo intenzivne medicinske terapije (MTA) na izlučivanje albumina urinom u bolesnika s DKD-om i indeksom tjelesne mase (BMI) u rasponu od 30-35 kg/m2 (NCT01821508). Roux-en-Y operacija želučane premosnice (RYGB) bila je korištena metabolička operacija [19]. Remisija mikroalbuminurije dogodila se u 55% (95% CI, 39-70%) bolesnika nakon MTA i u 82% (95% CI, 72-93%) bolesnika nakon CSM-a na 2-godišnjem praćenju [ 20].

Mjerenje izlučivanja albumina u urinu samo po sebi daje nepotpunu sliku odgovora bubrežnog parenhima na RYGB. U tu smo svrhu pokazali na predkliničkim modelima DKD-a kod štakora da utjecaj RYGB-a na albuminuriju odražava strukturna poboljšanja u glomerulu i pojavu reparativnog obrasca globalnih promjena u transkriptomu bubrežne kore [21-24]. Dok histološka i molekularna procjena bubrežnog tkiva nakon RYGB-a kod ljudi nije izvediva, procjena promjena u izlučivanju metabolita urinom jest. Takva analiza ima potencijal biti od vrijednosti za stvaranje hipoteza s obzirom na mehanizme i posrednike smanjenjaozljeda bubreganakon postupka, a također bi mogao dati obrasce promjene metabolita od prognostičke korisnosti.

Sadašnja studija stoga se posvetila profiliranju putanja promjena u izlučivanju metabolita u urinu koje se javljaju između početne vrijednosti i 6-mjesečnog praćenja u podskupini pacijenata iz obje strane MOMS RCT. Namjeravali smo okarakterizirati diskretne rane promjene u urinarnom metabolomu povezane s CSM-om, s namjerom identificiranja ranih metabolomičkih pomaka koji predviđaju, i potencijalno funkcionalno povezani s, povoljnijom metaboličkom i bubrežnom prognozom povezanom s ovom intervencijom na {{2} }godišnje praćenje.

2. Rezultati

2.1. Osnovne karakteristike MOMS RCT pacijenata uključenih u podstudiju

Tablica 1 dokumentira osnovne kliničke i biokemijske parametre za sudionike podispitivanja. Dob i spol bili su usporedivi u svim skupinama studije, iako je prevalencija bijelaca bila veća u skupini CSM u usporedbi s skupinom MTA (92% naspram 64%, p=0.05). Nisu primijećene razlike između krakova studije na početku u smislu antropometrije, krvnog tlaka, lipida u krvi, glikiranog hemoglobina (HbA1c), kreatinina u serumu ili omjera albumin-kreatinin u mokraći (ACR). Središnje tendencije za metaboličke i bubrežne parametre karakteriziraju ispitanu populaciju kao bolesnike s pretilošću klase I (BMI od 30-35 kg/m2), neadekvatno kontroliranim dijabetesom melitusom tipa 2 (HbA1c veći ili jednak 48 mmol/mol ili 6,5%). , mikroalbuminurija (uACR 30–300 mg/g) i očuvana bubrežna funkcija (prosječna vrijednost serumskog kreatinina ~0,8 mg/dL).

Tablica 1. Polazne karakteristike skupine pod-ispitivanja 1,

2.2. Poboljšanja metaboličkih i bubrežnih parametara među pacijentima uključenim u podispitivanje

U odnosu na početnu vrijednost, nakon 6 i 24 mjeseca praćenja, pacijenti uključeni u oba kraka podispitivanja pokazali su značajno smanjenje uACR-a, što se dogodilo u kontekstu poboljšanja kontrole glikemije i dislipidemije, a u slučaju CSM-a skupini, medijan smanjenja BMI-a od 26% (Tablica 2). Među pacijentima uključenim u podispitivanje, poboljšanja lipidnih indeksa i uACR bila su slična između CSM i MTA krakova u 6. i 24. mjesecu. Smanjenje BMI-a, sistoličkog krvnog tlaka i HbA1c bilo je veće u {{1{{14} }}}mjesečno praćenje u CSM kraku u usporedbi s MTA krakom, s medijanom smanjenja BMI od 26% primijećenim u CSM kraku održanom do 24. mjeseca (p < 0,001 za usporedbu s medijanom opaženog smanjenja BMI od 6% u kraku MTA u istoj vremenskoj točki).

2.3. Pregled urinarnog 1H-NMR metaboloma i metrike kontrole kvalitete

Ukupno je detektirano 475 pikova u 'H-NMR spektrima. Od njih je 208 označeno, dajući urinarni metabolom koji se sastoji od 70 jedinstvenih metabolita. Koeficijent varijacije u PQN-normaliziranom vršnom intenzitetu među osnovnim (n=5) i 6. mjesecom (n=5) ​​objedinjenim uzorcima bio je manji od 5% za mnoge, a manji od 15% za većinu, označenih 1H-NMR pikova (Slika 1A). Ilustrativni dijagrami PQN-normaliziranih spektara združenih uzoraka za određene vrhove za koje je utvrđeno da su CSM promijenjeni multivarijantnom analizom pokazuju da je varijanca osnovne vrijednosti i skupnih uzoraka 6. mjeseca bila niska (Slika 1B). Stoga je prikupljanje 1H-NMR podataka bilo tehnički zadovoljavajuće, s prihvatljivim razinama varijacija uočenih između skupnih uzoraka uključenih kao interna kontrola kvalitete.

Tablica 2. Promjene u ishodima studije u 6. i 24. mjesecu u kohorti pod-ispitivanja s dostupnim uparenim uzorcima urina 1,2.

1 CSM, kombinirana metabolička kirurgija plus medicinska terapija; HbA1c, glikirani hemoglobin; IQR, interkvartilni raspon; LDL, lipoprotein niske gustoće; MTA, samo medicinska terapija; uACR, omjer albumina i kreatinina u mokraći. 2 Vrijednosti su dane kao medijan [IQR]. Usporedbe između grupa napravljene su Wilcoxonovim testom zbroja rangova. p-vrijednosti < 0.05 podebljane su.

Slika 1. Varijanca u vršnom intenzitetu između osnovnih (n=5) i 6. mjeseca (n=5) objedinjenih uzoraka uključenih kao interna kontrola kvalitete. (A) Grafik gustoće koji prikazuje distribuciju vrijednosti koeficijenta varijacije za PQN-normalizirani vršni intenzitet označenih 1H-NMR vršnih vrijednosti (n=208). Postotak koeficijenta varijacije izračunat je kako slijedi za svaki vrh: (standardna devijacija intenziteta vrha/srednji intenzitet intenziteta vrha) × 100. Izračuni su obavljeni odvojeno za početnu vrijednost i za objedinjene uzorke za 6. mjesec. Os x je logaritamski transformirana korištenjem 'log1p' transformacije iz R paket ljestvica [25]. Okomite isprekidane linije označavaju vrijednosti koeficijenta varijacije od 5% i 15%. (B) Prikazi PQN-normaliziranih spektara združenih uzoraka za određene vrhove su se promijenili pomoću CSM multivarijantnom analizom. Dijagrami su generirani pomoću funkcije 'ROIplot' iz R paketa speak [26]. Okomite isprekidane linije ocrtavaju PPM pomak za svaki vrh na x-osi. Vrijednosti koeficijenta varijacije za osnovne (plavo) i za 6. mjesec (narančasto) objedinjene uzorke superponiraju se na dijagramima. 1H-NMR, spektroskopija protonske nuklearne magnetske rezonancije; CV, koeficijent varijacije (%); PPM, dijelovi na milijun kemijskog pomaka u odnosu na TSP-d4; PQN, normalizacija kvocijenta vjerojatnosti.

2.4. Analiza glavnih komponenti urinarnih 1H-NMR pikova

Grupiranje duž prve tri glavne komponente identificiralo je diskretne promjene između skupina u urinarnom metabolomu (Slika 2A,B). Tri izvanredna uzorka (dvije bazne linije, jedan MTA6) identificirana su na dijagramu rezultata (Slika 2A). Ti su uzorci uključeni u multivarijantne analize budući da njihovo isključivanje nije znatno promijenilo izvedbu modela parcijalnih najmanjih kvadrata (PLS) niti vrhove koji su identificirani kao važni za modele. Najviše varijabilnosti primijećeno je u osnovnim uzorcima, za koje je, na temelju opterećenja, utvrđeno da su primarno posljedica ekskurzija u šećerima kao što su glukoza, manoza i saharoza prije intenziviranja tretmana (Slika 2C). Valin aminokiselina razgranatog lanca (BCAA) također je pridonio disperziji u osnovnim uzorcima. MTA6 uzorci grupirani su bliže osnovnim uzorcima nego CSM6 uzorci. Utvrđeno je da se odvajanje uzoraka CSM6 od ostalih uzoraka može pripisati povećanom obilju metabolita kao što su N-fenilacetilglicin i trimetilamin N-oksid na dijagramu opterećenja.

Slika 2. Analiza glavne komponente (PCA) PQN-normaliziranih urinarnih 1H-NMR vrhova za sve dostupne uzorke (n=97). Broj uzoraka po skupini: početna vrijednost, n=54; CSM6, n=19; MTA6, n=24. Predstavljene su prve tri glavne komponente, s postocima ukupne varijance objašnjene svakom od ovih glavnih komponenti navedenih u naslovima osi. PCA rezultati i elipsoidi su stratificirani po studijskim grupama. Osnovni uzorci iz CSM i MTA krakova razmatrani su zajedno. (A) PCA rezultati. PCA rezultati označeni su točkama, okomite linije ocrtavaju xy lokaciju točaka; (B) PCA elipsoidi. PCA elipsoidne točke izračunate su pomoću funkcije 'makeEllipsoid' iz R paketa ChemoSpec [27], a prikazane su kako bi se jasnije ocrtalo diskretno grupiranje između skupina uzoraka. Centroidi (srednji PCA rezultati) istaknuti su crnim točkama za tri skupine uzoraka; (C) PCA opterećenja s označenim odabranim vrhovima. Točke su obojene prema vrijednostima opterećenja duž glavne komponente 1. CSM6, uzorci 6. mjeseca iz grupe CSM; MTA6, uzorci 6. mjeseca iz MTA grupe; PC, glavna komponenta; PCA, analiza glavnih komponenti; PQN, normalizacija kvocijenta vjerojatnosti.

2.5. Fold Change Razlike u vršnom intenzitetu 1H-NMR urina pomoću Univarijatnog testiranja

Univarijatnim testiranjem nisu primijećene značajne razlike u obilju metabolita u urinu između osnovnih uzoraka iz MTA i CSM skupina (Slika 3A). Najjača promjena u uzorcima MTA od početne vrijednosti do 6. mjeseca bilo je nestatistički značajno smanjenje izlučivanja glukoze urinom (Slika 3B). Veličina smanjenja izlučivanja glukoze u urinu bila je veća od početne vrijednosti do 6. mjeseca u uzorcima CSM-a i dosegla je statističku značajnost (Slika 3C). Nadalje, nakon CSM-a došlo je do isključivog povećanja izlučivanja niza metabolita u urinu. Najznačajniji među njima bilo je nekoliko pikova koji sadrže N-fenilacetilglicin, trimetilamin N-oksid, 4-aminobutirat (GABA) i 1-metilnikotinamid. Posljedično, glavne razlike između uzoraka 6. mjeseca iz MTA i CSM krakova odnosile su se na povećano izlučivanje metabolita u urinu nakon RYGB, uključujući gore navedene metabolite kao i aminokiseline arginin i glutamin (Slika 3D). U usporedbi s MTA krakom, koncentracije šećera u mokraći kao što su saharoza i arabinoza, kao i BCAA valin, također su bile niže u CSM kraku u 6. mjesecu.

2.6. Osnovne metabolomske razlike u urinu između ispitivanih skupina: MTA0 u odnosu na CSM0

Klasifikacijski model PLS za osnovne razlike između grupa pokazao se boljim od očekivanog, iako je još uvijek bio prilično slab s AUC od 0,7 (dodatna slika S1A). PLS model pogrešno je klasificirao 17 od 54 uzorka, što je rezultiralo ukupnom točnošću od 69% (Slika S1B), sa svim relevantnim 'max' MUVR modelom koji identificira preko 200 1H-NMR vrhova kao potencijalno korisnih u klasifikaciji CSM i MTA uzorci na početku (Slika S1C). Stvarni PLS model pogrešno je klasificirao manje uzoraka od permutiranih modela s nasumično uzorkovanim Y vektorom odgovora (p=0.01; Slika S1D). Mnogi od vrhunaca važnih za izvedbu modela bili su uremični toksini (fenol, gvanidinoacetat) ili šećeri (fukoza, manitol, saharoza), iako usmjerenost promjene ovih dviju skupina metabolita nije bila dosljedna između dva kraka studije (Slika S1E). Nadalje, nijedan od metabolita identificiranih ovim modelom nije se značajno razlikovao između oba kraka na početku univarijatnim testiranjem (Slika 3A). Ove suptilne promjene u metabolomičkim profilima urina stoga nisu bile indikativne za sustavnu razliku u težini bolesti na početku između CSM i MTA krakova.

2.7. Urinarni metaboliti koji se mogu pripisati razlikama u etničkoj pripadnosti u MTA kraku: bijelci u odnosu na druge etničke pripadnosti u uzorcima MTA0

Kako su postojale razlike u etničkoj pripadnosti u MTA kraku na početku (Tablica 1; 64% su bili bijelci, a 36% su bili druge etničke pripadnosti, uključujući Južnoamerikance, Azijate i Afrikance), model PLS klasifikacije bijelaca (n {{3} }) u odnosu na druge etničke pripadnosti (n=10) konstruiran je kako bi se ispitale razlike povezane s etničkom pripadnošću u urinarnom metabolomu u osnovnim uzorcima MTA. PLS model imao je visoku stopu pogrešne klasifikacije (18 od 28 uzoraka je pogrešno klasificirano; ukupna točnost klasifikacije od 36%) i nisku osjetljivost (50%) i specifičnost (10%; Slika S2A), unatoč optimizaciji izvedbe validacije (Slika S2B) . Stvarni PLS model nije imao bolje rezultate od permutiranih modela s nasumično uzorkovanim Y vektorom odgovora (p=0.97; slika S2C). Općenito, model PLS nije pružio dokaze koji bi upućivali na sustavnu razliku u metabolomičkim profilima urina između pojedinaca bijele rase i drugih etničkih skupina.

2.8. Promjene u urinarnom metabolomu nakon MTA: MTA0 u odnosu na MTA6

PLS model koji koristi sve dostupne uzorke između početne vrijednosti i 6. mjeseca u MTA kraku bio je prilično slab, s AUC od 0,68 (Slika S3A). Model je pogrešno klasificirao 19 od 52 uzorka, što je rezultiralo ukupnom točnošću od 63% (Slika S3B), unatoč optimizaciji izvedbe validacije 'max' modela minimiziranjem broja pogrešnih klasifikacija (Slika S3C). Stvarni PLS model nije imao nižu stopu pogrešne klasifikacije od nasumično promijenjenih modela (p {{10}}.06; Slika S3D). Oba označena vrha koja su bila najvažnija za izvedbu modela uključena su u metabolizam nikotinamida, naime 1-metilnikotinamid i trigonelin (N-metilnikotinat) (Slika S3E). Izlučivanje 1-metilnikotinamida mokraćom povećalo se nakon MTA, dok se izlučivanje trigonelina smanjilo. Inače, glavne razlike između uzoraka MTA od početne vrijednosti do 6. mjeseca bile su povezane sa smanjenjem izlučivanja glukoze i srodnih metabolita mokraćom. Međutim, niti jedan od metabolita identificiranih ovim modelom nije se značajno razlikovao između uzoraka MTA0 i MTA6 univarijantnim testiranjem (Slika 3B).

PLS model, koji je koristio samo uparene uzorke između početne vrijednosti i 6. mjeseca u MTA kraku, bio je slab, s AUC od 0.56 (Slika S4A) i ukupnom točnošću klasifikacije od 46% (Slika S4B), unatoč obuka i podešavanje parametara modela za optimizaciju izvedbe validacije (Slika S4C). Broj pogrešnih klasifikacija ovim modelom nije bio manji od onog postignutog nasumično promijenjenim modelima (p=0.59; slika S4D). Kada se obilje svih metabolita u uzorcima u 6. mjesecu iz kraka MTA razmatra zajedno, na primjer analizom glavnih komponenti, bilo ih je moguće razlikovati od osnovnih uzoraka (Slika 2A). Međutim, identifikacija pojedinačnih metabolita koja je omogućila točno predviđanje početne vrijednosti i statusa u 6. mjesecu u grani MTA pokazala se teškom, što ukazuje da su promjene pojedinačnih metabolita u grani MTA općenito bile slabe. Sukladno tome, vrijednosti varijable važnosti u projekciji (VIP) za prva 20 metabolita koji doprinose PLS modelu uparenih uzoraka MTA0 u odnosu na MTA6 bile su veće (što ukazuje na manju važnost varijable) nego za prvih 20 metabolita koji doprinose drugim modelima PLS (Slika S4E), posebno onih koji uključuju uzorke iz 6. mjeseca iz kraka CSM-a.

2.9. Promjene u urinarnom metabolomu nakon CSM-a: CSM0 u odnosu na CSM6

Model PLS koji je koristio sve dostupne uzorke između početne vrijednosti i 6. mjeseca u kraku CSM imao je mnogo bolje rezultate od odgovarajućeg modela za krak MTA, s AUC od 0,93 (Slika 4A). Model je pogrešno klasificirao 6 od 45 uzoraka, što je rezultiralo ukupnom točnošću od 87%, osjetljivošću od 88% i specifičnošću od 84% (Slika 4B). Broj pogrešnih klasifikacija također je učinkovito smanjen na približno nulu tijekom optimizacije izvedbe validacije (Slika 4C). Izvedba stvarnog CSM0 naspram CSM6 PLS modela bila je značajno bolja od nasumično promijenjenih modela (p < 0.001; Slika 4D).

Slika 4. Multivarijatna analiza promjena u urinarnom metabolomu od početne vrijednosti do 6. mjeseca u kraku CSM (svi dostupni uzorci). Broj uzoraka unesenih u MUVR PLS model: CSM0, n=26; CSM6, n=19. (A) Radna karakteristična krivulja prijamnika za MUVR PLS klasifikacijski model odgovara vršnim vrijednostima 1H-NMR urina za ove dvije skupine uzoraka. Umetnuti su AUC i povezani 95% CI za krivulju. (B) Matrica zabune koja prikazuje klasifikaciju uzorka prema PLS modelu. X-os predstavlja stvarnu klasu unesenih uzoraka. Y-os predstavlja klasu uzorka koju predviđaju modeli. Točno i netočno klasificirani uzorci ocrtavaju se na suprotnim dijagonalama matrice zabune. Dodatne metrike izvedbe koje se odnose na klasifikaciju uzorka na pragu vjerojatnosti od 50% prikazane su u tablici uz matricu zabune. (C) Rekurzivno rangiranje i eliminacija varijabli unatrag (zdesna nalijevo na x-osi) u unutarnjim segmentima MUVR PLS modela kako bi se postigla optimalna izvedba validacije, kvantificirana brojem pogrešnih klasifikacija (y-osa). Zelene linije predstavljaju krivulje provjere po unutarnjem segmentu i mogu varirati. Narančaste i crne linije predstavljaju krivulje unutarnjeg segmenta u prosjeku po ponavljanju modela odnosno ukupnom (100 ponavljanja modela) te opisuju stvarnu izvedbu provjere valjanosti pri višoj razlučivosti. Okomite linije ocrtavaju broj varijabli odabranih u modelima MUVR 'min', 'mid' i 'max' na x-osi. (D) Histogram i krivulja gustoće koja ocrtava distribuciju pogrešnih klasifikacija prema 500 permutiranih PLS modela, u kojima je Y vektor odgovora koji označava klasu uzorka nasumično odabran. Broj pogrešnih klasifikacija prema stvarnom PLS modelu s točnim Y vektorom odgovora označen je na x-osi plavom isprekidanom linijom. P-vrijednost izvedena iz Studentovog t-testa koji uspoređuje broj pogrešnih klasifikacija između stvarnih i permutiranih modela prikazana je uz histogram i krivulju gustoće. (E) Točkasti grafikon od 20 najvažnijih označenih vrhova performansi PLS modela rangiranih prema VIP vrijednostima. Za određene metabolite identificirano je više vršnih vrijednosti. Kada je više metabolita prisutno u danom vrhuncu, metaboliti su navedeni redoslijedom relativne zastupljenosti u vrhu, pri čemu je najzastupljeniji metabolit naveden prvi. Susjedna toplinska karta ilustrira relativnu zastupljenost metabolita na temelju srednjeg vršnog intenziteta u svim uzorcima u dvije skupine procijenjene PLS modelom. 95% CI, 95% interval pouzdanosti; AUC, površina ispod krivulje radne karakteristike prijemnika; CSM0, osnovni uzorci iz CSM grupe; CSM6, uzorci 6. mjeseca iz CSM grupe; MUVR, multivarijatne metode s nepristranim odabirom varijabli u R; NMR, spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije; NPV, negativna prediktivna vrijednost; PLS, djelomični najmanji kvadrati; PPM, dijelovi na milijun kemijskog pomaka u odnosu na TSP-d4; PPV, pozitivna prediktivna vrijednost; VIP, promjenljiva važnost u projekciji.

Stoga su se nakon RYGB-a dogodile karakteristične metabolomske promjene, koje su omogućile točnu klasifikaciju početnih uzoraka i uzoraka u 6. mjesecu u kraku CSM. Svih sedam najvažnijih označenih vrhova za izvedbu modela sadržavalo je ko-metabolit domaćina i mikroba N-fenilacetilglicin, čije je izlučivanje mokraćom povećano nakon CSM-a (Slika 4E). Nakon CSM-a primijećeno je povećano izlučivanje urinom drugih ko-metabolita domaćina i mikroba, uključujući trimetilamin N-oksid i 4-aminobutirat (GABA). Izlučivanje aminokiselina glutamina i arginina mokraćom također se povećalo nakon CSM-a, dok se izlučivanje glukoze i BCAA valina smanjilo. Log2 puta vrijednosti promjene i prilagođene p-vrijednosti izvedene iz univarijantnog testiranja razlika između grupa u intenzitetu vršnog intenziteta 1H-NMR urina za vršne vrijednosti identificirane kao različito obilne između uzoraka CSM0 i CSM6 sažeti su u Tablici 3 u nastavku. VIP metrike iz PLS modela relevantnih usporedbi također su prikazane u tablici.

PLS model koji je koristio samo uparene uzorke između početne vrijednosti i 6. mjeseca u CSM kraku imao je slične rezultate kao model koji je koristio sve dostupne uzorke iz obje vremenske točke, s AUC od 0.94 (Slika S5A) i ukupna točnost klasifikacije od 82% (Slika S5B). Slično modelu CSM0 nasuprot CSM6 PLS koji koristi sve dostupne uzorke, izvedba provjere valjanosti ovog modela uparenih uzoraka optimizirana je tako da gotovo da nema pogrešnih klasifikacija (Slika S5C). Broj pogrešnih klasifikacija prema PLS modelu stvarnih uparenih uzoraka bio je značajno niži nego u nasumično promijenjenim modelima (p=0.006; slika S5D). Oba CSM0 naspram CSM6 PLS modela, korištenjem svih dostupnih uzoraka i samo uparenih uzoraka, identificirala su vrlo slične metabolite kao važne za razlikovanje osnovnih i uzoraka u 6. mjesecu u CSM kraku. Nekoliko vršnih vrijednosti N-fenilacetilglicina ponovno je identificirano kao najvažnije označene vršne vrijednosti za izvedbu PLS modela uparenih uzoraka (Slika S5E). Izlučivanje urinom većine metabolita koji su identificirani kao važni za izvedbu modela povećalo se nakon CSM-a, s iznimkom fenilalanina i valina, čije se izlučivanje urinom smanjilo nakon CSM-a.

2.10. Razlike u urinarnom metabolomu između CSM i MTA

Grupe nakon 6 mjeseci liječenja: MTA6 naspram CSM6 PLS model za 6. mjesec razlike između grupa pokazao se dobro, s AUC od 0.91 (Slika 5A). Model je pogrešno klasificirao 6 od 43 uzorka, što je rezultiralo ukupnom točnošću klasifikacije od {{10}}%, osjetljivošću od 79% i specifičnošću od 92% (Slika 5B). Slično obama modelima CSM0 u odnosu na CSM6 PLS, izvedba provjere valjanosti ovog modela optimizirana je tako da gotovo da nema pogrešnih klasifikacija (Slika 5C). Broj pogrešnih klasifikacija prema stvarnom modelu MTA6 u odnosu na CSM6 PLS bio je značajno niži od onog postignutog permutiranim modelima s nasumično uzorkovanim vektorom odgovora Y (p < 0,001; Slika 5D).

Metaboliti koji su identificirani kao važni za izvedbu modela MTA6 naspram CSM6 bili su uglavnom oni čije se izlučivanje mokraćom snažno promijenilo nakon CSM-a i stoga su identificirani kao utjecajni metaboliti u smislu klasificiranja osnovnih i uzoraka 6. mjeseca u kraku CSM-a (Slika 5E) . Nekoliko vršnih vrijednosti koje sadrže N-fenilacetilglicin ponovno je identificirano kao najvažnije vršne vrijednosti za klasifikaciju modela. Koncentracije arginina, glutamina, N-fenilacetilglicina, 4-aminobutirata i trimetilamin N-oksida u urinu bile su više u CSM skupini u usporedbi s MTA skupinom u 6. mjesecu. Nasuprot tome, izlučivanje glukoze, valina i fenilalanina urinom bilo je niži u CSM kraku u usporedbi s MTA krakom u 6. mjesecu.

Slika 5. Multivarijantna analiza razlika između skupina u metabolomu urina u 6. mjesecu (svi dostupni uzorci). Broj uzoraka unesenih u MUVR PLS model: CSM6, n=19; MTA6, n=24. (A) Radna karakteristična krivulja prijamnika za MUVR PLS klasifikacijski model odgovara vršnim vrijednostima 1H-NMR urina za ove dvije skupine uzoraka. Umetnuti su AUC i povezani 95% CI za krivulju. (B) Matrica zabune koja prikazuje klasifikaciju uzorka prema PLS modelu. X-os predstavlja stvarnu klasu unesenih uzoraka. Y-os predstavlja klasu uzorka koju predviđaju modeli. Točno i netočno klasificirani uzorci ocrtavaju se na suprotnim dijagonalama matrice zabune. Dodatne metrike izvedbe koje se odnose na klasifikaciju uzorka na pragu vjerojatnosti od 50% prikazane su u tablici uz matricu zabune. (C) Rekurzivno rangiranje i eliminacija varijabli unatrag (zdesna nalijevo na x-osi) u unutarnjim segmentima MUVR PLS modela kako bi se postigla optimalna izvedba validacije, kvantificirana brojem pogrešnih klasifikacija (y-osa). Zelene linije predstavljaju krivulje provjere po unutarnjem segmentu i mogu varirati. Narančaste i crne linije predstavljaju krivulje unutarnjeg segmenta u prosjeku po ponavljanju modela odnosno ukupnom (100 ponavljanja modela) te opisuju stvarnu izvedbu provjere valjanosti pri višoj razlučivosti. Okomite linije ocrtavaju broj varijabli odabranih u modelima MUVR 'min', 'mid' i 'max' na x-osi. (D) Histogram i krivulja gustoće koja ocrtava distribuciju pogrešnih klasifikacija prema 500 permutiranih PLS modela, u kojima je Y vektor odgovora koji označava klasu uzorka nasumično odabran. Broj pogrešnih klasifikacija prema stvarnom PLS modelu s točnim Y vektorom odgovora označen je na x-osi plavom isprekidanom linijom. P-vrijednost izvedena iz Studentovog t-testa koji uspoređuje broj pogrešnih klasifikacija između stvarnih i permutiranih modela prikazana je uz histogram i krivulju gustoće. (E) Točkasti grafikon od 20 najvažnijih označenih vrhova performansi PLS modela rangiranih prema VIP vrijednostima. Za određene metabolite identificirano je više vršnih vrijednosti. Kada je više metabolita prisutno u danom vrhuncu, metaboliti su navedeni redoslijedom relativne zastupljenosti u vrhu, pri čemu je najzastupljeniji metabolit naveden prvi. Susjedna toplinska karta ilustrira relativnu zastupljenost metabolita na temelju srednjeg vršnog intenziteta u svim uzorcima u dvije skupine procijenjene PLS modelom. 95% CI, 95% interval pouzdanosti; AUC, površina ispod krivulje radne karakteristike prijemnika; CSM6, uzorci 6. mjeseca iz CSM grupe; MTA6, uzorci 6. mjeseca iz MTA grupe; MUVR, multivarijatne metode s nepristranim odabirom varijabli u R; NMR, spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije; NPV, negativna prediktivna vrijednost; PLS, djelomični najmanji kvadrati; PPM, dijelovi na milijun kemijskog pomaka u odnosu na TSP-d4; PPV, pozitivna prediktivna vrijednost; VIP, promjenljiva važnost u projekciji.

Tablica 3 predstavlja sažetak log2 puta vrijednosti promjene i prilagođenih p-vrijednosti izvedenih iz univarijantnog testiranja razlika između grupa u intenzitetu vršnog intenziteta 1H-NMR urina, kao i VIP metrike iz PLS klasifikacijskih modela relevantnih usporedbi, za vršne vrijednosti promijenjene za CSM od početka do 6-mjesečnog praćenja. Vrhunska 20 označena vrha, prema VIP rangu, identificirana PLS modelima za CSM0 u odnosu na CSM6 sve dostupne uzorke, CSM0 u odnosu na CSM6 uparene uzorke i MTA6 u odnosu na CSM6 sve dostupne prikazane su usporedbe uzoraka. Bilo je značajnog preklapanja najvažnijih vrhova u sva 3 modela, što je rezultiralo s ukupno 25 različitih vrhova koje je CSM identificirao kao promijenjene. Među ovih 25 vrhova, nekoliko spojeva, kao što su N-fenilacetilglicin i valin, predstavljeno je više puta. Za svaki spoj s više vršnih vrijednosti odabran je jedan reprezentativni kemijski pomak kako bi se smanjilo dupliciranje informacija prikazanih u tablici 3.

2.11. Korelacije među vršnim vrijednostima i obilje po kraku studije i vremenskoj točki vršnih vrijednosti koje je CSM promijenio s osnovne vrijednosti na 6. mjesec

Na temelju gore istaknutih PLS modela, kao i ručnog pregleda spektra, identificirano je 14 metabolita koje je CSM promijenio od početne vrijednosti do 6. mjeseca i s povezanim funkcionalnim skupinama. Grupiranje međuvršnih korelacija između ovih 14 metabolita identificiralo je tri klastera sastavljena od ko-metabolita domaćina i mikroba, razgranatog lanca i aromatskih aminokiselina i BCAA kataboličkih intermedijera (Slika 6A). Koncentracije različitih ko-metabolita domaćina i mikroba u urinu bile su međusobno snažno povezane, kao i razgranati lanac i aromatske aminokiseline. BCAA katabolički intermedijeri bili su u slabijoj međusobnoj korelaciji. Aromatske aminokiseline jače su povezane s BCAA nego s ko-metabolitima domaćina i mikroba, unatoč činjenici da je izmijenjeni metabolizam aromatskih aminokiselina domaćina i mikroba rezultirao proizvodnjom metabolita kao što su N-fenilacetilglicin i 4-hidroksifenilacetat je dosljedno prijavljivano nakon RYGB [28-33].

U kraku CSM, povećano izlučivanje metabolita urinom od početne vrijednosti do 6. mjeseca odražava promjene u metabolizmu crijevnih mikroba i intestinalnom transportu aminokiselina nakon RYGB bilo je izraženo i snažno statistički značajno za N-fenilacetilglicin (p < 0. 001), trimetilamin N-oksid (p=0.001), 4-aminobutirat (GABA; p=0.002), arginin (p=0.001) i glutamin (p=0.001) (Slika 6B). MTA nije promijenio izlučivanje ovih metabolita urinom.

Slično, izlučivanje aromatičnih aminokiselina urinom, fenilalanina (p=0.003) i tirozina (p=0.003), kao i BCAA valina (p=0.001) i leucin (p=0.02), bio je značajno smanjen od početne vrijednosti do 6. mjeseca nakon CSM-a, ali ne i MTA. Izlučivanje BCAA izoleucina u urinu također je bilo niže nakon CSM-a, ali to nije bilo značajno (p=0.25). U skladu sa smanjenim izlučivanjem BCAA urinom i ukazujući na pojačani katabolizam BCAA, izlučivanje BCAA kataboličkih intermedijera u urinu također se smanjilo nakon CSM-a. Koncentracije valina (3-hidroksiizobutirat; p=0.04), izoleucina (3-metil-2-oksovalerat; p=0.04) i leucina ( 3-hidroksiizovalerat; p=0.06) kataboliti su se smanjili nakon CSM, ali ne i MTA.

Slika 6. Međuvršne korelacije i brojnost po kraku studije i vremenskoj točki vršnih vrijednosti koje je CSM promijenio od osnovne vrijednosti do 6. mjeseca. (A) Toplinska karta korelacija između PQN-normaliziranih vrijednosti vršnog intenziteta za 14 odabranih metabolita. Metaboliti su odabrani na temelju toga što ih je CSM identificirao kao jako promijenjene od početne vrijednosti do 6. mjeseca pomoću multivarijantnih PLS modela. Dodatni metaboliti ručno su odabrani na temelju pripadnosti sličnim funkcionalnim skupinama onima metabolitima identificiranim PLS modelima. Redovi i stupci toplinske karte prikazuju pojedinačne metabolite, a vrijednosti Pearson r korelacije prikazane su u ćelijama toplinske karte. Funkcionalne skupine metabolita identificirane su napomenama u redovima i stupcima kako slijedi: plavi=metaboliti odražavaju promjene u metabolizmu crijevnih mikroba ili crijevnom transportu nakon RYGB-a; sivi=metaboliti koji odražavaju katabolizam BCAA; smeđa=aromatske aminokiseline. Praznine u redovima i stupcima toplinske karte označavaju klastere metabolita na temelju korelacijskih koeficijenata. (B) PQN-normalizirana brojnost prema kraku studije i vremenskoj točki 14 metabolita navedenih u toplinskoj karti na ploči (a). Broj uzoraka: CSM0, n=26; CSM6, n=19; MTA0, n=28; MTA6, n=24. Gornja 2 retka (plave ploče) označavaju metabolite koji odražavaju promjene u metabolizmu crijevnih mikroba ili crijevnom transportu nakon RYGB. Donja 2 reda označavaju aromatske aminokiseline (smeđe ploče) i metabolite koji odražavaju BCAA katabolizam (sive ploče). Prikazane su p-vrijednosti izvedene iz neuparenih t-testova početne vrijednosti i 6. mjeseca razlika u vršnom intenzitetu u CSM i MTA krakovima. p-vrijednosti su višestruko korigirane za broj usporedbi Benjamini-Hochbergovom metodom. BCAA, aminokiselina razgranatog lanca; CSM, kombinirana metabolička kirurgija plus medicinska terapija; CSM0, osnovni uzorci iz CSM grupe; CSM6, uzorci 6. mjeseca iz CSM grupe; MTA, samo medicinska terapija; MTA0, osnovni uzorci iz MTA grupe; MTA6, uzorci 6. mjeseca iz MTA grupe; PLS, djelomični najmanji kvadrati; PQN, normalizacija kvocijenta vjerojatnosti; RYGB, Roux-en-Y operacija želučane premosnice.

2.12. Korelacije između promjena u metabolitima koje odražavaju ko-metabolizam domaćin-domaćin-mikrobni i BCAA

Katabolizam s poboljšanjima metaboličkih i bubrežnih indeksa nakon CSM-a za DKD. Poboljšanja pojedinačnih metaboličkih i bubrežnih parametara od početne vrijednosti do 6. mjeseca nakon CSM-a bila su snažno povezana s veličinom poboljšanja uočenog u 24. mjesecu. Korelacije istaknute narančastim sjenčanjem na slici 7 naglašavaju da r vrijednosti > 0.7 primijećene su između 6. i 24. mjeseca promjene u pojedinačnim metaboličkim i bubrežnim indeksima nakon CSM-a, uključujući BMI, MAP, HbA1c, trigliceride i ACR. Sve su te korelacije bile statistički značajne, s uočenim p-vrijednostima < 0.05 (Slika S6).

Odnos između promjene HbA1c u 6. i 24. mjesecu bio je posebno jak, s opaženom r vrijednošću od 0.97 (p < 0.001). Stoga je veličina ranih poboljšanja pojedinačnih metaboličkih i bubrežnih indeksa nakon CSM-a snažno predvidjela veličinu poboljšanja uočenih u 2--godišnjem praćenju.

Smanjenje BMI jedan je od najkonzistentnijih učinaka barijatrijske kirurgije, a stupanj gubitka težine smatra se glavnom odrednicom poboljšanja drugih metaboličkih parametara. Međutim, kao što je navedeno u ćelijama označenim crnom bojom na slici 7, primijećene su odsutne ili slabe korelacije između promjena BMI-a u 6. i 24. mjesecu s promjenama krvnog tlaka, glikemije, triglicerida i log uACR u 6. i 24. mjesecu u CSM-u. ruka. Sve p-vrijednosti za ove korelacije bile su > 0.25 i nisu bile značajne (Slika S6). Najjače takve korelacije primijećene su između promjena BMI-a i log uACR (6. mjesec, r=0.36 [p=0.27]; 24. mjesec, r=0.22 [p=0.54]), iako su oni ostali prilično slabi. Stoga, u kraku CSM-a, količina gubitka težine nije bila u snažnoj korelaciji s poboljšanjima uočenim u drugim metaboličkim parametrima i bubrežnim indeksima. Dok su poboljšanja BMI-a bila prilično dosljedna u 6. mjesecu nakon CSM-a, poboljšanja drugih metaboličkih parametara i bubrežnih indeksa bila su varijabilnija, a ta varijabilnost nije bila dobro obuhvaćena promjenama BMI-a. Istraživali smo jesu li promjene u izlučivanju metabolita urinom jače korelirale od promjena u BMI s poboljšanjima metaboličkih i bubrežnih indeksa nakon CSM-a.

Primijećene su umjereno jake korelacije između metabolita koji odražavaju katabolizam BCAA (valin plus BCAA katabolički međuprodukti {{0}}hidroksiizobutirat, 3-hidroksiizovalerat i 3-metil-2-oksovalerat) s poboljšanjima krvnog tlaka, HbA1c i albuminurije u CSM kraku (slike 7, S6 i S8). Korelacije između metabolita koji odražavaju katabolizam BCAA s BMI i trigliceridima općenito su bile slabe. Kao što je naznačeno u ćelijama označenim žutom bojom na slici 7, korelacije s poboljšanjima krvnog tlaka u 6. i 24. mjesecu bile su najjače za valin, 3-hidroksiizobutirat i 3-metil-2-oksovalerat (mjesec 6: r=0.76 [p=0.01] za valin, r=0.46 za 3-hidroksiizobutirat [p=0.18], i r=0.84 [p < 0,001] za 3-metil-2- izovalerat; 24. mjesec: r=0.55 [p=0.12] za valin , r=0.67 [p=0.05] za 3-hidroksiizobutirat, i r=0.67 [p=0.05] za {{44 }}metil-2-oksovalerat). Promjene u valinu i 3-metil-2- oksovaleratu nisu bile značajno povezane s poboljšanjima drugih kliničkih parametara. Međutim, kao što je istaknuto u ćelijama označenim žutom bojom na slici 7, i 3-hidroksiizobutirat i 3-hidroksiizovalerat bili su umjereno snažno povezani s poboljšanjima HbA1c i albuminurije u 6. i 24. mjesecu, s odnosima prema log uACR nešto jači (6. mjesec: r=0.57 [p=0.07] za 3-hidroksiizobutirat i r=0.55 [p=0.08 ] za 3-hidroksiizovalerat; 24. mjesec: r=0.59 za 3-hidroksiizobutirat [p=0.07] i r=0.65 [p {{ 73}}.04] za 3-hidroksiizovalerat). Umjereno jake korelacije s poboljšanjima kliničkih parametara vidljive za promjene metabolita u urinu u 6. mjesecu koji odražavaju katabolizam BCAA suprotstavljene su slabim korelacijama uočenim za promjene BMI u 6. mjesecu u korelacijskim dijagramima raspršenosti na slici S8.