Nedvosmisleno NMR strukturno određivanje produkata ( plus )-katehin-lakaza dimerne reakcije kao potencijalnih markera oksidacije grožđa i vina
Mar 12, 2022
Za više detalja kontaktirajte:tina.xiang@wecistanche.com
Sažetak:( plus )-katehin—lakazaoksidacijadimerni standardi su hemi-sintetizirani korištenjem lakaze iz Trametes Versicolor je otopina voda-etanol pri pH 3,6. Otkriveno je osam frakcija koje odgovaraju osam potencijalnih oksidacijskih dimernih proizvoda. Profili frakcija uspoređeni su s profilima dobivenim s dvije druge oksidoreduktaze:polifenol oksidazaekstrahiran iz grožđa i lakaze iz Botrytis cinerea. Profili su bili vrlo slični, iako su neke manje razlike upućivale na moguće razlike u reaktivnosti ovih enzima. Zatim je izolirano pet frakcija i analizirano 1D i 2D NMR spektroskopijom. Dodavanje tragova kadmij nitrata u uzorcima otopljenim u acetonu dovelo je do potpuno razlučenih NMR signala fenolnih protona, što je omogućilo nedvosmisleno strukturno određivanje šest produkata reakcije, od kojih jedna od frakcija sadrži dva enantiomera. Ti se proizvodi dalje mogu koristiti kao markeri oksidacije za istraživanje njihove prisutnosti i evolucije u vinu tijekom proizvodnje vina i starenja vina.
Ključne riječi: marker oksidacije;( plus )-katehin; fenolni NMR signali; lakaza; kadmijev nitrat; polifenol oksidaza
1. Uvod
Polifenolisu obitelj kemijskih spojeva široko prisutnih u prirodi. Nalaze se u značajnim količinama u čaju [1], kakau [2,3], borovnicama [4], grožđu [5 l i fermentiranim proizvodima poput vina [6]. Budući da su primarni ciljevi oksidacije J7,8], kemijske strukture polifenola neprestano se razvijaju. Ove promjene utječu na organoleptička svojstva mnogih vrsta hrane; oni su odgovorni za fenomene kao što je tamnjenje hrane [9] i modifikacije senzorskih karakteristika vina [10,11. U enologiji se ovaj fenomen oksidacije odvija u grožđu ili vinu. Što se tiče enzimske oksidacije, glavni enzimi odgovorni za posmeđivanje su oksidoreduktaze, točnije,polifenol oksidazaprisutan u grožđu i lakazi koju proizvodi Botrytis cinerea [12].
Enzimskioksidacijauglavnom se javlja u moštu od grožđa, ali daljnje tamnjenje vina može biti posljedica kemijskih oksidacijskih reakcija |7,13] ili Botrytis cinerea laccase koja može biti vrlo stabilna tijekom starenja vina14. Na fenolnim supstratima mogu se pojaviti dvije oksidacijske enzimske aktivnosti: aktivnost monofenol oksidaze karakterizirana hidroksilacijom postojećeg susjednog položaja hidroksilne skupine i aktivnost difenol oksidaze koja odgovara oksidaciji orto-dihidroksibenzena u orto-benzokinone.
Prema Odboru za nomenklaturu Međunarodne unije za biokemiju i molekularnu biologiju (NC-IUBMB), ove enzimske aktivnosti kataliziraju enzimi EC1-klase koji odgovaraju oksidoreduktazama. Među njima, tri glavne klase oksidoreduktaza koje kataliziraju oksidaciju polifenola su EC1.14.18.1 (monofenol monooksigenaza), EC1.11.1 (peroksidaza/POD) i EC1.10.3 (oksidoreduktaze koje djeluju na difenole).
Ova posljednja klasa podijeljena je u različite podklase, a dvije od njih su se činile posebno zanimljivima za ovu studiju: EC1.10.3.1 (polifenol oksidaza/PPO) i EC1.10.3.2 (lakaz) (Pogledajte dopunske materijale na slici S1).
PPO, lakaza i peroksidaza su oksidoreduktaze koje su uglavnom odgovorne za tamnjenje tijekom prerade grožđa [13]. Posmeđivanje uzrokovano POD je zanemarivo u voću, ali može povećati razgradnju fenola u kombinaciji s PPO[15]. PPO je prirodno prisutan u grožđu i može katalizirati oksidaciju monofenola u katehole i katehola u smeđe pigmente [8,13,16]. Lakaze, koje se pojavljuju u grožđu zaraženom Botrytisom, imaju širi spektar djelovanja|17|jer mogu katalizirati oksidaciju mnogih različitih supstrata. Glavni oksidacijski ciljevi lakaza ostaju 1-2 i 1-4 dihidroksibenzen.
U vinu, benzokinon proizveden oksidacijom (PPO ili lakaze) može lako proći kroz daljnje reakcije ovisno o njihovim redoks svojstvima i elektroničkim afinitetima [15]. Oni mogu djelovati kao elektrofili i reagirati s amino derivatima [18] ili djelovati kao oksidansi i reagirati, među ostalim, s fenolnim supstratima. Ovisno o njihovoj kemijskoj konformaciji (kinon ili semi-kinon), benzokinon može dovesti do različitih produkata oksidacijske reakcije. Pri neutralnom pH, (plus)-katehin će se oksidirati u kinon na položaju A-prstena C5 ili C7 i dovesti do stvaranja šest mogućih dimernih izomera koji podrazumijevaju vezu između položaja B-prstena C2', C5' ili C6' gornje katehinske jedinice i položaj A-prstena C6 ili C8 donje jedinice [19,20]. Dehidrodikatehin je dobro poznati proizvod ovog spajanja [21]. Položaji označavanja struktura prikazani su na slici 1. U kiselim uvjetima, semi-kinonski oblici također mogu biti prisutni na B-prstenu (položaj OH3' ili OH4') i dovesti do četiri moguća dimerna izomera [20,22] s gornju katehinsku jedinicu i A-prsten donje jedinice (pozicija C6 ili C8). Enzimska oksidacija katehina istraživana je u prethodnim studijama [22,23], a povezani produkti oksidacije karakterizirani su HPLC-om [24], iako su rjeđe izolirani i nikada nisu u potpunosti karakterizirani NMR-om.
Cilj ovog rada bio je prvo usporediti pomoću UHPLC-MS profile produkata oksidacije dimer(plus)-katehina u prisutnosti tri ekstrakta oksidoreduktaze, tj. PPO ekstrahiran iz grožđa, lakaze iz gljivice Botrytis cinerea prisutne u botritiziranim slatkim vinima [14], i lakaza iz Trametes Versicolor.
Drugi cilj bio je polusintetizirati i karakterizirati strukture nekih produkata dimerne oksidacije pomoću NMR spektroskopije dobivenih s lakazom iz Trametes Versicolor.
2. Rezultati i rasprava
2.1. Usporedba profila produkata dimerne reakcije s tri različite oksidoreduktaze i(plus)-katehin
(plus)-katehin je prvo oksidiran u prisutnosti lakaze iz Trametes Versicolor pri pH 3,6 u model otopini vina. Nakon odvajanja dimerne frakcije od rezidualnog (plus)-katehina i drugih polimernih frakcija, osam glavnih frakcija je sakupljeno i analizirano pomoću UHPLC-UV-MS, označeno od N1 do N8 prema rastućem redoslijedu vremena zadržavanja (Tablica 1). Maseni spektri elektrospreja u pozitivnom načinu rada pokazali su vršne vrijednosti iona [M plus H] plus na m/z 579 za N1 do N6, što hipotetski odgovara dimeru formiranom jednostrukom vezom između dvije katehinske jedinice, i [M plus H] plus na m/577 za N7 i N8, hipotetski sugerirajući formiranje dodatne veze.
Ovih osamoksidacijafrakcije su potencijalno opažene nakon kemijske depolimerizacije frakcije tanina u prethodnim radovima [25,26] i mogle bi biti iste kao one koje su već opisali Guyot et al. [20], čak i ako su eksperimentalni uvjeti bili malo drugačiji. Doista, u ovoj prethodnoj studiji, sirovi PPO ekstrakt korišten je pri pH 3 i 6 da se dobije osam frakcija. U ovoj studiji uspoređena su tri različita enzima pri pH 3,6 u modelnoj otopini vina. LC-MS komparativna analiza glavnih oksidacijskih frakcija dobivenih s tri različita enzima (lakazom iz Trametes Versicolor, lakkazom iz Botrytis cinerea i polifenol oksidazom ekstrahiranom iz grožđa) prikazana je u tablici 2. Za svaku od osam frakcija, retencijska vremena bila su gotovo identična s različitim enzimima, a slični m/z određeni su MS analizom. Ovi rezultati podržavaju hipotezu da su iste frakcije dobivene za svaki enzim, sadržavajući produkte sa strukturama sličnim onima koje su pretpostavili Guyot et al. [20]. Lopez-Serrano i Ros Barcel6 [27] također su proveli komparativnu studiju produkata oksidacije (plus)-katehina s dva različita enzima: peroksidazom i polifenol oksidazom, oba ekstrahirana iz jagoda. Zaključili su da su produkti dobiveni s dva enzima kvalitativno isti. Dodatni spoj nazvan N4' s m/z=578 Th i Rt=15.66 min opažen je u eksperimentima s lakazom iz Botrytis cinerea i ekstrahiranim PPO, ali ne i s lakazom iz Trametes Versicolor, što sugerira moguće razlike u reaktivnosti za ove enzime.
2.2. Studija i optimizacija fizikalno-kemijskih parametara na 1H-NMR fenolnim i alifatskim OH signalima
Strukturna karakterizacija dimera procijanidina može se dobiti NMR analizom. Konkretno, točan položaj povezivanja između jedinica može se odrediti korištenjem HMBC i/ili ROESY korelacijskih spektara [28,29] (slike S2 i S3). U slučaju veze eterskog tipa (COC), potrebno je pripisivanje hidroksilnih signalnih protona. Također može biti presudno u slučaju CC veza ako se neki alifatski ili aromatski protoni preklapaju ili ako nedostaju neke ključne korelacije. Međutim, čak i u aprotonskom otapalu, hidroksilni protoni polifenola često se pojavljuju kao široki signali iz kojih se ne mogu dobiti nikakve strukturne informacije [30]. Ovo je pitanje provizorno riješeno dodavanjem tragova
Cd(NO3)2 u otopinama uzoraka. Doista, 'H široki signali OH skupina nastaju zbog međumolekularne izmjene između ovih OH protona i drugih protona u otapalu ili otopljenoj tvari. Smanjenjem međumolekulskih veza, prisutnost kadmijeva nitrata u uzorcima može smanjiti te izmjene, čime se poboljšava oštrina signala OH protona.
2.2.1. Učinak dodatka kadmija
Nakon sušenja smrzavanjem, pet frakcija N2, N3, N4, N6 i N8 otopljeno je u acetonu-dg. Zatim su snimljeni 1D protonski NMR spektri na 25 stupnjeva prije (Slika 2A) i nakon dodavanja malih količina kadmija (Slika 2B). U čistom acetonu-d., fenolni OH protoni svih frakcija pojavili su se kao široki vrhovi. Nakon dodatka kadmija, ti su protoni pokazali visokorazlučne signale u slučaju frakcija N6 i N8, dok su za frakcije N2, N3 i N4 signali bili samo malo oštriji. Također treba spomenuti da povećanje sadržaja Cd nije imalo utjecaja na rezoluciju OH signala, jer nije primijećena oštrina ili širina vršne širine linije kada su uzastopne male količine Cd dodane uzorcima (podaci nisu prikazani).
Fenolni OH signali visoke razlučivosti iz proizvoda N2, N3 i N4 postignuti su zahvaljujući dodatnom sušenju i resolubilizaciji (Slika 2C, D).
Razlika u ponašanju nakon dodavanja Cd među frakcijama može se objasniti snagom molekularnih interakcija: jače u slučaju N2, N3 i N4 u usporedbi s N6 i N8, pri čemu je potreban daljnji korak za prekid ovih veza.
Ovaj dodatni korak može biti ključni korak pri korištenju Cd za dobivanje visoko razlučenih fenolnih OH signala u bilo kojoj situaciji, bez obzira na podrijetlo uzoraka, reakciju sinteze ili prirodne polifenolne proizvode.
Prethodni rad koji se bavi nedvosmislenom strukturnom karakterizacijompolifenoldimera koji koriste visokorazlučne OH fenolne NMR signale zahvaljujući dodatku kadmij nitrata objavljen je 1996. [30]. Koliko znamo, od tada nije objavljen nijedan drugi istraživački rad koji koristi ovu metodologiju. Kasnije su poduzeta druga istraživanja kako bi se postigao ovaj cilj, bilo dodavanjem dozirane pikrinske kiseline [31] ili korištenjem niske temperature prikupljanja [32]. Ovo se može objasniti daljnjim korakom koji je neophodan za postizanje odlučujućeg učinka na oštrinu vrha OH s dodatkom Cd, kao što je gore opisano. Međutim, čini se da je kadmij od velike vrijednosti, budući da se signali visoke razlučivosti mogu dobiti bez potrebe za dodavanjem preciznih količina, za razliku od snimanja pikrinske kiseline ili NMR spektra na niskim temperaturama.
2.2.2. Učinak temperature
Smanjenje temperature s 25 stupnjeva C na 15 stupnjeva nije imalo utjecaja na oštrinu fenolnih OH ili alifatskih OH signala. Unatoč tome, pomaci u nižem polju izmjenjivih protonskih vrhova omogućili su nam da odvojimo neke preklapajuće fenolne i alifatske OH signale, čineći njihovu identifikaciju očiglednijom (Slika 3). Smanjenjem temperature smanjena je brzina izmjene protona, pa se mogu očekivati oštriji alifatski OH vrhovi [31]. Temperatura od 15 stupnjeva očito nije dovoljno niska za dobivanje dobro razlučenih alifatskih OH signala. Međutim, to nam je omogućilo da jasno identificiramo rezonanciju dva alifatska OH protona u uzorcima N3 i N6 i jednog u uzorku N8. Spektar uzorka N2 također je pokazao dva signala OH alifatskih protona, koji su bili vidljiviji na 25 stupnjeva C nego na 15 stupnjeva (Slika 2E). U slučaju uzorka N4, signali koji proizlaze iz alifatskih OH bili su samo djelomično vidljivi u spektra, bez obzira je li temperatura postavljena na 25 stupnjeva ili na 15 stupnjeva C, zbog stalnog preklapanja (Slika 2E).
2.3. Strukturna karakterizacija dimernih standarda—NMR spektralna analiza
NMR spektri frakcija N2, N3, N4, N6 i N8 pokazali su da su produkti oksidacije visoke čistoće jer su intenziteti signala drugih detektiranih spojeva manji od 10 posto u usporedbi s onima ovih proizvoda.
U svim spektrima mogu se razlikovati četiri područja kemijskog pomaka lH tipična za katehinske jedinice (slika 2C): signali alifatskih protona piranskih prstenova (C prstenovi) nalaze se u području od 2,3 do 5.0 ppm, i onih aromatskih signalnih protona rezorcinolnih prstenova (A prstenovi) i kateholnih prstenova (Brings) od 5,5 do 6,3 ppm odnosno 6,3 do 7,1 ppm. Signali OH fenola i A i B prstena pojavili su se od 7,1 do 10 ppm. NMR spektri obiju frakcija pokazali su prisutnost različitih skupova signala katehinskih jedinica u konstantnom omjeru intenziteta: uočena su dva skupa signala u spektrima frakcija N2, N3, N6 i N8 u skladu s prisutnošću dimera i četiri seta u spektru N4, koji mogu odgovarati jednom tetrameru, dva dimera ili mješavini različitih oligomera, odnosno jednom trimeru plus jednom monomeru. Kako bi se odredio stupanj oligomerizacije produkata prisutnih u frakciji N4, izveden je 'H DOSY eksperiment korištenjem smjese koja je sadržavala alikvote obje frakcije N4 i N2. Koeficijenti difuzije svih signala pokazuju slične vrijednosti (Slika 4), što ukazuje na prisutnost dvaju dimera katehina u frakciji N4.
Zahvaljujući potpuno razlučenim signalima fenola OH koji daju pouzdane kvantitativne rezultate, vrsta veze između katehinskih jedinica može se izravno zaključiti iz integracije vršne površine. Prema tome, za obje frakcije, N3 i N6, nedostatak jednog OHfenola (koji pripada ili resorcinolu ili kateholnom prstenu) i nedostatak jednog aromatskog protona rezorcinola ukazuje na interflavansku vezu (IFL) eterskog tipa što implicira opoziciju u A ili B prsten i položaj C6 ili C8 u A prstenu. U slučaju uzorka N2 nedostajala su dva aromatska protona, jedan iz B prstena i jedan iz A prstena, što implicira CA-CB IFL. 1D 'H spektar frakcije N4 pokazao je da nedostaju dva protona B prstena, kao i dva protona A prstena. Veze između dimernih jedinica frakcije N4 su stoga obje CC vrste. Spektri frakcije N8 bili su prilično različiti od četiri druge. Neki signali bili su tipični za katehinske jedinice, u kojima nedostaju tri OH fenola, jedan aromatski A prsten i jedan B prsten protona, kao i jedan alifatski OH. S druge strane, neki drugi NMR signali su netipični za katehinsku jedinicu: metilen sa zaslijepljenim 13C kemijskim pomacima (~40 ppm) i ketonska skupina (~192 ppm).
Protonski spinski sustavi C, A i B prstenova određeni su korištenjem oba 'H 1D i 1H 2D TOCSY spektra (nije prikazano). Dva ABMX C-prstena spin sustava (tipično za katehin) uočena su u spektrima frakcija N2, N3, N6 i N8, a četiri za frakciju N4. U spektrima frakcija N2, N3, N6 i N8, dva meta-spregnuta dubleta (J~2Hz) i jedan u području aromatskog A prstena dodijeljeni su protonima prstena A nepovezane katehinske jedinice i na rezidualni proton prstena A C6-ili C8-vezane katehinske jedinice. U spektrima N4, zbog prisutnosti dvaju dimera, četiri meta-spregnuta dubleta i dva singleta detektirana su i dodijeljena kao što je gore opisano. Protonski sustavi prstena B također su lako određeni iz ovih spektara i omogućili su nam identificiranje dva ABM protonska spinska sustava za dimere frakcija N3 i N6, dok su jedan ABM i jedan AB protonski spinski sustavi otkriveni za dimer N2, a jedan ABM i jedan AM proton spin sustavi za dimer N4. Dimer N8 pokazao je samo jedan ABM B-prsten spinski sustav tipičan za monomer katehina.
2.3.1. Određivanje položaja prstena A IFL-a dimera frakcija N2, N3, N4 i N6
Uspostavljanje mosta koji se nalazi na A prstenu dimera (tj., C6A- ili C8A-položaj) zahtijeva atribuciju rezidualnog HA protona CA-vezane katehinske jedinice. Zahvaljujući visoko razdvojenim fenolnim OH signalima, lako polazište bila je identifikacija dvaju OHfenolnih protona jedinica povezanih s prstenom A, tj. A prstena koji
had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm） što se lako pripisuje C7A odnosno C8A. Nakon što su C6A i C8A dodijeljeni, rezidualni HA proton može se izravno pripisati spektru HSQC. Tako je otkriveno da je ovaj rezidualni HA proton H6A za sve frakcije N2, N3, N4, N6. IFL između katehinskih jedinica stoga implicira položaj C8A za sve dimere.
2.3.2. Određivanje položaja B prstena IFL
Dimeri frakcija N2 i N4. Spektri frakcije N2 pokazali su dvije različite vrste protonskih spinskih sustava prstena B: jedan AMX koji odgovara prstenu B nevezane jedinice i jedan AM s konstantom sprezanja od oko 8 Hz, karakterističnom za H6'B i H5' B C2'B-povezane jedinice. Veza između jedinica N2 dimera je stoga C2'B-C8A. NMR spektri frakcije N4 također su pokazali različite B spin sustave: dva AMX, koja odgovaraju nepovezanom B-prstenu, i dva AXspin sustava, oba pokazuju konstante sprezanja od oko 2 Hz, koje su karakteristične za H2'B i H6' B protoni C5'B-vezanih jedinica. Prisutnost dugotrajnih 'H/13C korelacija između H6' i C8A, koje su uočene u HMBC spektrima dva dimera, u skladu su s vezom C5/'B-C8A (Slika 5).
Dimeri frakcija N3 i N6. Spektri frakcija N3 i N6 pokazali su prisutnost dva protonska sustava AMX B-prstena i nedostatak jednog OH fenolnog signala. Budući da su identificirani svi fenolni protoni OHA dimernih jedinica (kao što je gore opisano), fenolni signal OH koji nedostaje može biti signal OH3'B ili OH4'B.
Položaj OH (3'B ili 4'B) može se lako odrediti kroz ROE korelacije s H2'Bor H5'B, odnosno pomoću HMBC korelacija dugog dometa kao što je prikazano na slici 5.
Atribucija rezidualnog OH prstena B lako je izvedena korištenjem HMBC ili ROESY korelacija dugog dometa, kao što je prikazano na slici 5. U slučaju dimera N3, uočena je korelacija ROE između H5'B i rezidualnog OH 'B katehinske jedinice povezane preko svog B prstena. Ovaj OH je stoga identificiran kao OH4'B. U slučaju frakcije N6, rezidualni OH'B je dodijeljen OH3'B, budući da je uočena ROE korelacija između ovog OH i H2'B. Dugoročne korelacije HMBC u skladu su s ovim pripisivanjima. Položaji povezivanja ova dva dimera su zatim određeni kako slijedi: CO3'B-C8A i CO4'B-C8A za N3 i N6. odnosno.
Frakcija N8. Analiza spektra dimera N8 pokazala je da je jedna jedinica ovog dimera katehin s dva položaja povezivanja, jednim na A prstenu, jednim na C8A i drugim na položaju C-O7A, budući da su protoni H8A i OH7A nedostaje. Druga jedinica ovog dimera pokazala je jedinstvene spektralne značajke, ukazujući na gubitak aromatičnosti prstena B i prisutnost nekoliko položaja povezivanja i na B i na C prstenu.
'H NMR signali koji proizlaze iz B prstena bili su dva dubleta na 2,49 i 2,71 ppm, pokazujući geminalno sprezanje od ~15 Hz (12,03 ppm) tipično za metilensku skupinu i singlet na 6,38 ppm koji proizlazi iz etilenskog protona. Budući da ti protoni metilena i etilena nisu bili spojeni, vjerojatno će biti na položajima 2'B i 5'B. HIMBC spektar pokazao je sve korelacije, omogućujući točnu atribuciju ovih ugljika iz prstena B, kao što je prikazano na slici 5. H2C ove jedinice dao je tri korelacije s ugljikom iz prstena B: jedna je metilenski ugljik na ~45 ppm, koji je stoga pripisan C2'B, i preostala dva, s ugljicima koji rezoniraju na ~90 ppm i ~162 ppm, koji se mogu pripisati C1'B i C6'B. H5'B daje samo jake 3J korelacije s dva kvaterna ugljika ovog B prstena : jedan je ugljik prethodno pripisan C3'B (~95 ppm), a drugi, koji je rezonirao na ~90 ppm, mogao bi se stoga pripisati C1'B. Zatim je zaključeno da je ugljik na ~162 ppm C6'B.
Prisutnost alifatskog OH (~5,8 ppm) na položaju C3'B (~95 ppm) određena je njegovom korelacijom ROE s oba H2'B protona. Nadalje, OH3/B daje HMBC korelaciju s kvaternarnim ugljikom na ~192,5 ppm, karakterističnu za ketonsku skupinu na položaju C4'B.
Zaštitnost ovog C1'B od oko 40 ppm je u skladu s gubitkom aromatičnosti prstena B. Nadalje, nedostatak OH na položaju C7A druge jedinice u skladu je s eterskom vezom C1'BO-C7A.
NMR podaci su pokazali da C prsten ove jedinice nema OH3C. Prisutnost veze C3C-O-C3'B u skladu je sa zaštitom C3C od oko 1,5 ppm, kao i kemijskim pomakom C3'B koji je tipičan za hemiketalni ugljik (95 ppm).
Sve u svemu, NMR spektralni podaci omogućuju nam da zaključimo da ovaj dimer odgovara dehidrokatehinu A koji su ranije opisali Winges i sur. [33]. a zatim Guyot et al.[20].
Strukture šest dimernih spojeva određene ovim NMR analizama prikazane su na slici 6, gdje su N2, N3, N6 i N8 čisti produkti, a N4 je smjesa dvaju izomera.
3. Materijali i metode
3.1.Kemikalije
(plus)-katehin hidrat Veći ili jednak 98 posto; lakaza iz Trametes Versicolor(0.94 U·mg-1); natrijev fosfat dvobazični dihidrat Veći ili jednak 98 posto; limunska kiselina (ACS reagens, kadmij nitrat tetrahidrat 99,997 posto; mravlja kiselina i Amberlite XAD7HP dobiveni su od Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, SAD). Aceton-dg je nabavljen od Euriso-top (Saarbrüicken, Njemačka), a trifluoroctena kiselina kiselina (TFA) iz Roth Labo (Karlsruhe, Njemačka). Vodeni LC-MS, acetonitril LC-MS (ACN) i metanol LC-MS (MeOH) svi su bili iz VWR (Radnor, PA, SAD).
3.2. Priprema otopine modelnog vina
Modelna otopina vina bila je otopina etanol/voda (12/88;o/o) s 0.033 M vinskom kiselinom, podešena na pH 3,6 s NaOH 1 M [34].
3.3. Sirovi PPO ekstrakti grožđa
Ekstrakt PPO pripremljen je kako su prethodno opisali Singleton i sur. [35]. Smrznuto grožđe prvo je pomiješano u acetatnom puferu (1,5 M, pH5; 10 gL-l askorbinske kiseline). Smjesa je zatim filtrirana i centrifugirana (3000 g; 10 min). Ostatak je konačno ispran acetonom (80 posto) i osušen na zraku.
3.4.Laccase iz Botrytis Cinerea
Lakaza iz Botrytis cinerea dobivena je kako su opisali Quijada-Morin i sur. [36]. Proizveden je od soja VA612 (sakupljenog u 2005 u vinogradu u Hautvillersu, Champagne, Francuska, od sorte Pinot Noir). Ukratko, kulture na čvrstom mediju sladnog kvasca ostavljene su tjedan dana na 24 stupnja pod plavim svjetlom. Spore su zatim sastrugane i inokulirane u Erlenmeyerovu tikvicu od 500 mL koja sadrži 125 mL medija kulture (4{{30}} gL-1glukoze, 7 gL{{10}}glicerol, 0,5 g·L-1L-histidin,0,1 g:L-1 CuSO,1,8gL-1 NaNO3,0,5g:L -1 KCl,0,5gL-1 CaCl2·H2O,0,05g:L-1 FeSO4,7H2O, 1,0g L-1KH2PO4 i 0,7 gL-1 MgSO 4-7H2O). Nakon 3 dana inkubacije i 2 dana rasta u istom prethodnom mediju, predkulturama je dodana galna kiselina (2 gL-1). Nakon 5 dana, tekući medij je filtriran, a supernatant je podvrgnut tangencijalnoj filtraciji u Quixstand filtracijskom sustavu (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Engleska) opremljenom membranom molekularne težine 30 kDa. Koncentrat je konačno podvrgnut dijafiltraciji prema destiliranoj vodi, a zadržane su samo frakcije koje su pokazale oksidacijsku aktivnost prema ABTS (-80 stupanj).
3.5.Postupak oksidacije
Prethodno je pripremljena otopina lakaze (1 gL-1) u fosfat-citratnom puferu i dodana u otopinu od 6g.L-1( plus )-katehina (modelno vino) kako bi se dobila konačna koncentracija lakaze od { {6}}.3 gL-1. Dobivena otopina je zatim polagano miješana (180 okretaja u minuti) na sobnoj temperaturi 2 sata. Koncentracije su prethodno optimizirane, a eksperiment je izveden u tri primjerka.
3.6. Zaustavljanje reakcije na Resin Amberlite XAD7HP
Kolona jantarno svijetle boje kondicionirana je etanolom (apsolutnim) i isprana s dva volumena kolone milli-O vode. Prethodni reakcijski medij lakaza/(plus)-katehin nakapan je na kolonu i prvo eluiran s dva volumena kolone milli-Q vode [37]. Kolona je zatim eluirana etanolom sve dok sakupljena frakcija nije bila bez boje. Zadržane su samo etanolne frakcije, uparene i liofilizirane. Prašak je pohranjen na -80 stupnjeva do upotrebe.
3.7. Postupak pročišćavanja dimerne frakcije pomoću flash kromatografije
Liofilizirani prah je prvo pročišćen upotrebom sustava flash kromatografije puriflash430 opremljenog UV detektorom postavljenim na 280 nm i Puriflash diol 50 um f0025 kolonom. Binarna mobilna faza sastojala se od acetonitrila (otapalo A) i metanola (otapalo B), oba zakiseljena s 0,1 posto TFA. Niz injekcija izveden je pri konstantnoj brzini protoka od 20 mL·min-1, koristeći sljedeći gradijent: 100 posto A tijekom 4,4 min; 0-10 posto B u 10 min; 10 posto B u 5 min; 10-90 posto B u 5 minuta; 90 posto B u 3 minute; 90-10 posto B u 2 minute; 10 posto B u 10 minuta. Volumen injekcije bio je 1 mL (300 mg liofiliziranog praška otopljenog u 1 mL otapala A). Svaki put su prikupljene tri različite frakcije. Prvi je odgovarao rezidualnom ( plus )-katehinu, a treći je bio mješavina visokomolekularnih polifenola. Druga eluirana frakcija, koja sadrži smjesu produkata dimerne oksidacije, je uparena i liofilizirana prije drugog koraka pročišćavanja.
3.8. Postupak pročišćavanja oksidacijskih produkata iz dimerne frakcije korištenjem polupreparacijskog kromatografskog sustava
Frakcija koja sadrži produkte dimerne oksidacije pročišćena je korištenjem polupreparativnog Bio-Rad NGC 10 srednjetlačnog kromatografskog sustava opremljenog Varian Dynamax C18 Microsorb kolonom reverzne faze (250 × 21,2 mm; 3 um). Binarna mobilna faza sastojala se od milli-O vode (otapalo A) i 80 posto acetonitrila, 20 posto Milli-Q vode （otapalo B）, oba zakiseljena s 0,05 posto TFA. Niz injekcija （300 µL） liofiliziranog praha (20 mg otopljenog u 200 uL otapala A i 100 uL ACN) izveden je pod sljedećim uvjetima eluiranja: 100 posto A tijekom 4 minute; 0-35 posto B za 46 minuta;35-100 posto B za 2 minute; 100 posto B za 5 minuta. Svaki put je sakupljeno osam različitih frakcija, koje odgovaraju čistim UPLC signalima na 280 nm. Svaka frakcija je uparena i liofilizirana prije NMR analize.
3.9.Priprema uzorka za NMR analizu
Oko 1 mg svakog liofiliziranog praha izvaganog u Eppendorfovim epruvetama otopljeno je u 500 μL aceton-dg. Zatim je uzorcima dodano ~10 uL koncentrirane otopine kadmij nitrata u acetonu-d, a dobivene otopine su prebačene u 5 mm NMR epruvete za NMR analizu. Za neke uzorke proveden je dodatni korak: nakon otapanja liofiliziranih prahova u acetonu-dg u prisutnosti kadmija u tragovima, uzorci su ispareni do suhog i zatim ponovno otopljeni u acetonu-d bez daljnjeg dodavanja Cd.
3.10. Specifikacije instrumenta
UPLC-MS analiza. Reakcije su praćene pomoću dva UPLC-MS sustava. Prvi je korišten za preciznu identifikaciju vremena zadržavanja proizvoda korištenjem metode dugog gradijenta. tj. Watersova tekuća kromatografija ultravisoke učinkovitosti reverzne faze povezana s spektrometrijom mase (UHPLC-MS). Sustav tekućinske kromatografije bio je Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, SAD) opremljen fotodiodnim detektorom niza. Koristili smo stupac Acquity UPLC HSS T3 (1,8 um, 2,1 × 150 mm). Temperatura stupca bila je 25 stupnjeva. Binarna pokretna faza sastojala se od 0.1 posto mravlje kiseline u vodi (otapalo A) i acetonitrila (otapalo B). Odvajanje je izvedeno pri konstantnoj brzini protoka od 0.25mL·min-1, koristeći sljedeći gradijent:8-11 posto B u 2 minute; 11 posto B tijekom 8 minuta; 11-25 posto B u 15 min;25-55 posto Bin 5 min;55-99 posto Bin 1 min;99 posto B za 4 min;99-8 posto Bin1 min;8 posto B 4 min. Volumen injekcije bio je 5 μL. Maseni spektrometar bio je Waters Acquity QDa elektrosprej ionizacija (ESI) jednostavni kvadrupol (Waters, Milford, MA, SAD). Kapilarni napon postavljen je na 0,8 kV. Spektri mase dobiveni su u rasponu masa od 200-900 Thin pozitivni ionski način.
Drugi UHPLC-MS sustav, korišten za brzu provjeru tijekom koraka pročišćavanja, bio je isti kao što je prethodno opisano, sa zagrijanom Acquity UHPLC HSS T3 kolonom （1,8 μm, 2,1×100 mm） na 38 stupnjeva. Odvajanje je izvedeno pri konstantnoj brzini protoka od 0,55 mL·min-1, koristeći sljedeći brzi gradijent: 0.1-40 posto B u 5 min; 40-99 posto B u 2 min; 99 posto B tijekom 1 minute; 99-0.1 posto B u 1 minuti. Volumen injekcije bio je 2 μL. Maseni spektrometar bio je Bruker Amazon X elektrosprej ionizacijska (ESI) ionska zamka (Bruker Daltonics, Bremen, Njemačka). Kapilarni napon postavljen je na -5.5 kV. Spektri mase dobiveni su u rasponu masa od 50-2000 Thin pozitivni ionski način.
Sve UPLC-MS analize izvedene su u tri primjerka.
NMR instrumentacija. Svi NMR spektri snimljeni su na spektrometru Agilent DD{{0}} MHz (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SAD), koji radi na 500,05 i 125,74 MHz za jezgre protona i ugljika-13, respektivno, upotrebom sonde za neizravno otkrivanje od 5 mm opremljene gradijentnom zavojnicom.1D'H i 13C, 2Dhomonuklearni1H TOCSY i ROESY, i heteronuklearni lH/13C HSQC i HMBC Eksperimenti su izvedeni korištenjem klasičnih pulsnih sekvenci i analizirani korištenjem VNMRJ4.2 i MestReNova 14.2 .1 (Mestrelab Research, Španjolska) softver. DOSY mjerenja dobivena su i obrađena kao što je prethodno opisano 38]. Parametri prikupljanja sekvence impulsa DgcsteSL bili su sljedeći: vrijeme kašnjenja difuzije i širina impulsa gradijenta postavljeni su na 50 ms odnosno 2 ms, snaga gradijenta (g) povećavana je u 16 koraka s jednakim razmakom g2 od 0,3 do 32G·cm-I. Nakon fazne korekcije, 2D DOSY spektri konstruirani su iz mjerenja visine pika korištenjem softvera VNMRJ4.2.
Svi spektri su referencirani na signale otapala aceton-dg ('H rezidualni signal na 2,05 ppm i 13C signal na 29,92 ppm).
4. Zaključci
Ispitivano je djelovanje triju različitih oksidoreduktaza (polifenol oksidaza ekstrahirana iz grožđa, lakaza iz Botrytis cinerea i lakaza iz Trametes Versicolor) na (plus)-katehin, a dobiveni LC-UV-MS profili bili su vrlo slični, iako postoje neke manje razlike sugerirali su moguće razlike u reaktivnosti ovih enzima.
Strukture šest produkata oksidacije katehin-lakaze (upotrebom lakaze iz Trametes Versicolor) dobivene su na temelju specifičnih NMR potpisa (četiri čista produkta, tj. N2, N3, N6 i N8, i N4, koji odgovaraju mješavini dva izomera). Potpuna atribucija fenolnih OH signala bila je moguća zahvaljujući dodatku kadmij nitrata uz postupak pripreme uzorka koji je omogućio nedvosmisleno pripisivanje veza između katehinskih jedinica za neke od spojeva od interesa. Ovaj postupak će uvelike pojednostaviti NMR analizu mješavina polifenola, bilo sintetiziranih ili ekstrahiranih iz prirodnih proizvoda.
Standardi dobiveni u ovom radu mogu se koristiti u budućnosti kao markeri oksidacije za istraživanje njihove prisutnosti i evolucije tijekom zrenja grožđa i starenja vina. Osim katehina, drugi polifenolni spojevi, uključujući flavonoide i neflavonoide, također se mogu koristiti kao supstrati lakaze za dobivanje dodatnih novih standarda.
Kratice
NMR: nuklearna magnetska rezonanca,
Cd: kadmij,
TOCSY: totalna korelacijska spektroskopija,
ROESY: Spektroskopija nuklearnog Overhauserovog efekta s rotirajućim okvirom,
HSQC: heteronuklearni jednokvantni korelacijski eksperiment,
HMBC:heteronuklearna višepojasna povezanost,
DOSY: difuzijska uređena spektroskopija.
Reference
1. Khan, N.; Mukhtar, H. Polifenoli čaja za promicanje zdravlja. Life Sci. 2007., 81, 519–533. [CrossRef]
2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Hue, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Karakterizacija novih flavan-3-Ol derivata u fermentiranim zrnima kakaovca. Food Chem. 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]
3. Rimbach, G.; Melchin, M.; Moehring, J.; Wagner, AE Polifenoli iz kakaa i vaskularno zdravlje—Kritički pregled. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 4290–4309. [CrossRef]
4. Avram, AM; Morin, P.; Brownmiller, C.; Howard, LR; Sengupta, A.; Wickramasinghe, SR Koncentracije polifenola iz ekstrakta komine borovnice korištenjem nanofiltracije. Food Bioprod. Postupak. 2017, 106, 91–101. [CrossRef]
5. Antoniolli, A.; Fontana, AR; Piccoli, P.; Bottini, R. Karakterizacija polifenola i procjena antioksidativnog kapaciteta u komini grožđa vrste Cv. Malbec. Food Chem. 2015., 178, 172–178. [CrossRef]
6. Saucier, C. Kako se polifenoli u vinu razvijaju tijekom starenja vina? Cerevisia 2010, 35, 11–15. [CrossRef]
7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, AMS Mehanizmi oksidacije koji se javljaju u vinima. Food Res. Int. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]
8. Singleton, VL Kisik s fenolima i srodne reakcije u moštovima, vinima i modelnim sustavima: opažanja i praktične implikacije. Am. J. Enol. Vitić. 1987, 38, 69–77.
9. Mathew, AG; Parpia, HAB Brisanje hrane kao reakcija polifenola. U napretku u istraživanju hrane; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, ur.; Academic Press: Cambridge, MA, SAD, 1971.; Svezak 19, str. 75–145. [CrossRef]
10. Gambuti, A.; Rinaldi, A.; Ugliano, M.; Moio, L. Evolucija fenolnih spojeva i trpkosti tijekom starenja crnog vina: Učinak izloženosti kisiku prije i poslije punjenja u boce. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 1618–1627. [CrossRef] [PubMed]
