Poboljšanje top-down proteomike moždanog tkiva s FAIMS-om, 2. dio

Analiza podataka

Identifikacija proteoforma provedena je s TopPIC verzijom 1.3.53. Postavke za TopPIC uključivale su prozor prekursora od 3 m/z (kako bi se uzela u obzir izotopska ovojnica), toleranciju pogreške mase od 15 ppm, maksimalni/minutni nepoznati pomak mase od 500 Da i maksimalni broj dopuštenih nepoznatih izmjena od 1.

Posljednjih godina sve više studija pokazuje da postoji bliska povezanost između morfologije proteina i pamćenja. Proteini su najosnovnije molekule u životnim aktivnostima. Oni mogu kontrolirati životnu aktivnost stanica i održavati normalan rad ljudskog tijela. Studije su otkrile da morfologija proteina ne samo da igra važnu ulogu u životnim aktivnostima stanica, već je također u neodvojivoj vezi s funkcijom pamćenja u mozgu. Jednom kada se promijeni morfologija proteina, to će utjecati na vezu između neurona, a time i na sposobnost pamćenja ljudi.

U ranim fazama života promjene u morfologiji proteina igraju vitalnu ulogu u razvoju i funkciji mozga. Ako morfologija proteina nije onakva kakva bi trebala biti, to će uzrokovati niz neuroloških problema, što će na kraju dovesti do gubitka pamćenja, kognitivnog oštećenja i tako dalje.

Ipak, nema razloga za brigu. Moderna medicinska tehnologija omogućila je ljudima da prilagode morfologiju proteina putem prehrane kako bi poboljšali svoje pamćenje. Bogata i raznolika prehrana bogata je bjelančevinama, no pri odabiru bjelančevina nastojte birati namirnice s niskim udjelom masti, kolesterola i ugljikohidrata kako biste izbjegli štetne učinke prekomjernog unosa na organizam.

Ukratko, morfologija proteina i pamćenje su neodvojivi. Trebali bismo paziti na zdravu prehranu i uravnotežen unos proteina kako bismo održali dobro zdravlje uz očuvanje dobrog pamćenja. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer ima antioksidativno, protuupalno i anti-age djelovanje, što može pomoći u smanjenju oksidacije i upalnih reakcija u mozgu, čime štiti zdravlje živčani sustav. Osim toga, Cistanche također može pospješiti rast i popravak živčanih stanica, čime se poboljšava povezanost i funkcija neuronskih mreža. Ovi učinci mogu poboljšati pamćenje, sposobnost učenja i brzinu razmišljanja, a također mogu spriječiti pojavu kognitivne disfunkcije i neurodegenerativnih bolesti.

increase brain power

Pritisnite Know za poboljšanje kratkoročnog pamćenja

MS2 spektri pretraženi su u bazi podataka spojenoj s unosima iz Homo sapiens Swiss-Prot (20 352), Swiss-Prot splicevariants (22,000) i TrEMBL (54 436), kao i uobičajenih kontaminanata. Identificirani proteoformi su filtrirani na stopu lažnog otkrivanja (FDR) od 1% kroz TopPIC.

Analiza nizvodnih podataka provedena je u R okruženju za statističko računanje i generiranje brojki.54 U nizvodnoj analizi, proteoforme iz istog gena s istim početnim i završnim aminokiselinama za koje je utvrđeno da su unutar ±5 Da kombinirane su kao jedna proteoforma kako bi se povećala strogost naših zadataka.

Iako je prag od 5 Da proizvoljan, ovaj je pristup kompenzirao netočno dodijeljene monoizotopne vršne vrijednosti, dvosmislenost u nepoznatim pomacima mase i druga artefaktička odstupanja. Za određivanje relativnog standardnog odstupanja (RSD) proteoformi unutar replika, upotrijebili smo izlaz "intenzitet značajki" iz TopPIC-a.

Karte pokrivenosti sekvence fragmentacije i pridruženi spektri generirani su pomoću softvera LCMsSpectator.55

Specifične postavke za LCMsSpectator uključivale su toleranciju prekursora iona od 10 ppm, toleranciju proizvodnje od 10 ppm, minimalni prag S/N od 1,5, Pearsonov korelacijski prag od 0,7, zadano izglađivanje od 9 točaka, i prag relativnog intenziteta prekursora izotopa od 0,1.

REZULTATI I RASPRAVA

Dodatak FAIMS-a snažno povećava pokrivenost proteoma

Uzorak tkiva korteksa pacijenta s dijagnosticiranom Alzheimerovom bolešću obrađen je prema tijeku rada, kao što je prikazano na slici 1. Prvo smo pokušali analizirati izvedbu FAIMS-a na različitim životopisima u usporedbi s onima bez FAIMS-a (koji se nazivaju "Bez FAIMS-a").

Vrijedno je zapamtiti da sučelje FAIMS proizvodi skroman gubitak prijenosa iona, vjerojatno zbog duljeg puta iona kroz izvor.56 Stoga, kako bi se bolje predstavili tipični uvjeti i osigurale pravedne usporedbe, podaci "No FAIMS" prikupljeni su korištenjem istog uzorka bez jedinica FAIMS instalirana.

Ovi podaci "Bez FAIMS" prikupljeni su u tri primjerka i analizirani u skladu s tijek rada, kao što je prikazano na slici 1 sa 6 najboljih DDA MS2 analiza. Skupovi podataka "Bez FAIMS" u prosjeku su identificirali 754 ± 35 proteoformi (Slika 2A i Tablica S1) i zajedno su identificirali 1073 jedinstvene (ne-redundantne) proteoforme (Slika 2B) izvedene iz 293 jedinstvena gena (Slika 2C), pokrivajući 29 359 aminokiselina kroz proteom (Slika 2D).

Metrička "pokrivenost proteoma" (Slika 2D) definirana je kao ne-redundantne aminokiseline pokrivene svakom sekvencom proteoforme. U biti, ova metrika uzima u obzir i duljinu i raznolikost identificiranih proteoformi.

Smatramo da je ovo uravnoteženija metrika u usporedbi sa sirovim brojem proteoformi i gena jer izbjegava pristranosti prema manjim proteoformama. Iako je jednostavno brojanje proteoformi ili gena intuitivno, čini se da su ove metrike pod jakim utjecajem kratkih proteolitičkih fragmenata. FAIMS skupovi podataka prikupljeni su od -50 do -20 CV skeniranih u koracima od 5 V.

Svaki od dobivenih 7 životopisa prikupljen je u tri primjerka. Što se tiče proteoformi i gena, FAIMS je nadmašio "Bez FAIMS" za sve CV-ove testirane unutar -50 do -30 CV raspona (Slika 2A-C).

Na primjer, tri skupa podataka na -50 CV identificirali su 1833 ± 17 proteoformi, prosječno povećanje od ~140% po vožnji u usporedbi s "Bez FAIMS-a". Zajedno, ova tri skupa podataka na -50 CV identificirala su 2564 jedinstvene proteoforme iz 530 jedinstvenih gena koji pokrivaju ukupno 43 437 aminokiselina, što je povećanje od 95, 69 i 69% u odnosu na tri "NoFAIMS" skupa podataka, respektivno (Slika 2B–D i tablica S1).

increase memory

Također, iako FAIMS na -25 V opaža manje jedinstvenih proteoformi i gena u usporedbi s "Bez FAIMS-a", sami proteoformi su u prosjeku puno duži. Stoga, kada se uzme u obzir duljina proteoforme (Slika 2D), skupovi podataka od −25 V pokrivaju gotovo isto toliko aminokiselina iz proteoma (28,398) u odnosu na "Bez FAIMS" (29,359), čineći to sa samo upola manje proteoformi (Slika 2B). ).

Također smo istražili može li FAIMS pružiti robusnu i ponovljivu analizu u usporedbi s analizom bez FAIMS-a. Procijenili smo ponovljivost kvantifikacije izračunavanjem RSD (ekvivalent koeficijentu varijacije) intenziteta značajki svakog proteoforma, pod uvjetom da je proteoforma zadovoljila kriterij da bude promatrana u sva tri replicirana skupa podataka za svaku postavku CV-a.

Budući da su svi skupovi podataka FAIMS i "No FAIMS" prikupljeni iz jednog biološkog uzorka, varijance među replikatima treba se pripisati isključivo instrumentalnim čimbenicima.

Okvirni dijagram na slici 3 (kao i pojedinačni histogrami na slici S1) pokazuje kako se distribucije RSD-ova uspoređuju između skupova podataka FAIMS i "No FAIMS".

Na temelju medijana RSD, dodavanje FAIMS-a rezultiralo je sličnom ili malo poboljšanom kvalitetom kvantifikacije u odnosu na "Bez FAIMS-a". Poboljšanje RSD-ova među nižim naponima (-20 do -30 CV) može biti povezano s opažanjem da se manji broj proteoformi prenosi unutar tog raspona, dajući kvalitetnije MS1 spektre i stoga bolje procjene intenziteta svojstava.

Nadalje, vrijedno je napomenuti da su RSD-ovi određeni iz ovih ponavljanja slični prethodnim eksperimentima odozgo prema dolje55 i odozdo prema gore57,58 koji su izvedeni sa sličnim instrumentima.

Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da dodavanje FAIMS-a TDP-u snažno povećava identifikaciju proteoforma, bez ikakvog žrtvovanja kvalitete kvantifikacije.

Zatim smo istražili preklapanje u identifikacijama između životopisa, što bi moglo pružiti najveći neredundantni skup opažanja.

Koristeći koeficijente preklapanja, definirane kao presjek između dva skupa podijeljen s manjim od dva skupa, odredili smo sličnost između svakog skupa podataka. Ukupni srednji koeficijent preklapanja za identifikacije proteoforma i gena unutar svakog FAIMS CV-a bio je 0,76.

Ovo je usporedivo s koeficijentom preklapanja iz skupova podataka "No FAIMS" (0.77), što sugerira da tehničke replike pokazuju sličnu ponovljivost. Toplinska karta koja prikazuje FAIMS koeficijente preklapanja proteoformi i gena prikazana je na slikama 4, odnosno S2.

Primjetno je da je preklapanje identifikacija gena u CV prostoru puno veće u odnosu na proteoforme, iako je osobito vidljivo kada se uspoređuju najduže CV udaljenosti.

Na primjer, preklapanje između −50 i −20 CV je 0,64 na razini gena i 0,06 na razini proteoforma. To je očekivano budući da svaki gen potencijalno može biti predstavljen s višestrukim proteoformama.

ways to improve brain function

Slika 4 pokazuje da dok razlika od 5−10 V u CV proizvodi koeficijente preklapanja većinom iznad 0,5, udaljenosti veće od 15 V proizvode veće stupnjeve različitosti i stoga su bolje raspoređene za hvatanje dovoljno različitih skupova proteoformi.

S ovim skupovima podataka, zatim smo nastojali utvrditi koje su kombinacije CV-ova optimalne za postizanje maksimalnih identifikacija gena, identifikacija proteoforma i pokrivenosti sekvence s ograničenjima broja CV-ova za svaku kombinaciju.

Prvo smo uspostavili optimalne kombinacije za bilo koji broj CV-ova od 1 do 7 koristeći metriku jedinstvenih proteoformi, gena i pokrivenosti sekvence proteoma (Slika 5).

Koristeći kombinacije ograničene na tri CV-a kao primjer, Slika 5A, B detaljno prikazuje kako su -35, -40 i -50 V idealni ako se želi maksimizirati broj proteoformi ili gena.

Proteoforme i geni identificirani u ova tri životopisa (devet skupova podataka) pokrivaju 84% ukupnih jedinstvenih proteoformi i 92% ukupnih gena u cijelom skupu od 21 skupa podataka.

Kada se mjeri duljina proteoforme s pokrivenošću sekvence kao metrikom, idealna kombinacija je -30, -40 i -50 CV, pokrivajući 88% jedinstvenih aminokiselina iz svih 21 FAIMS skupa podataka uz samo skroman gubitak identifikacije proteoforme i gena ( 4221 proteoforma i 723 gena, slika 5C). Međutim, ove kombinacije uključuju sve replike i predstavljaju maksimalnu identifikaciju koja se može postići za danu kombinaciju životopisa. Stoga, kako bismo demonstrirali prednost eksternog koračanja životopisa, odlučili smo istražiti koji bi se brojevi mogli razumno postići u prosjeku sa samo tri rada, pri čemu je svaki rad drugačiji životopis.

Koristeći skupove podataka -50, -40 i -30 V kao primjer, odredili smo prosječne jedinstvene proteoforme, jedinstvene gene i pokrivenost sekvence proteoma na temelju 27 jedinstvenih kombinacija iz tri različita replika unutar svakog CV-a.

Na temelju ove analize mogli bismo postići 2986 (±46) jedinstvenih proteoformi i 618 (±12) jedinstvenih gena koji u prosjeku pokrivaju 64 534 (±1089) aminokiselina. U usporedbi s trostrukim skupovima podataka "No FAIMS", koji su identificirali 1073 jedinstvene proteoforme i 293 jedinstvena gena koji pokrivaju 29 359 aminokiselina, eksterni CV korak na -50, -40 i -30 V mogao bi više nego udvostručiti svaku metriku.

Unatoč tome, optimalna kombinacija CV-a također će vjerojatno ovisiti o organizmu i tkivu iz kojeg je uzorak izveden, primijenjenim koracima pripreme uzorka, kao i bilo kakvom dodatnom izvanmrežnom frakcioniranju provedenom prije LC-MS analize.

Sve u svemu, kada se uzme zajedno s analizom preklapanja (Slika 4), sugerira se da 15 V ili veće udaljenosti između CV-ova osiguravaju najmanju količinu preklapanja između proteoformi, dok razdvajanje od 5-10 V unutar -50 do -30 CV maksimizira gene, proteoforme i proteome pokrivenost sekvence.

Kako bismo dalje odredili utjecaj FAIMS-a na dubinu pokrivenosti proteoma, usporedili smo gene identificirane iz naših top-down skupova podataka s tipičnom bottom-up analizom ljudskog mozga.

Sveobuhvatni setovi podataka o tkivu ljudskog mozga odozdo prema gore omogućili su nam da procijenimo zastupljenost za 8528 proteina korištenjem ponderiranog spektralnog brojanja.59-61 Proteini su grupirani u 10 različitih percentila zastupljenosti na temelju spektralnih brojanja sastavljenih iz nekoliko nizova podataka ljudskog mozga odozdo prema gore.

Unakrsnim referenciranjem s našim skupovima podataka odozgo prema dolje, uspjeli smo odrediti odakle su geni i proteoforme izvedeni i rangirati u smislu procijenjenog obilja proteina (koristeći spektralne brojeve normalizirane skupom podataka) u ljudskom mozgu (Slika 6).

improve your memory