Ukupni glikozidi Cistanche Deserticola promiču oporavak neuroloških funkcija induciranjem neurovaskularne regeneracije putem Nrf- 2/Keap-1 puta u MCAO/R štakora

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Fujiang Wang, Ruiyan Li, Pengfei Tu, Jianping Chen, Kewu Zeng i Yong Jiang

Pozadina:Zabilježeno je da je tradicionalni kineski lijek Cistanche deserticola učinkovit za kardiovaskularne i cerebrovaskularne bolesti. Međutim, njegove aktivne komponente za zaštitu od ishemijskog moždanog udara nisu jasne. Cilj nam je bio istražiti aktivne komponenteC. deserticolaprotiv ishemijskog moždanog udara kao i njegovih mogućih mehanizama.Metode:Istraživali smo zaštitne učinke ekstrakata izC. deserticolaukupnih glikozida (TG), polisaharida (PS) i oligosaharida (OS) u štakorskom modelu okluzije-reperfuzije srednje cerebralne arterije (MCAO/R). 2, 3, 5-Bojanje trifenil tetrazolij kloridom (TTC) korišteno je za procjenu volumena moždanog infarkta, a Evansov plavi test usvojen je za procjenu propusnosti krvno-moždane barijere (BBB). Zatim, izrazi CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin, Keap-1 i Nrf{{ 12}} analizirani su korištenjem Western blottinga ili imunofluorescencije, a aktivnosti MDA, SOD, CAT i GSH-Px analizirane su korištenjem kompleta.Rezultati:Liječenje TG-ima značajno je smanjilo rezultate neurološkog deficita i volumene infarkta, pospješilo angiogenezu i neuralno remodeliranje i učinkovito održalo integritet krvno-moždane barijere u usporedbi s modelnom skupinom. Nadalje, TG su značajno smanjili razine MDA i povećali antioksidativne aktivnosti (SOD, CAT i GSH-Px) u mozgu. U međuvremenu, TG su značajno smanjili ekspresiju Keap-1 i olakšali translokaciju jezgre Nrf-2. Naprotiv, nikakvi zaštitni učinci nisu uočeni za skupine PS i OS.Zaključak:TG su glavne aktivne komponenteC. deserticolaprotiv cerebralne ozljede izazvane MCAO/R, a zaštita je uglavnom putem Nrf-2/Keap-1 puta.

Ključne riječi: Cistanche deserticola, cerebralna ozljeda, ukupni glikozidi, polisaharidi, oligosaharidi, Nrf-2/Keap- 1 put

UVOD

Moždani udari smatraju se glavnim uzrokom smrti i invaliditeta u svijetu (Donnan i sur., 2008.). Gotovo 87 posto svih slučajeva moždanog udara izazvano je ishemijskim moždanim udarom (Ovbiagele i Nguyen-Huynh, 2011.). Trenutačno najučinkovitije sredstvo i jedini lijek koji je odobrila FDA za liječenje ishemijskog moždanog udara je rekombinantni tkivni aktivator plazminogena. Međutim, veliki broj pacijenata s moždanim udarom ne reagira na ovaj lijek zbog njegovog uskog terapijskog vremenskog okvira i ozbiljnog rizika od hemoragijskih komplikacija (Lee i sur., 2012.; Schellinger i Kohrmann, 2014.). Glavni izazov trombolitičkog liječenja je ishemijska/reperfuzijska (I/R) ozljeda, koja se smatra glavnim uzrokom ozljede mozga i oštećenja funkcije. Reperfuzija nakon cerebralne ishemije povećava rizik od krvarenja u mozgu, dok dovodi do neurovaskularne ozljede i proizvodi prekomjerne reaktivne kisikove vrste (ROS) koje oštećuju krvno-moždanu barijeru (Alluri i sur., 2015.). Nekoliko je studija potvrdilo da je poremećaj BBB glavni uzrok patogeneze ishemijskog moždanog udara (Cao et al., 2016b).

BBB se uglavnom sastoji od endotelnih stanica, pericita, astrocita, neurona i bazalnih membrana. Osnovne komponente BBB su cerebralne mikrovaskularne endotelne stanice koje su spojene čvrstim spojevima, čime se ograničavaju egzogene molekule u mozgu. Patološke promjene tijesnih spojeva—osobito okludina, klaudina-5 i zonula occludens-1 (ZO-1)—značajno utječu na funkciju BBB-a tijekom ishemijskog moždanog udara, posebno na propusnost barijere (Liu et. sur., 2014.; Hu i sur., 2018.; Liu i sur., 2019.). Tijekom I/R razdoblja, prekomjerni ROS jedan je od glavnih čimbenika koji dovode do izravnog oštećenja moždanih neurona (Ding i sur., 2014.). Prekomjerna proizvodnja ROS-a dovodi do degradacije određenih spojeva i poremećaja BBB-a, što rezultira ulaskom egzogenih molekula u mozak kroz BBB, što dovodi do pogoršanja oštećenja mozga (Cheon i sur., 2016.; Zhang QY i sur., 2017.). Stoga se zaštita BBB antioksidansima smatra mogućim načinom za sprječavanje reperfuzijske ozljede.

Osim razgradnje BBB-a, I/R može rezultirati neurovaskularnom ozljedom i neuronskom smrću (Jung et al., 2010.). Tijekom moždanog udara, povećana smrt neuronskih stanica može biti posljedica oksidativnog stresa (Chi i sur., 2018.), a brojne studije su pokazale da ROS pogoršava težinu moždanog udara i neurološka oštećenja (Kondo i sur., 1997.; Crack i sur., 2001.; Crack i sur., 2006). Iako klinička ispitivanja nisu dala zadovoljavajuće rezultate, neuroprotekcija je još uvijek obećavajuća strategija za liječenje akutnog ishemijskog moždanog udara (Moretti i sur., 2015.). Stoga je pronalazak učinkovitih neuroprotektivnih lijekova za liječenje moždanog udara korist za pacijente s moždanim udarom.

Tradicionalna kineska medicina (TCM) poduzima mjere za intervenciju protiv unutarnje neravnoteže tijela (Gaire, 2018.). Zbog složene patogeneze ishemijskih moždanih udara, multifaktorski učinak TKM-a i njegovih aktivnih sastojaka ima ključnu ulogu u liječenju moždanog udara. Cistanche deserticola YC Ma, rasprostranjena u sušnim ili polusušnim područjima diljem Mongolije i sjeverozapadne Kine, naširoko je korištena TCM biljka za liječenje raznih bolesti kao što su zaboravnost i depresija više od 1,{3}} godina u Kini . Modernofarmakološke studije pokazale su da su sirovi ekstrakti izC. deserticolapokazali su višestruke farmakološke aktivnosti, poput poboljšanja funkcije učenja i pamćenja, neuroprotekcije, jačanja imuniteta, antioksidativnih učinaka, učinaka protiv starenja i umora (Ko i Leung, 2007.; Wang i sur., 2012.; Li i sur., 2015.). Kemijska analiza C. deserticola pokazala je da njeni glavni sastojci uključuju feniletanoidne glikozide, iridoidne glikozide, polisaharide i oligosaharide (Jiang i Tu, 2009.). Međutim, aktivne komponente C. deserticola za zaštitu mozga nisu baš jasne.Neuroprotektivno svojstvo C. deserticola implicira njezin terapeutski potencijal u kognitivnim bolestima kao što su moždani udar i depresija, kao i Alzheimerova bolest (Wang et al., 2017.). Međutim, istraživanja o utjecajuC. deserticolana moždani udar, uključujući njegove aktivne komponente i mehanizme djelovanja, vrlo je ograničen. U ovom radu istražili smo zaštitni učinak tri ekstrakta iz C. deserticola, ukupnih glikozida (TG, feniletanoidni glikozidi i drugi glikozidi), polisaharida (PS) i oligosaharida (OS) na cerebralne I/R ozljede. Naša otkrića mogu pridonijeti točnoj kliničkoj primjeniC. deserticolai osigurati sredstvo kandidata za terapiju ishemijskog moždanog udara.

MATERIJALI I METODE

Kemikalije i reagensi

Stabljike Cistanche deserticola kupljene su iz Alashana, unutarnja Mongolija, a identificirao ih je jedan od autora (P.-F. Tu). TG, PS i OS pripremljeni su prema našoj prethodno objavljenoj metodi (Gao et al., 2015). Kvantitativna analiza TG-ova provedena je tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC) kako je prethodno opisano (Li et al, 2019), a kromatogram je prikazan na slici 1. Glavne komponente TG-a su ehinakozid, tubulozid A, akteozid, izo- akteozid i 2'-acetilakteozid; njihov sadržaj je 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g, odnosno 12,045 mg/g. Sadržaj PS-a i OS-a je 69,42 posto, odnosno 65,24 posto, kako je određeno HPLC-om i analizom fenol-sumporna kiselina (Zhang A. i sur., 2018.; Shi i sur., 2019.).

Standardne reference ehinakozida (A0282), tubulozida A (A0942), akteozida (A0280), izoakteozida (A0281) i 2'-acetilakteozida (A0943) kupljene su od Chengdu Must Biotechnology (Sichuan, Kina). Čistoće svih standarda su više od 98 posto. Nissl stain H&E kompleti kupljeni su od Bostera (Wuhan, Kina). Edaravone (T0407-1) je kupljen od Target Mol (Shanghai, Kina). Kupljeni su zečji anti-štakorski MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) i mišji anti-štakorski CD31 (ab24590) od Abcam Inc (Cambridge, MA, SAD). Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) i Occludin (BS72035) protiv zečjih štakora kupljeni su od Bioworld Technology (Nanjing, Kina). Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, SAD) bio je izvor zečjeg anti-štakorskog sinapsina-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-aktina glatkih mišića (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) je kupljen od Proteintech Group, Inc. (Chicago, SAD). Sekundarna antitijela isporučila je Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Peking, Kina). Hoechst 33258 je nabavljen od Beyotime (Jiangsu, Kina).

Životinje

Štakori Sprague-Dawley (mužjaci, težine 250-300 g) dobiveni su od Vital River Laboratory Animal Technology (Peking, Kina) i smješteni u klimatiziranu prostoriju u kojoj je 12-satni ciklus svjetlo/tama. Svi pokusi na životinjama izvedeni su prema smjernicama ARRIVE istraživanja na životinjama (Kilkenny i sur., 2010.; McGrath i sur., 2010.), a odobrio ih je Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja Zdravstveno-znanstvenog centra Sveučilišta u Pekingu (LA2019123).

Protokoli pokusa na životinjama

Štakori su podvrgnuti MCAO/R, kao što je prethodno opisano (Wang et al., 2018). Ukratko, lijeva zajednička karotidna arterija (CCA), vanjska karotidna arterija (ECA) i unutarnja karotidna arterija (ICA) bile su izložene, a 3-0 najlonski monofilamentni šav umetnut je iz ECA u ICA sve dok nije stigao do sredine moždana arterija (MCA). Nakon 1,5 h od okluzije MCA, reperfuzija je simulirana uklanjanjem filamenta. Tijekom kirurškog zahvata, tjelesna temperatura svih štakora održavana je na 37,0 stupnjeva.

Uprava za lijekove

Štakori su nasumično podijeljeni u šest skupina pomoću SPSS softvera verzije 22.0 kako je opisano (Jiang et al., 2014.): normalna skupina (NOR); skupina modela (MOD); skupina edaravona (pozitivan lijek, 6 mL/kg, EDI); skupina TG (280 mg/kg, TG); PSs skupina (280 mg/kg, PSs), i OSs skupina (280 mg/kg, OSs). TG, PS i OS primjenjivani su jednom dnevno nakon MCAO/R tijekom 14 dana. NOR i MOD skupine liječene su normalnom fiziološkom otopinom. Broj životinja prikazan je u tablici 1.

Mjerenje težine i modificirani rezultati neurološkog deficita (mNSS)

Tjelesna težina praćena je 14. dana pomoću digitalne vage ADVENTURE™ (OHAUS, New Jersey, SAD). mNSS je procijenjen prema metodi koju je opisao FJ Wang (Wang et al., 2018), uz manje revizije.

2, 3, 5-Bojanje trifeniltetrazolij kloridom (TTC)

Volumen infarkta mjeren je kako je prethodno opisano (Wang i sur., 2015.). Ukratko, mozgovi su podijeljeni u sedam jednako razmaknutih koronarnih blokova (2 mm). Ove sekcije su obojene s 2 posto TTC (Coolaber, Peking, Kina) na 37 stupnjeva tijekom 15 minuta. Volumen infarkta (postotak)=(volumen ipsilateralne ishemijske hemisfere − volumen kontralateralne ishemijske hemisfere)/volumen kontralateralne ishemijske hemisfere × 100.

Nissl i H&E bojenje

Štakori su bili pod dubokom anestezijom, a cijeli mozak je zatim brzo uklonjen iz lubanje i fiksiran pomoću 4 posto paraformaldehida i umetnut u parafinski vosak, te izrezan na kriške debljine 7 µm. Sekcije su obojene Nisslom i H&E. U ovoj studiji, šest nasumičnih polja od 200 × 200 µm snimljeno je svjetlosnim mikroskopom u svakom uzorku tkiva. Broj Nisslovih tijela izbrojan je IPP softverom verzije 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, SAD).

Evansov plavi test

Štakorima je ubrizgan 2 posto EB (Coolaber Science & Technology Co., LTD) nakon MCAO/R. Dva sata kasnije, štakori su bili anestezirani, a cijeli mozak je brzo uklonjen i homogeniziran u acetonu. Supernatanti su analizirani na 620 nm čitačem apsorbancije 800 TS (BioTek, SAD).

Mjerenje aktivnosti katalaze (CAT), superoksid dismutaze (SOD), malondialdehida (MDA) i glutation peroksidaze (GSH-Px)

Svi uzorci seruma centrifugirani su na 4,000 × okretaja u minuti 15 minuta na 4 stupnja i zatim analizirani kako bi se otkrile aktivnosti MDA, CAT, SOD i GSH-Px prema uputama proizvođača (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Kina).

Western blotting analiza

Tkiva mozga (100 mg) sakupljena od svakog štakora su homogenizirana i lizirana u RIPA puferu za lizu, a zatim analizirana da se detektuje koncentracija proteina korištenjem BCA kompleta (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.). Ukupni proteini tkiva naneseni su na 10 posto SDS-PAGE gelove i preneseni na nitroceluloznu membranu. Membrana je blokirana korištenjem 5 posto obranog mlijeka, zatim inkubirana preko noći s primarnim antitijelima na 4 stupnja. Membrana je zatim inkubirana sa sekundarnim antitijelom. Western blot analiza analizirana je pomoću Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, Kina).

Imunofluorescentna analiza

Provedeno je imunofluorescentno bojenje za CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 i Keap-1. Primarna protutijela protiv Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 i Keap-1 razrijeđena su na 1:200 odnosno 1:100. Sekundarno antitijelo Alexa Flur 488 mišji anti-zečji IgG i rodamin (TRITC) kozji anti-zečji IgG oba su razrijeđena do 1:200. Jezgre su obojene Hoechstom 33258. Slike su snimljene pomoću Vectra® Polaris™ automatiziranog kvantitativnog patološkog slikovnog sustava (PerkinElmer, SAD). Ekspresija proteina je analizirana pomoću IPP softvera verzije 6.0.

Statistička analiza

Svi podaci opisani su kao srednja vrijednost ± SD. Za statističku analizu provedena je verzija softvera SPSS 22.0. Pri usporedbi različitih skupina korištena je jednosmjerna ANOVA. P < 0.05="" smatra="" se="" statističkom="">

REZULTATI

TG povećavaju tjelesnu težinu i smanjuju oštećenja mozga kod MCAO/R štakora

Nakon 14 dana liječenja s TG, PS, Oss i EDI, procijenjene su tjelesne težine, neurološki deficiti i volumen infarkta I/R štakora. Rezultati su pokazali da su tjelesne težine u MOD skupini znatno smanjene, dok su smanjene težine u TGs, PSs i EDI skupinama povećane (Slika 2A). Rezultati neurološkog deficita značajno su sniženi EDI-jem i TG-om (Slika 2B). Kriške mozga u štakorima iz NOR skupine bile su tamnocrvene i nije bilo infarkta, dok su štakori iz MOD skupine pokazali veliki ipsilateralni cerebralni infarkt. Nakon tretmana TGs, volumeni infarkta bili su značajno smanjeni (Slike 2C, D). Tretman PS-a i OS-a nije pokazao očigledan učinak na gore navedene indekse. Gore navedeni podaci pokazuju da TG mogu značajno ublažiti cerebralnu ozljedu izazvanu I/R, ali PS i OS ne mogu.

TG poboljšavaju histopatološka oštećenja kod MCAO/R štakora

Kako bi se odredili neki od učinaka liječenja TG, PS i OS na histopatološka oštećenja, učinjeno je H&E bojenje kako bi se otkrilo patološko oštećenje. Histomorfološke strukture mozga u NOR skupini bile su pravilno raspoređene. Morfološke promjene u skupinama TG bile su manje nego u skupini MOD. Međutim, skupine koje su primale PS i OS nisu pokazale značajno poboljšanje morfoloških promjena (Slika 3).

TGs ublažavaju ozljede neurona nakon I/R-induciranih štakora

Bojanje po Nisslu pokazalo je histopatološke promjene neurona u penumbri ishemijskog područja. Kao što je prikazano na slici 4, normalni neuroni su imali jasnu jezgru i netaknutu strukturu. U skupini MOD neuroni su imali povećane međustanične prostore. Nissl tijela su nestala, smežurana i duboko zamrljana. Međutim, te su promjene rijetko uočene u skupinama EDI, TG i PS. Ovi rezultati pokazuju da TG i PS mogu značajno ublažiti ishemijom/reperfuzijom induciranu neuronsku ozljedu.

TGs ublažavaju poremećaj BBB nakon I/R-liječenih štakora

Evans blue test je klasična metoda za istraživanje promjene propusnosti BBB. Rezultati pokusa su pokazali da je povećano Evans plavo primijećeno u MOD skupini, dok je bilo značajno smanjeno Evans plavo u štakora koji su primali TG i EDI. Štoviše, nije bilo značajne razlike između terapijskih skupina PS-a i OS-a (Slika 5). Ovi rezultati sugeriraju da bi TG mogli značajno ublažiti poremećaj BBB.

TG potiču angiogenezu kod I/R ozlijeđenih štakora

Novija istraživanja pokazuju da angiogeneza igra ključnu ulogu u neurološkom funkcionalnom oporavku i prognostičkom ishodu nakon akutnog ishemijskog moždanog udara (Yuen i sur., 2015.). Za procjenu učinaka TG, PS i OS na angiogenezu, CD31 i a-SMA korišteni su za kvantificiranje kapilarnog broja. Imunofluorescentno bojenje pokazalo je da je MOD skupina uzrokovala značajno smanjenje ekspresije CD31 (Slike 6A, B) i a-SMA (Slike 6C, D) u penumbri ishemijskih područja I/R štakora, u usporedbi s normalnim štakorima . Ovaj rezultat je pokazao da I/R može uzrokovati vaskularno oštećenje u korteks penumbri ishemijskih hemisfera. Međutim, liječenje TG-ima i EDI-jem značajno je povećalo gustoću kapilara, angiogenezu i arteriogenezu kao što je naznačeno povećanom ekspresijom CD31 i a-SMA. Ovi rezultati sugeriraju da bi TG mogli pospješiti angiogenezu u ishemijskoj penumbri I/R štakora, ali PS i OS nisu mogli.

TG povećavaju ekspresiju proteina uskog spoja kod I/R ozlijeđenih štakora

Poremećaj BBB može povećati sadržaj vode u mozgu i oticanje tkiva, što dovodi do ozljede mozga. Proteini uskog spoja važne su strukturne komponente BBB (Tenreiro i sur., 2016.; Jiang i sur., 2018.). Kako bi se ispitalo može li liječenje TG-ovima, PS-ovima i OS-ima nakon moždanog udara utjecati na integritet BBB-a, imunofluorescentnom analizom provedena je ekspresija ZO-1, claudina-5 i okludina. Rezultati su pokazali da su ekspresije claudina-5, occludina i ZO-1 bile vidljivo smanjene u skupini MOD. Međutim, oni su značajno povećani nakon 14 dana primjene TG-a. Skupine PS i OS nisu pokazale značajne promjene u ekspresiji ovih proteina (Slika 7). Ovi podaci pokazuju da TG mogu regulirati ekspresiju proteina uskog spoja i vjerojatno održati integritet BBB nakon I/R ozljede. TG povećavaju pokrivenost pericitima na kapilarama kod I/R ozlijeđenih štakora Pokrivenost pericitima na kapilarama ima ključnu ulogu u održavanju integriteta BBB (Armulik i sur., 2010.; Daneman i sur., 2010.). Stoga smo testirali može li se pokrivenost pericita povećati tretmanom TG, PS i OS. Rezultati analize intenziteta imunofluorescencije pokazali su da su ekspresije i PDGFRb i CD31 dramatično smanjene u MOD skupini. Primjena TG-a I/R štakorima značajno je oporavila ili čak povećala intenzitet ekspresije PDGFRb i CD31, ali nije primijećena razlika u skupinama koje su primale PS i OS (Slika 8). Stoga bi liječenje TG-ima moglo značajno povećati pokrivenost pericita. Ovi su nalazi dodatno potvrdili da TG mogu održati integritet BBB nakon I/R.

TG promiču neuralno preoblikovanje kod I/R ozlijeđenih štakora

Prema brojnim studijama, neurogeneza nakon moždanog udara može značajno poboljšati funkcionalni oporavak (Grefkes i Ward, 2014; Zhang i sur., 2019). Sinaptofizin (SYN), proteini postsinaptičke gustoće 95 (PSD-95) i protein 2 povezan s mikrotubulama (MAP-2) korišteni su kao markeri za ispitivanje neuronske plastičnosti u ishemijskoj penumbri korteksa. Kako bi se procijenili učinci liječenja TG-ovima, PS-ima i OS-ima na neurogenezu kod I/R ozlijeđenih štakora, provedena je imunofluorescencija i western blot za ekspresije SYN, PSD95 i MAP-2. Kao što je prikazano na slikama 9 i 10, razine ekspresije SYN, PSD95 i MAP-2 kod I/R štakora nakon 14 dana reperfuzije smanjile su se u usporedbi s NOR štakorima, dok su TG-ovi i PS-ovi lijek mogli značajno povećati reguliraju njihovu razinu ekspresije. Grupa OS nije imala značajne promjene u usporedbi sa skupinom MOD. Podaci su pokazali da je lijek TGs i PSs bio u stanju dramatično potaknuti neuralno preoblikovanje nakon I/R ozljede.

TG mijenjaju ekspresiju Nrf-2 i Keap-1 kod I/R ozlijeđenih štakora

Oksidativni stres je glavni patogeni mehanizam kod I/R ozljeda (Ya i sur., 2018; Yu i sur., 2018). Studije su potvrdile da je Nrf-2 glavni regulator antioksidativnih odgovora (Thompson et al., 2015.). Kako bismo istražili oksidativne odgovore posredovane Nrf-2 i Keap-1 nakon I/R ozljede, procijenili smo citoplazmatsku ekspresiju kao i nuklearnu translokaciju Keap-1. U međuvremenu je također ispitana ekspresija Nrf-2 u I/R tkivu mozga štakora ozlijeđenog (slike 10 i 11). Prema analizi imunofluorescencije, utvrđeno je da je Nrf-2 uglavnom smješten u citoplazmi u NOR skupini. U skupini TGs, ekspresija Nrf-2 u citoplazmatskoj lokalizaciji bila je regulirana naniže, ali je regulirana naviše u jezgri, a opažena je i smanjena ekspresija Keap-1. Podaci su pokazali da bi zaštita mozga TG mogla biti povezana s modulacijom Nrf-2 i Keap-1

TGs smanjuju oksidativni stres moždanog tkiva kod I/R ozlijeđenih štakora

Kako bi se potvrdili antioksidativni učinci TG, aktivnosti SOD, CAT, GSH-Px i MDA procijenjene su u I/R ozlijeđenih štakora. Na slici 12, sadržaj MDA bio je značajno povećan u MOD skupini, au isto vrijeme su aktivnosti SOD, CAT i GSH-Px bile smanjene u usporedbi s normalnim štakorima. Nasuprot tome, liječenje TG-ima dovelo je do značajnog smanjenja sadržaja MDA i povećanja aktivnosti SOD, CAT i GSH-Px. Ovi rezultati dodatno su potvrdili antioksidacijsku aktivnost TG-a.

RASPRAVA

Mnoga istraživanja sugeriraju da TCMC. deserticolaima opsežne biološke aktivnosti, npr. poboljšava sposobnost učenja, pamćenja i imuniteta (Dong i sur., 2007.; Jiang i Tu, 2009.; Wang i sur., 2017.; Xia i sur., 2018.). Međutim, aktivne komponente C. deserticola za neuroprotekciju ostaju nejasne. Trenutačni rad ima za cilj pregledati aktivne komponente izC. deserticolaprotiv ishemijskog moždanog udara na MCAO/R modelu. Tri ekstrakta iz C. deserticola (TG, PS i OS) korištena su za procjenu njihovih učinaka na MCAO/R štakore, kao i mogućih mehanizama.

Moždani udar je česta akutna cerebrovaskularna bolest. Epidemiološke studije pokazuju da je moždani udar češći u muškaraca nego u žena (Sealy-Jefferson i sur., 2012.; Guzik i Bushnell, 2017.). Stoga su u našem eksperimentu za testove usvojeni mužjaci štakora. Naši rezultati su dokazali da je I/R indukcija ubrzala oksidativni stres i volumen infarkta, razbijajući BBB i dovodeći do oštećenja živaca i cerebrovaskularnih ozljeda. Nakon probira, otkriveno je da TG smanjuju volumen infarkta i potiču neuralno preoblikovanje i angiogenezu. Štoviše, primijećeno je da TG održavaju integritet BBB nakon I/R ozljede. Naprotiv, PS i OS ne donose značajno olakšanje I/R ozljede. Stoga se TG smatraju glavnom aktivnom frakcijomC. deserticolaza neuroprotekciju, potencijalno kroz promicanje neuralnog preoblikovanja, angiogeneze i integriteta BBB putem aktiviranja Nrf- 2/Keap-1 puta.

Sve više dokaza pokazuje da je uspostavljanje učinkovite kolateralne cirkulacije značajno važno za izbjegavanje nastanka infarkta i ishemijske penumbre, te je kritično liječenje u ranoj fazi ishemijskog moždanog udara (ElAli, 2016.; Iwasawa i sur., 2016.). Proliferacija vaskularnih endotelnih stanica i glatkih mišićnih stanica nakon ishemijskog infarkta određuje uspostavu kolateralne cirkulacije. Međutim, modeli ishemije imaju zajednički fenomen - to jest, oksidativni stres je široko prisutan u mikrovaskulaturi mozga. Podaci studije su pokazali da veliki broj antioksidansa može poremetiti funkciju BBB i svojstva angiogeneze (Mentor i Fisher, 2017). CD31 i a-SMA markeri su vaskularnih endotelnih stanica, kao i glatkih mišićnih stanica (Saboor i sur., 2016.). Da bi se istražio učinak ekstrakata iz na gore spomenutu staničnu proliferacijuC. deserticola, ispitali smo ekspresiju CD31 i a-SMA u homogenatu cerebralne ishemijske penumbre. Naši podaci su pokazali da su TG-i izrazito pojačali ekspresiju CD31 i a-SMA. Međutim, nije bilo značajnih razlika za skupine PS i OS. Stoga smo zaključili da TG mogu smanjiti oštećenje mozga promicanjem angiogeneze povećanjem ekspresije CD31 i a-SMA, dok PS i OS ne pružaju takvu zaštitu od oštećenja mozga. Ovi rezultati dodatno su potvrdili da samo TG mogu spriječiti cerebralnu I/R ozljedu.

Ishemijski moždani udar može se smatrati rezultatom cerebralne ishemije uzrokovane oštećenjem neuronske plastičnosti ili remodeliranjem područja mozga. Većina pacijenata s moždanim udarom pati od neuroloških poremećaja. Aktivacija neurogeneze obećavajuća je strategija za pacijente s moždanim udarom za poboljšanje njihovih neuroloških funkcija (Cramer i Chopp, 2000.). Neurogeneza izravno sudjeluje u oporavku neuroloških funkcija nakon I/R ozljede mozga (Zhang et al., 2019). Prethodna istraživanja pokazuju da TG mogu poboljšati stopu preživljavanja hipokampalnih piramidalnih stanica i inducirati neurogenezu (Lian et al., 2017.). Oksidativni stres uzrokuje gubitak neurona tijekom mnogih bolesti, kao što su Parkinsonova bolest, moždani udar i tako dalje (Duan i Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2 transkribira mnogo gena povezanih s neuroprotekcijom u njihovoj promotorskoj regiji, uglavnom uključujući SOD, MDA, CAT i g glutamil cistein ligaze itd. (Satoh et al., 2006.). Proteini SYN, PSD-95 i MAP-2, koji su blisko povezani sa sinaptičkim formiranjem i neurotransmisijom, mogu se smatrati markerima istraživačke neuronske plastičnosti u regiji ishemijske penumbre. Nakon proučavanja otkrili smo da lijek s TG može značajno povećati ekspresiju PSD95, SYN i MAP-2, što ukazuje da je cerebralna zaštita TG u korelaciji s poboljšanom neuronalnom plastičnošću tijekom I/R. Međutim, šteta je što nema očite razlike za PS-ove kao i OS-ove skupine. Ovi rezultati pokazuju da TG mogu povećati neuroplastičnost nakon cerebralne I/R ozljede.Slikovno istraživanje pacijenata s moždanim udarom pokazalo je da se disfunkcija BBB-a može smatrati upečatljivim atributom periishemičnog mozga (Bang et al., 2007.). TJ, koji se sastoje od citoplazmatskih proteina, transmembranskih proteina i spojnih adhezijskih molekula između kapilarnih endotelnih stanica, vrlo su važni u održavanju integriteta BBB (Ye et al., 2019). Među njima su ZO-1, claudin-5 i okludin najvažniji proteini u TJ-u. Sve više dokaza pokazuje da povećana propusnost BBB-a izazvana ishemijom općenito korelira s promjenama ZO-1, claudin-5 i okludina (Cao i sur., 2016.a; Page i sur., 2016.; Yu i sur., 2017.; Liu i sur., 2018.). U ovom su radu rezultati pokazali da iako TG mogu značajno povećati ekspresiju proteina ZO-1, claudin-5 i okludina u moždanim tkivima izazvanim MCAO, ni PS ni OS to nisu učinili. BBB se sastoji od cerebralnih endotelnih stanica i usko je povezan s pericitima (Nyul-Toth et al., 2016.). Periciti su vitalni za integritet BBB (Bell i sur., 2010.). Ishemijski moždani udar izaziva smrt pericita i odvajanje od moždanih endotelnih stanica u akutnoj fazi, destabilizirajući tako mikrovaskulaturu i mijenjajući svojstva BBB (Zechariah et al., 2013.). Naši su podaci pokazali da TG mogu povećati pokrivenost pericita na kapilarama i povećati razine ekspresije ZO-1, claudina-5 i okludina. Ovi su fenomeni dokazali da TG mogu učinkovito zaštititi integritet BBB nakon cerebralne I/R ozljede. Ukratko, TG mogu ublažiti cerebralnu ozljedu na više načina, kao što je promicanje angiogeneze, poboljšanje plastičnosti neurona i održavanje integriteta BBB.

Zatim smo istražili signalni put kako bismo istražili mehanizam koji je u osnovi TG zaštite mozga. Proces I/R ozljede je multifaktorski, pa su brojni mehanizmi uključeni u patogenezu. Oksidativni stres temeljni je čimbenik rizika koji pridonosi I/R-induciranim ozljedama mozga (Suda i sur., 2013.), kao što su oštećenje strukture BBB, vaskularna endotelna disfunkcija i pogoršanje ishemijske ozljede neurona (Xiong i sur., 2015.; Caglayan i sur., 2019.; Priestley i sur., 2019.). Stoga je oksidativni stres postao atraktivna terapeutska meta kod I/R-inducirane ozljede mozga. Enzimi faze 2, koji su posredovani faktorom povezanim s nuklearnim faktorom E2--2 (Nrf-2), smatraju se važnim sredstvom kojim se neuroni štite od oksidativnog stresa (Suzuki i Yamamoto, 2015; Ya i sur., 2018). Sve više dokaza pokazuje da je aktivacija Nrf-2 tijekom I/R potencijalna terapijska meta za neuroprotekciju (Ding i sur., 2015.; Zhang R. i sur., 2017.). Nrf-2, kao važan regulator endogene antioksidativne obrane, posreduje u razini hem oksigenaze 1 (HO-1) i drugih antioksidativnih enzima, poput NAD(P)H kinon oksidoreduktaze 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH i MDA (Siow i sur., 2007.; Ding i sur., 2014.). Štoviše, Nrf-2 igra važnu regulatornu ulogu u angiogenezi. Ova studija pokazuje da se Nrf-2 može značajno pojačati i aktivirati u procesu vaskularnog razvoja (Wei i sur., 2013.).

Kao što je prethodno opisano (Jiang i Tu, 2009), TG sadrže mnogo bioaktivnih spojeva, na primjer, ehinakozid, tubulozid A, akteozid, izo-akteozid i 2'-acetilakteozid, a neki od njih pokazali su neuroprotektivne funkcije nakon cerebralne I/R ozljeda (Peng i sur., 2016.). Echinacoside ima mnogo farmakoloških učinaka, poput antioksidacije, protiv starenja, neuroprotekcije, protuupale, poticanja cicatrizacije, hepatoprotekcije, poticanja stvaranja kostiju i antitumorskih aktivnosti (Yu i sur., 2016; Li i sur., 2018.; Zhang Y. i sur., 2018.; Ji i sur., 2019.; Xu i sur., 2019.). Nedavno je ehinakozid identificiran kao snažan antioksidans u središnjem živčanom sustavu (Lu et al., 2016.). Ehinakozid može smanjiti sadržaj MDA i poboljšati aktivnosti SOD i GSH Px kod ishemijske ozljede mozga, a analiza molekularnog spajanja pokazala je da se ehinakozid može vezati za Keap-1, što dovodi do Nrf-2 nuklearne translokacije (Li i sur., 2018). Studija Xia pokazala je da akteozid može smanjiti volumen infarkta i sadržaj vode u mozgu kako bi poboljšao neurološke nedostatke u MCAO/R štakora kroz ublažavanje oksidativnog stresa (Xia et al., 2018). Druge su studije pokazale da izo-akteozid može povećati aktivnosti staničnih antioksidativnih enzima, SOD i CAT u H2O2-tretiranim V79-4 stanicama (Chae et al., 2005.). Na temelju gornjih izvješća o aktivnim spojevima sadržanim u TG, moguće je zaključiti da bi TG mogli štititi od ishemijskog moždanog udara putem antioksidacijskih puteva.

Li je izvijestio o neuroprotektivnim učincima feniletanoidnih glikozida (PhGs) na H2O2-induciranu apoptozu na PC12 stanicama putem Nrf2/ARE puta (Li et al., 2018.). Ti su PhG-ovi značajno potisnuti pokretanjem nuklearne translokacije Nrf2 i povećanjem ekspresije HO-1, NQO1, katalitičke podjedinice glutamat-cistein ligaze (GCLC) i modifikatorske podjedinice glutamat-cistein ligaze (GCLM) (Li et al., 2018. ; Gong i sur., 2019). Stoga ovi nalazi sugeriraju da put Nrf-2/ARE igra ključnu ulogu u zaštitnim učincima posredovanim PhGs na neuronske stanice. Slično tome, u ovoj smo studiji otkrili da TG mogu smanjiti razinu MDA i povećati razine SOD, CAT i GSH-Px u I/R štakora. U međuvremenu, TG mogu pojačati ekspresiju Nrf2 u jezgri, smanjiti odgovarajuću ekspresiju u citoplazmi i značajno smanjiti ekspresiju Keap-1. Stoga bi put Nrf-2/Keap-1 mogao biti uključen u neuroprotektivne učinke posredovane TG-ima. Daljnja validacija ovog puta provodila bi se in vitro staničnom kulturom s modelima deprivacije/reoksigenacije kisika i glukoze u budućnosti. Štoviše,C. deserticolaekstrakti su primjenjivani u našoj studiji kontinuirano 14 dana. Budući da bi neurogeneza odraslih utjecala na tumačenje neuroprotektivnih učinaka tijekom 14 dana reperfuzije, neurogeneza se ne može isključiti u našem trenutnom dizajnu eksperimenta u istraživanju neuroprotektivnog učinka CT-a. To je ograničenje našeg istraživanja.

Zaključno, to je TGs izC. deserticolakoji mogu poboljšati angiogenezu i neurogenezu kao i održati integritet BBB kod štakora s I/R ozljedom, ali ne i PS i OS. Učinci bi mogli biti posredovani aktivacijom puta Nrf-2/Keap-1.