Terapeutski učinak i mehanizam Cistanche feniletanol glikozida na ciklofosfamidom izazvanu spermatogenezu u miševa

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

ZHAODong-hai1, ZHANGLei2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4

[Sažetak]

Svrha:Kako bi se ispitao terapeutski učinakCistanche feniletanoidni glikozidina miševima sa spermatogenezom induciranom ciklofosfamidom i preliminarno razjasniti njegov mehanizam djelovanja.metoda:Metoda ekstrakcije etanolom za ekstrakcijuCistanche feniletanoidni glikozidi. Četrdeset BALB/C miševa nasumično je podijeljeno u kontrolnu skupinu, modelnu skupinu, skupinu s niskom dozomCistanche feniletanoidni glikozidskupina (50 mg·kg-1), i skupina s visokom dozom (100 mg·kg-1), s 10 miševa u svakoj skupini. Osim kontrolne skupine, miševima u ostalim skupinama ubrizgan je ciklofosfamid (80 mg·kg-1) svaki dan tijekom 5 uzastopnih dana kako bi se pripremili mišji modeli poremećaja spermatogeneze. Nakon zadnje primjene, miševi u skupinama s niskom i visokom dozomCistanche feniletanoidni glikozididavane su odgovarajuće doze gavažom, a miševima u kontrolnoj skupini i modelnoj skupini davan je isti volumen normalne fiziološke otopine gavažom, jednom dnevno tijekom 30 dana. Dvadeset i četiri sata nakon zadnje gavaže, uzeto je tkivo testisa miša. Za određivanje razine testosterona u homogenatu tkiva testisa miša korišten je enzimski imunosorbentni test. Uspoređena je gustoća spermija, pokretljivost spermija i stopa abnormalnosti spermija svake skupine. Morfološke promjene tkiva testisa promatrane su HE bojenjem. Rezultati: U usporedbi s kontrolnom skupinom, gustoća spermija i stopa pokretljivosti spermija u modelnoj skupini smanjeni su (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">Cistanche feniletanoidni glikozidisu značajno povećane (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">Cistanche feniletanoidni glikozidskupina značajno porasla, slojevi su različiti, spermatogene stanice su raspoređene uredno, zbijeno i pravilno, a spermiji se mogu vidjeti u lumenu.Zaključak: Cistanche feniletanoidni glikozidiima značajan terapeutski učinak na poremećaj spermatogeneze uzrokovan ciklofosfamidom kod miševa, a njegov mehanizam bi se mogao povezati s poboljšanjem razine testosterona u tkivima testisa.

[Ključne riječi]Cistanche feniletanoidni glikozidi; ciklofosfamid; poremećaj spermatogeneze; miševi, BALB/C

Kliknite za Cistanche proizvode

Zbog ubrzanog društvenog ritma, loših životnih navika i onečišćenja okoliša te drugih čimbenika, abnormalna kvaliteta sperme poput oligospermije i astenospermije postala je glavni uzrok muške neplodnosti [1]. Trenutačno postoji manje lijekova za liječenje oligospermije i astenospermije, a terapijski učinak nije očit. Recepti tradicionalne kineske medicine ili aktivni sastojci imaju dobre učinke u poboljšanju muške reproduktivne funkcije [2-6]. Međutim, zbog velike raznolikosti lijekova na recept, odnos između farmakoloških učinaka i učinkovitih sastojaka lijeka nije jasan, što ograničava promociju i primjenu spermatogenih lijekova. Istraživanje i razvoj učinkovitih sastojaka kineske medicine i proučavanje njezinih terapijskih učinaka kod reproduktivnih ozljeda imaju dobru primjenjivu vrijednost.Cistanche feniletanoidni glikozidisu jedan od najvažnijih aktivnih sastojaka uCistanche deserticola. Obično su to prirodni glikozidi koji sadrže esterske veze i okso-glikozidne veze s -glukozom kao jezgrom. Rasprostranjeni su u dikotilnim biljkama [7]. Studije [8] su pokazale daCistanchefeniletanoidglikozidimože zaštititi spermu štakora od oksidativnog oštećenja in vitro, ali nema izvješća o njegovoj spermatogenezi. Ovaj eksperiment proučava terapijski učinak Cistanche feniletanoidnih glikozida na spermatogenu funkciju miševa sa spermatogenezom induciranom ciklofosfamidom i daje eksperimentalnu i teorijsku osnovu za primjenuCistanche feniletanoidni glikozidiu liječenju poremećaja spermatogeneze.

1. Materijali i metode

1.1. Laboratorijske životinje, glavni reagensi i instrumenti

40 odraslih BALB/C miševa klase SPF, starih 6-8 tjedana, tjelesne mase 20-22g, kupljeno je od Centra za eksperimente na životinjama Fakulteta osnovne medicine Sveučilišta Jilin, a broj certifikata za životinje : SCXK (Kirgistan) 2008-005. Miševi su uzgajani adaptivno 5 dana prije eksperimenta. Uvjeti hranjenja: 22 ~ 25 stupnjeva, cirkadijalni ritam (12h/12h), besplatna voda za piće i hrana. Cistanche je proizvod Xinjiang Dakang Trading Company. Ciklofosfamid za injekciju je kupljen od Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (broj serije 11061921). Komplet za imunološku analizu vezanu na enzime testosterona u homogenatu tkiva testisa kupljen je od Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (broj serije) 20120812), svi ostali reagensi su domaće proizvodnje analitičke kvalitete. PLUS384 čitač mikropločica (MDC u Sjedinjenim Državama), TE2000U invertirani mikroskop (Nikon, Japan) i J-26XP centrifuga (Nanodrop, Sjedinjene Države).

1.2 Priprava Cistanche Phenylethanol Glucoside

10 g cistanche praha ekstrahirano je refluksiranjem sa 70 postotnim etanolom, dva puta, svaki put po 2 sata, da se dobije koncentrat glikozida fenetilnog alkohola. Koncentrirana otopina je kromatografirana na koloni D101 makroporozne smole i eluirana sa 70 postotnim etanolom da se dobije Cistanche fenekozid alkohol. UV spektrofotometar identificirao je ekstrakt na valnoj duljini od 333 nm.

1.3 Priprema životinjskog modela i metoda primjene lijeka

Nakon što je 40 mužjaka BALB/C miševa prilagođeno hranjeno 5 dana, miševi su nasumično podijeljeni u 4 skupine (10 miševa u svakoj skupini): kontrolna skupina, modelna skupina, CistancheCistanche feniletanoidni glikozidiskupina s niskim dozama iCistanche feniletanoidni glikozidiskupinu visoke doze. Osim kontrolne skupine, ostale tri skupine miševa dobile su intraperitonealnu injekciju ciklofosfamida od 80 mg·kg-1 za svakog miša tijekom 5 uzastopnih dana kako bi se pripremili životinjski modeli poremećaja spermatogeneze. Nakon što je model pripremljen, miševi u skupinama s niskom i visokom dozomCistanchefeniletanoid davali su 50 odnosno 100 mg·kg-1·d-1. Miševi u kontrolnoj skupini i skupini modela dobili su jednake količine normalne fiziološke otopine. Jednom dnevno tijekom 30 dana. Svi miševi su žrtvovani 24 sata nakon zadnje primjene lijeka i obavljeni su bilateralni testovi. Desni testis je fiksiran formaldehidom. Epididimis i testis uzeti su s lijeve strane. Testis je homogeniziran i centrifugiran na 3,000 min 10 min. Supernatant je uzet i pohranjen u posudu za led na -20 stupnjeva za testiranje. Lijevi epididimis testiran je na gustoću spermija, pokretljivost spermija i stopu deformiteta.

1.4 Određivanje gustoće spermija, pokretljivosti spermija i stope deformiteta

Stavite epruvetu koja sadrži 10 mL hranjive otopine sperme [9] u vodenu kupelj konstantne temperature da je prethodno zagrijete na 37 stupnjeva, uzmite jednostrani epididimis da uklonite vezivno tkivo i mast, izrežite tkivo i stavite ga u epruvetu na 37 stupnjeva 10 minuta Nakon što se sperma potpuno oslobodi, uzmite 1 kap na pločicu za brojanje krvnih stanica i izračunajte gustoću spermija prema metodi brojanja stanica. Rezultat se izražava kao broj spermija po mililitru; uz to uzmite 5 μL suspenzije spermija i istu količinu eozina-Y iz epruvete. Dobro promiješajte, stavite na sobnu temperaturu 10 minuta, dodajte pokrovno staklo i promatrajte svjetlosnim mikroskopom. Mrtvi spermiji su obojeni ružičasto, živi spermiji nisu obojeni, a citoplazma je prozirna. Svaki uzorak broji 200 spermija, izračunava održivost spermija, rezultat se izražava kao postotak, održivost spermija=broj živih spermija / ukupan broj spermija × 100 posto. Drugih 5 μL suspenzije sperme fiksirano je u metanolu 5 minuta, osušeno i obojeno 2 postotnom vodenom otopinom eozina 1 sat, isprano i osušeno fenom. Potražite dijelove s manjim preklapanjem spermija pod lećom niske svjetlosne svjetlosti i upotrijebite leću velike svjetiljke za provjeru morfologije spermija. Svaki miš pregledao je 1000 kompletnu spermu. Glavice spermija bez kukica, oblika banane, amorfne, masne glave i dvostruke glave ocijenjene su kao deformiteti. Izračunata je stopa deformacije sperme i rezultati su izraženi u postocima. Stopa deformacije spermija=broj deformiranih spermija / ukupan broj spermija × 100 posto.

1.5 Određivanje reproduktivnih hormona

Testis je oguljen s membrane i stavljen u posudu za bočicu, a prethodno ohlađeni medij za homogenizaciju (0.01mol·L-1 saharoza, 0.01mol ·L-1 Tris-HCl, 0,1 mmol·L-1 EDTA-Na2 otopina, pH 7,4), izrežite tkivo testisa oftalmološkim škarama, izlijte ga u staklenu epruvetu za homogenizaciju i centrifugirajte na 4, 000×g 10 minuta na niskoj temperaturi i uzmite supernatant. Upotrijebite set za imunoenzimski test za mjerenje razine testosterona u homogenatu tkiva testisa i testirajte 3 paralelna uzorka za svaki uzorak. Eksperimentalni koraci i metode dovršeni su u skladu s uputama kompleta.

1.6 Morfološko promatranje testisa

Uzmite parafinske rezove testisa miša, obojene HE, i promatrajte distribuciju spermatogonija i spermatogenih stanica u tkivu testisa pod svjetlosnim mikroskopom.

1.7 Statistička analiza

Statistička analiza provedena je pomoću statističkog softvera SPSS17.0. Gustoća spermija, stopa pokretljivosti spermija, stopa deformacije spermija i razina testosterona u testisima miševa u svakoj skupini izraženi su kao x±s, a usporedba između skupina provedena je jednofaktorskom analizom varijance.

2. rezultati

2.1. Gustoća spermija, pokretljivost spermija i stopa deformacije spermija svake skupine miševa

U usporedbi s kontrolnom skupinom, gustoća spermija i održivost spermija u modelnoj skupini smanjeni su (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">Cistanche fenoksietanol glikozidpovećana (P<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">

2.2 Razine testosterona u tkivima testisa miševa u svakoj skupini

Razine testosterona u homogenatima testikularnog tkiva kontrolne i modelne skupine bile su (10.26±0.57) i (5.33±0.84) nmol·L-1, odnosno. Razina testosterona u modelnoj skupini bila je značajno niža od one u kontrolnoj skupini (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">Cistancheskupina s visokom dozom fenetil glikozida cistanche bila je značajno viša nego skupina s niskom dozom (P<>

2.3 Morfologija testisa miša u svakoj skupini

Promatrano svjetlosnim mikroskopom, sjemeni tubuli u testisima normalne skupine bili su gusto raspoređeni, razina i broj zametnih stanica bili su veliki, sjemenonosni epitel bio je uredno raspoređen, a svi sjemenonosni tubuli vidjeli su se sa stvaranjem sperme. U modelnoj skupini sjemeni kanalići u testisima miševa bili su atrofirani i degenerirani, epitel sjemena bio je značajno stanjen, broj epitelnih slojeva smanjen, raspored poremećen, a broj spermija u šupljini smanjen. U usporedbi s modelskom skupinom, niska dozaCistanche fenetil alkohol glikozid.

U skupini se povećao broj slojeva sjemenog epitela sjemenih tubula, raspored epitela je bio pravilniji, a oštećenje sjemenih tubula je očito poboljšano; struktura sjemenih tubula u visokim dozamaCistanche feniletanoidni glikozidskupini značajno poboljšao, a broj i broj slojeva sjemenog epitela značajno se povećao. Uredno raspoređeni, u sjemenim tubulima nalaze se zreli spermiji, a struktura se u osnovi vraća u normalu. Pogledajte sliku 1 (umetak 6).

3 Rasprava

Ciklofosfamid je često korišteni lijek protiv tumora i imunosupresiv, koji uglavnom ometa različite unutarstanične biološke funkcije putem alkilacije DNA. Reproduktivna toksičnost jedna je od glavnih nuspojava ciklofosfamida [3], koja lako može dovesti do oštećenja DNA spermija i abnormalnog razvoja spermija. Kliničke studije [10-11] pokazuju da reproduktivna toksičnost ciklofosfamida može uzrokovati azoospermiju ili oligospermiju. , Dovode do neplodnosti ili pojave genetskih defekata ili malformacija u potomstvu.

Cistanche tubulosaje višegodišnja viša parazitska biljka iz porodice Leiden. To je poznati kineski lijek koji hrani bubrege i jang, hrani krv, hrani crijeva. To je često korišteni lijek na recept za tradicionalno liječenje muške reproduktivne disfunkcije [12].Feniletanoidni glikozidisu jedna od najvažnijih aktivnih komponentiCistanche[13] i imaju širok raspon farmakoloških učinaka, poput antioksidacije, starenja i tumora [14].

U ovoj studiji ciklofosfamid je korišten za pripremu mišjeg modela poremećaja spermatogeneze, te je proučavan terapeutski učinak feniletanoidnih glikozida Cistanche na poremećaj spermatogeneze uzrokovan ciklofosfamidom. Rezultati su pokazali da se u usporedbi s normalnom skupinom gustoća spermija u modelnoj skupini smanjila, stopa preživljavanja smanjila, a stopa deformiteta povećala. U usporedbi s modelnom skupinom, sve skupine doza Cistanche fenoksietanol glikozida mogu učinkovito povećati gustoću spermija, poboljšati pokretljivost spermija i smanjiti stopu deformacije spermija. Gornji rezultati pokazuju da glikozidi cistanhe fenoksietanola mogu pospješiti spermatogenezu i zaštititi oštećeni testis. Rezultati morfologije testisa pokazali su da nakon tretmana sCistanche feniletanoidni glikozid, broj sjemenog epitela u testisu modelnih miševa bio je značajno povećan, slojevi su bili jasni, spermatogene stanice bile su uredno, zbijeno i pravilno raspoređene, a spermiji se mogu vidjeti u lumenu, što sugerira daCistanche feniletanoidmože promijeniti Shanhe obnavlja strukturu i morfologiju epitela sjemena nakon reproduktivne ozljede.

Testosteron regulira diferencijaciju muških spolnih stanica i neophodan je uvjet za normalan razvoj testisa i normalan nastanak spermija. Neke su studije [15] objavile da je selektivni nokaut androgenih receptora u Sertolijevim stanicama testisa uzrokovao poremećaje razvoja spermija i sterilitet kod muškaraca. U ovoj studiji, ciklofosfamid je korišten za proizvodnju spermatogenika.

Nakon modela ozljede s preprekom, razina testosterona u tkivu testisa miševa bila je znatno niža od one u normalnoj skupini. Nakon djelovanja Cistanche feniletanoidnih glikozida, razine testosterona u svakoj doznoj skupini su porasle, a razina testosterona u visokoj doznoj skupini bila je značajno viša od one u niskoj doznoj skupini. Pretpostavlja se da cistanche fenoksietanol glikozidi mogu pospješiti spermatogenezu povećanjem razine testosterona u tkivu testisa za liječenje spermatogene disfunkcije, ali mehanizam njegovog učinka na testosteron zahtijeva daljnje istraživanje i raspravu.

Testosteron regulira diferencijaciju muških spolnih stanica i neophodan je uvjet za normalan razvoj testisa i normalan nastanak spermija. Neke su studije [15] objavile da je selektivni nokaut androgenih receptora u Sertolijevim stanicama testisa uzrokovao poremećaje razvoja spermija i sterilitet kod muškaraca. U ovoj studiji, ciklofosfamid je korišten za proizvodnju spermatogenika.

Nakon modela ozljede s preprekom, razina testosterona u tkivu testisa miševa bila je znatno niža od one u normalnoj skupini. Nakon djelovanja odCistanche feniletanoidni glikozidi, razine testosterona u svakoj doznoj skupini su porasle, a razina testosterona u visokoj doznoj skupini bila je znatno viša od one u niskoj doznoj skupini. Pretpostavlja se da cistanche fenoksietanol glikozidi mogu pospješiti spermatogenezu povećanjem razine testosterona u tkivu testisa za liječenje spermatogene disfunkcije, ali mehanizam njegovog učinka na testosteron zahtijeva daljnje istraživanje i raspravu.

[reference]

[1] Wang Yixin, Zheng Jufen. Novi napredak u istraživanju muške neplodnosti [J]. Kineski časopis za andrologiju, 2006., 12(9): 771-774.

[2] Xie Jianxing, Wang Jun, Chen Ming, et al. Učinak Guilingji kapsule na model štakora s oligospermijom. Uloga proizvodnje sperme i utjecaj na spolne hormone [J]. Časopis Sveučilišta tradicionalne kineske medicine i farmacije Guangzhou, 2011., 28(6): 621-623.

[3] Zhang Changcheng, Jia Liangliang, Li Shouchao, et al. Ukupni flavonoidi Epimediuma uzrokuju minimiziranje ciklofosfamida Istraživanje zaštitnog učinka spermatozoidne barijere rođene štakorima [J]. Kineska patentna medicina, 2010., 32 (12): 2052-2055.

[4] Xu Lei, Wang Rui, Zhang Weixing, et al. Shengjing granule na oštećenje sperme izazvano ciklofosfamidom ometaju terapeutski učinak miševa [J]. Journal of Zhengzhou University: Medical Science Edition, 2008, 43(2): 267-270.

[5] Wang Rui, Xu Lei, Zhang Weixing, et al. Učinak Shengjing granula kineske medicine na miševe s oštećenom spermatogenezom Eksperimentalno istraživanje terapijskih učinaka [J]. Kineski časopis za andrologiju, 2008., 14 (11): 1046-1049.

[6] Guo Kaihua, Gao Fulu, Niu Siyun, et al. Učinak Heshouwu dekokcije na tkivo testisa starijih štakora Utjecaj staničnog puta prijenosa signala Rb/p53 [J]. Anatomy Journal, 2010, 41(3): 435-439.

[7] Wu Haihong, Xuan Guodong, Liu Chunquan. Učinak refluksne ekstrakcije Cistanche Phenylethanol Glucoside s istraživanjem faktora etanola [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2009 (1): 250-251.

[8] Li Gang, Zhu Wenbin, Niu Fei, et al. Učinci Cistanche Phenylethanol Glucoside na spermu štakora Istraživanje zaštitnog učinka vanjskog oksidativnog oštećenja [J]. Lishizhen tradicionalna kineska medicina i Materia Medica, 2010., 21(9): 2205-2207.

[9] Chen Deyu, Liu Limin, Xie Qingdong, itd. Antitijela protiv sjemena na mitohondrijsku funkciju spermija Utjecaj [J]. Journal of Shantou University Medical College, 2008, 21(1): 4-6.

[10] KenneyLB, Laufer MR, Grant FD, et al. Visoki rizik od informacija Visoke doze seciklopafamiddeforsarkoma u djetinjstvu [J].Cancer, 2001., 91(3): 613-621.

[11] JahunkainenK, EhmckeJ, Houm, etal. Funkcija testisa i očuvanje plodnosti kod pacijenata oboljelih od raka [J]. BestPrect ResClinEndocrinol Metab, 2011, 25: 287-302.

[12] Gao Zhanyou, Zhou Haitao, Lin Qiang. Sposobnost Cistanche da se odupre umoru od vježbanja kod štakora i utjecaju slobodnih radikala u mozgu [J]. Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(16): 9592-9595.

[13] Ren Lu, Gu Xiaohong, Tang Jian, et al. Phenylethanol glicosides in cultivated Cistanche cistanche Ekstrakcija i istraživanje pročišćavanja [D]. Wuxi: Sveučilište Jiangnan, 2006., 25(3): 33-36. [14] Jinghui, Zuo Jianfeng, Li Jiaoshe. Napredak u farmakološkom istraživanju fenoksietanol glikozida Izložba [J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica, 2006, 17(3): 440-441.

[15] ChangC, ChenYT, YehSD, i dr. Infomedijsko proljeće TheandrogenreceptorinSertolicells [J]. ProcNatlAcadSci USA, 2004, 101 (18): 6876-6881.