Uloga fosfata neovisna o proteinima u napredovanju kronične bubrežne bolesti

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Irene Faria Duayer¹ et al

Sažetak:Nekoliko čimbenika doprinosibubrežna funkcijasmanjenje u bolesnika s KBB-om, a uloga sadržaja fosfata u prehrani još uvijek je predmet rasprave. Ova studija ima za cilj analizirati mehanizam kojim je fosfat, neovisno o proteinu, povezan s progresijom CKD-a. Odrasli štakori Munich-Wistar podvrgnuti su 5/6 nefrektomiji (Nx), hranjeni su dijetom s malo proteina i podijeljeni u dvije skupine. Samo je sadržaj fosfata (nizak fosfat, LoP, 0.2 posto; visok fosfat, HiP, 0.95 posto) diferencirao dijete. Nakon šezdeset dana biokemijski parametri ibubreganalizirana je histologija. HiP skupina pokazala je lošiju bubrežnu funkciju, s višim razinama PTH, FGF-23 i frakcijskim izlučivanjem fosfata. U histološkoj analizi bubrežnog tkiva također su pokazali veći postotak intersticijske fibroze, ekspresiju -aktina, PCNA ibubrežniinfiltracija makrofagima. Skupina LoP pokazala je veću ekspresiju beklina-1 u stanicama bubrežnih tubula, markera autofagijskog efluksa u usporedbi sa skupinom HiP. Naša otkrića naglašavaju djelovanje fosfata u indukcijibubregintersticijska upala i fibroza, pridonoseći progresiji bubrežne bolesti. Mogući učinak fosfata na disregulaciju mehanizma autofagije bubrežnih stanica zahtijeva daljnja istraživanja kliničkim studijama.

Ključne riječi:fosfat;dijeta; CKDnapredovanje;bubrežnifibroza; autofagija;apoptoza

Ključni doprinos:Mehanizmi zaštite bubrega, restrikcijom fosfatne prehrane, tek će se utvrditi. U ovoj studiji, preopterećenje fosfatima djelovalo je na progresiju CKD-a aktivacijom upalnih putova i indukcijombubregintersticijska fibroza. Učinak hiperfosfatemije na apoptozu bubrežnih stanica i autofagiju zahtijeva daljnje istraživanje.

Cistanche tubulosa sprječava bolesti bubrega, kliknite ovdje za uzorak

1. Uvod

Kroničnobubregbolest (CKD) smatra se javnozdravstvenim problemom. Njegova prevalencija raste s dobi i varira između 11 i 13 posto diljem svijeta [1]. Iako je CKD općenito ireverzibilno stanje, može se koristiti nekoliko pristupa za usporavanje napredovanja bolesti, kao što su kontrola krvnog tlaka, dislipidemije i hiperglikemije, uporaba inhibitora angiotenzin-konvertirajućeg enzima i niskoproteinska dijeta [2-7] . Među tim strategijama, niskoproteinska dijeta je najveći sporni prijedlog za odgodububregopadanje funkcije, zbog zabrinutosti oko njegove usklađenosti, sigurnosti i učinkovitosti. Nedostatak konsenzusa o prednostima smanjenja proteina u prehrani oslanja se na preklapajuću ulogu sadržaja proteina i fosfata u prehrani. Budući da su izvori proteina bogati fosfatima, preporučuje se smanjenje unosa proteina kako bi se postigao ograničeni unos fosfata. Moguće je ograničiti proteine ​​bez ograničenja fosfata, iako je suprotno teško.

U eksperimentalnim studijama, učinak prehrane s niskim sadržajem proteina štitio je modele CKD-a od oštećenja glomerula i proteinurije [8], potičući veće očuvanje brzine glomerularne filtracije [9]. Treba napomenuti da su proteini i fosfati u visokoj korelaciji. Stoga, iako su se neke eksperimentalne studije usredotočile na procjenu izoliranog učinka restrikcije proteina, one su također mogle biti pristrane zbog nenamjerne restrikcije fosfata. S druge strane, pojedinačni doprinos prehrane bogate fosfatima razvoju kronične bubrežne bolesti jasno je prikazan [10,11]. Pokazalo se da prehrana bogata fosfatima potiče više intersticijabubregfibroza i tubularna atrofija, s minimalnom glomerulosklerozom, u uremičnih štakora. Zanimljivo je da je šteta ublažena nakon restrikcije fosfata [12]. Važno je napomenuti da sadržaj proteina u prehrani nije spomenut u ovoj studiji.

U kliničkom scenariju, niskoproteinska dijeta smanjila je koncentraciju uremijskih toksina i očuvala zaostalu bubrežnu funkciju, čak i u prijelazu s konzervativne skrbi na inkrementalne režime dijalize [13].dijetetskiproteinRestrikcija je također odgodila progresiju CKD-a u nedavnoj meta-analizi [14]. Međutim, kako je ograničenje proteina bilo povezano s nižim razinama fosfata u serumu, ovaj se povoljan učinak prehrane mogao djelomično objasniti ograničenjem fosfata. Najveća prospektivna studija do sada, MDRD [15], pokazala je samo malu korist od dijete s niskim sadržajem proteina u bolesnika s umjerenom insuficijencijom bubrega, dok progresija bubrežne bolesti nije utjecala u bolesnika s teškom insuficijencijom bubrega. Usprkos tome, sadržaj fosfata u prehrani nije razmatran u ovom ispitivanju i utjecaj njegovog pojedinačnog doprinosa usporavanjuCKDprogresija ostaje nepoznata.

Poznato je da fosfat može sniziti bubrežni i cirkulirajući Klotho [16], protein protiv starenja uključen u citoprotekciju i antifibrozu, s antioksidativnim i antiapoptotskim učincima [17]. Osim toga, već je dokazana neispravna autofagija u bubrežnim stanicama zbog nedostatka Klotho [18]. Autofagija je katabolički proces s kritičnim funkcijama u održavanju stanične homeostaze i očuvanju stanične održivosti u uvjetima stresa. Neki dokazi upućuju na povezanost između autofagije i progresije CKD-a kroz različite putove, uključujući TGF-signalizaciju [19], snažan fibrogeni čimbenik za razvoj bubrežne fibroze. TGF- utječe na nekoliko bioloških procesa, regulira staničnu proliferaciju i diferencijaciju, apoptozu i djeluje tako da se veže na specifične transmembranske receptore koji induciraju unutarstaničnu signalizaciju posredovanu SMAD proteinima [20]. Apoptoza je mehanizam programirane stanične smrti koji se razlikuje od nekroze. Fosfat je opisan kao medijator apoptoze u eksperimentalnim modelima endotelnih [21], osteoblastičnih [22] i peritonealnih mezotelnih stanica [23]. Postoje dokazi o sudjelovanju apoptotičke stanične smrti u progresijibubregozljeda [24], ali učinak fosfata na apoptozu bubrežnih stanica još nije razjašnjen.

Budući da mehanizam kojim prehrana bogata fosfatima ubrzava napredovanje kronične bubrežne bolesti još nije potpuno razjašnjen, pretpostavili smo da bi mogao biti povezan s disfunkcionalnim autofagičnim tipom. Stoga smo u trenutnoj studiji procijenili dvije skupine štakora Munich-Wistar prema sadržaju fosfata u njihovoj prehrani (nizak 0.2 posto u odnosu na visok0.95 posto) i ispitali utjecaj dijeta s malo fosfata nabubrega' histološke i imunohistokemijske promjene, uključujući marker autofagije, beclin-1.

2. Rezultati

Hemodinamski, morfološki i biokemijski parametri dobiveni iz skupina s niskom (LoP) i visokofosfatnom dijetom (HiP) dati su u tablici 1. Kao što se i očekivalo, 5/6- nefrektomija izazvala je smanjenje klirensa kreatinina i povećanje u serumskoj urei i kreatininu u obje skupine. Životinje iz skupine HiP imale su nižu bubrežnu funkciju, što je dokazano višim kreatininom i nižim klirensom kreatinina; također su pokazali niži hematokrit i manju konačnu težinu. Grupa HiP pokazala je povećanje serumskog i frakcijskog izlučivanja fosfata, kao i paratiroidnog hormona (PTH) i faktora rasta fibroblasta-23 (FGF-23). Treba napomenuti da su kaudalni pritisak, početna težina i izlučivanje albumina u urinu bili slični između skupina.

Histološki nalazi prikazani su na slikama 1–3. Glomeruloskleroza (GS) je jedva nađena u obje skupine. Međutim, postotak intersticijske fibroze bio je značajno viši među štakorima u HiP skupini. U skladu s tim, te su životinje također imale veći postotak područja obojenog aktinom glatkih mišića i veću bubrežnu infiltraciju makrofagama, procijenjeno ekspresijom ED-1, kao što je prikazano u tablici 2. Ekspresija fosforiliranog SMAD (p-SMAD), marker aktivacije TGF-beta puta, nije se razlikovao između skupina.

Stanice pozitivne na proliferativni stanični nuklearni antigen (PCNA) bile su prevladavajuće u HiP skupini, što sugerira da preopterećenje fosfatima potiče intenzivniju proliferaciju bubrežnih stanica. Nasuprot tome, broj apoptotskih stanica bio je veći u LoP skupini. Isto tako, beclin 1-pozitivne stanice bile su značajno veće u tubulointersticijskim lezijama u LoP skupini, što ukazuje na mogući učinak višeg fosfata u inhibiciji regenerativnog autofagijskog procesa nabubregtkivo.

3. Rasprava

Ova eksperimentalna studija istraživala je je li ograničenje unosa fosfata u prehrani učinkovit korak za usporavanje progresije kronične bubrežne bolesti, bez obzira na popratnu restrikciju proteina u prehrani. Ispitali smo učinak prehrane s različitim sadržajem fosfata ({{0}}.2 naspram 0,95 posto) u 5/6-nefrektomiranom životinjskom modelu, pri čemu su sve životinje dobivale niskoproteinsku dijetu (12 posto). Naša otkrića pokazala su da je prehrana s visokim udjelom fosfata povezana s hiperfosfatemijom, unatoč povećanju PTH, FGF-23 i, posljedično, frakcijskom izlučivanju fosfata. Osim toga, HiP je uzrokovao oštećenje bubrežne funkcije i povećanje intersticijske fibroze, što je bilo povezano s većom ekspresijom -aktina, infiltracijom makrofaga i staničnom proliferacijom, kao i inhibicijom autofagije.

Meta-analiza 12 kohortnih studija koja su uključivala 25 546 bolesnika s kroničnom bubrežnom bolesti bez dijalize pokazala je neovisnu povezanost između razina fosfata u serumu,bubregneuspjeh i smrtnost [25]. Štoviše, retrospektivna kohortna studija u 13 772 bolesnika na dijalizi otkrila je povezanost između hiperfosfatemije i drugih abnormalnosti CKD-mineralnog i koštanog poremećaja s oštrijim padom rezidualnogbubregfunkcija [26]. Mehanizam kojim restrikcija fosfata odgađa napredovanje CKD tek treba biti utvrđen. U eksperimentalnoj studiji pokazali smo da je prehrana obogaćena fosfatima bila povezana s jače oštećenom funkcijom bubrega u usporedbi s prehranom s niskim sadržajem fosfata kod štakora Wistar podvrgnutih paratireoidektomiji i 5/6-nefrektomiji, korištenjem fiksirane paratiroidne žlijezde suplementacija hormona (PTH) [11]. Kusano i sur. [10] pokazalo je da je zaštita bubrežne funkcije povezana s prehranom s niskim udjelom fosfata (0.3 posto), bez obzira na sadržaj proteina u prehrani uremijskih štakora. Međutim, štakori s normalnom fosfatnom (0,5 posto) prehranom pokazali su te dobrobiti samo ako su hranjeni vrlo niskoproteinskom (8,4 posto) prehranom. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da bi uloga prehrambenih fosfata mogla biti snažnija od prehrambenih proteina. Međutim, niti jedna od gore spomenutih studija nije pokušala istražiti potencijalne putove koji bi mogli biti uključeni u oštećenje bubrega povezano s fosfatima.

Djelovanje preopterećenja fosfatima u progresiji CKD bilo je predmet nekoliko studija. Oznake i dr. prvi je predložio ovu mogućnost u životinjskom modelu, ali prehrambeni [27] protein nije bio kontroliran, što je vjerojatno prikrilo izolirani učinak fosfata. Pretpostavljena dobrobit restrikcije neovisne o fosfatima, umjesto restrikcije proteina u scenariju KBB-a, od velikog je interesa jer rizik kontrole serumskog fosfata zajedno s ograničenim unosom proteina može dovesti do pothranjenosti i uzrokovati veću smrtnost.

Sadržaj fosfata u prehrani ne mora nužno odrediti koncentraciju fosfata u serumu u bolesnika s kroničnom bubrežnom bolesti [28], naglašavajući važnost ograničenja prehrane neovisno o koncentraciji ovog elementa u serumu. Patološki učinci fosfata na kosti i kardiovaskularni sustav motiviraju intervencije za liječenje hiperfosfatemije. U kliničkoj praksi, intervencije za smanjenje razine fosfata sastoje se od dijetetskih ograničenja i veziva fosfata. Iako su dobrobiti ovog pristupa kliničkim krajnjim točkama bile upitne u studiji malog uzorka [29], s obzirom na spoznaju da je višak fosfata odgovoran za prekomjernu proizvodnju PTH i FGF-23, razumno je zadržati razine fosfata što je moguće niže u bolesnika s CKD [30].

Niskoproteinska dijeta uzrokuje nisku bioraspoloživost fosfata i smanjuje serumski FGF-23 [31,32], posrednik reapsorpcije fosfata ovisne o natriju na stanicama bubrežnih tubula. Ovo sugerira da na mehanizam regulacije fosfata kod uznapredovalog KBB-a može utjecati unos fosfata na potpuno neovisan način o sadržaju proteinske dijete. Iz tog razloga, procijenili smo učinak sadržaja fosfata u prehrani na progresiju CKD-a, u modelu 5/6-nefrektomije. Prethodna eksperimentalna studija već je pokazala da fosfat može modificirati antiproteinurijski odgovor na dijetu s vrlo malo proteina (0,3 g/kg), pokazujući korelaciju između razine fosfata u serumu i fosfaturije s antiproteinurijskim odgovorom na ograničena proteinska dijeta, neovisno o bubrežnoj funkciji [33]. U unakrsnoj studiji koja je uključivala 11 bolesnika s KBB-om (eGFR 30-55 mL/min/m2), cirkadijalni ritam serumskih fosfata bio je promijenjen dijetom s visokim sadržajem fosfata, što nije objašnjeno izlučivanjem fosfata urinom, PTH-om ili FGF-om -23 [34]. Ovaj rezultat jača važnost restrikcije fosfatne prehrane u bolesnika s KBB-om kao neovisnog terapeutskog cilja.

Čini se da hemodinamski status nije uključen u pogoršanje bubrežne funkcije u HiP skupini, jer je arterijski tlak bio sličan u obje skupine. Osim toga, nismo pronašli značajna oštećenja glomerula u našem modelu, što bi se moglo objasniti ograničenjem proteina. Međutim, primijetili smo više intersticijske fibroze u skupini na HiP dijeti.

Intersticijska fibroza dobro je povezana s gubitkom bubrežne funkcije kod ljudi i štakora.

Prethodna studija povezala je razvoj bubrežne fibroze izazvane prehranom s visokim sadržajem fosfata preko peptidil-prolil izomeraze Pin 1 [35], dok su drugi radovi ukazali na štetnu ulogu nedostatka aKlothoa nabubregfibroza tkiva [36,37]. Genetska delecija Klothoa, u eksperimentalnim modelima, uzrokuje starenje, usporavanje rasta i kalcifikacije [38]. FGF23-Klotho signalizacija inhibira bubrežnu reapsorpciju fosfata. U uvjetima CKD, Klotho ekspresija je smanjena u bubrežnim tubulima [39]. Štoviše, prehrana bogata fosfatima pogoršala je nedostatak aKlotho u modelu ishemijsko-reperfuzijske akutne ozljede bubrega i dodatno pospješila povećanjebubregfibroza tkiva, ubrzavajući progresiju CKD [18]. Utjecaj fosfatne prehrane na bubrežnu ekspresiju Klothoa već je pokazan na mišjim modelima [40]. Moguće, između ostalih putova, preopterećenje fosfatima pogoršava bubrežnu funkciju modulacijom Klotho ekspresije na tubularnim stanicama; to bi trebalo dodatno istražiti u budućim studijama.

Apoptoza i fibroza su posredovane citokinima, kao što je TGF- [41,42]. Opisali smo povezanost sekundarnog hiperparatireoidizma i posljedične veće ekspresije TGF-a na proces remodeliranja srca [43]. Navodno postoji povezanost između aktivacije PTH i TGF-signalizacije koja stimulira proliferaciju fibroblasta, sintezu kolagena i fibrozu. Postoje čak i eksperimentalni dokazi o integriranom djelovanju TGF- i PTH receptora na koštane stanice, regulirajući signalizaciju pregradnje kosti [44]. Uloga TGF-/Smad signalizacije ububregbolest je već opisana. TGF- veže transmembranski receptor, pokreće fosforilaciju Smads proteina i potiče njihovu translokaciju u jezgru radi transkripcijskih učinaka. Stoga su neophodni za prijenos signala članova TGF-obitelji. Doista, već je dokazana prekomjerna ekspresija proteina Smad2 i Smad3 u fibrotičnom bubregu u životinjskim modelima s CKD [45]. Zanimljivo je da postoje dokazi o aktivaciji Smads pomoću drugih medijatora neovisnih o TGF-u, kao što su uznapredovali krajnji produkti glikacije [46] i angiotenzin II [47]. Kako na učinak hiperfosfatemije na progresiju CKD-a nije utjecala nadoknada PTH-a u eksperimentalnom modelu [11], pitamo se bi li fosfat imao izravnu ulogu u signalizaciji Smad bubrega. U našem modelu nije bilo utjecaja hiperfosfatemije na ekspresiju p-Smad u stanicama bubrežnih tubula.

Međutim, to ne isključuje mogućnost aktivacije TGF-puta neovisno o Smads fosforilaciji. Potrebne su daljnje studije kako bi se istražio ovaj alternativni put.

U procjeni koštanog tkiva, preopterećenje fosfatima induciralo je apoptozu stanica sličnih osteoblastima [22]. Rojas i sur. pokazali su u biopsijama kosti transplantiranih pacijenata da je broj apoptotskih stanica veći u onih s niskim fosfatom i da bi PTH imao učinak na povećanje osteoblasta i sprječavanje apoptoze [48]. Ovaj inhibitorni učinak PTH na apoptozu koštanih stanica već je dokazan [49]. Osim učinaka na koštano tkivo, apoptotski putovi također su povezani s akutnim zatajenjem bubrega [48] i mogli bi biti mogući medijator u progresiji CKD-a. U našem smo modelu uočili superiorni udio stanica koje su podvrgnute apoptozi u LoP skupini, bez statističke važnosti. Ova razmatranja upućuju na poremećeni mehanizam apoptoze uzrokovan hiperfosfatemijom. Međutim, moramo imati na umu da nije bilo moguće procijeniti isključivi učinak fosfata nabubregapoptoza tkiva nakon što životinje također razviju povišenje PTH i FGF-23.

U trenutnoj studiji bavili smo se još jednim mogućim mehanizmom oštećenja bubrega zbog prehrane s visokim sadržajem fosfata, disfunkcijom autofagije, mjerenjem proteina beclin-1, regulatornog proteina potrebnog za nukleaciju autofagosomske membrane [50]. Autofagija je katabolički put koji uključuje razgradnju staničnih komponenti kroz lizosome [51,52]. Fosforilacija Beclin-1 smatra se signalom specifičnim za autofagiju za aktivaciju kompleksa fosfatidilinozitol-3-fosfat kinaze i regrutiranje na membranska mjesta biogeneze autofagosoma [53]. Obaranje beklina -1 potiskuje autofagiju [54], a ishemija-reperfuzija povećava njegove razine [55]. Smanjenje beklina- 1 i popratna regulacija mTOR-a smanjuju rast malignih stanica, ističući učinak autofagije na preživljavanje [52].

Antifibrotski učinci Klotha također su bili povezani s pojačanim procesom autofagije, putem kojim je ishemijska ozljeda bila oslabljena u modelu AKI i oslabljena visokim razinama fosfata [18]. Eksperimentalne studije su pokazale da autofagijski tok ublažava infiltraciju makrofaga i bubrežnu fibrozu izazvanu fosfatima. Osim toga, okolina bogata fosfatima inducira mitofagiju u tubularnim stanicama in vitro [56]. Naši su podaci pokazali da je sadržaj fosfata u prehrani također modulirao ekspresiju beklina-1 u bubrežnim tubulima in vivo. HiP dijeta također je bila povezana s većom staničnom proliferacijom i trendom prema nižoj stopi apoptoze, kao što je prikazano PCNA odnosno TUNEL analizom. Međutim, u našem modelu nije bilo moguće utvrditi je li se to dogodilo kao izravni učinak preopterećenja fosfatima ili zbog abnormalnosti u razinama PTH i FGF-23, izazvanih hiperfosfatemijom. Ovaj nalaz treba potvrditi kliničkim scenarijem.

Ključna prednost ove studije bila je procjena utjecaja restrikcije fosfata u dijeti s niskim sadržajem proteina na napredovanje CKD-a, što je uključivalo istraživanje njezina utjecaja na histološke obrasce i molekularne fenotipovebubregtkivo. Koliko znamo, ovo je prva studija koja je pokazala modulaciju ekspresije beclin-1, markera autofagije na stanicama bubrežnih tubula, fosfatnom prehranom in vivo. Glavno ograničenje bila je nemogućnost odvajanja učinka hiperfosfatemije od drugih abnormalnosti povezanih s CKD-MBD, kao što je povišenje PTH i FGF-23. Također nismo mogli procijeniti prehranu sa srednjim sadržajem fosfata ili bubrežnom Klotho ekspresijom. Međutim, naš model reproducira stanje iz stvarnog života, gdje je HiP dijeta obično povezana s hiperparatireoidizmom i visokim razinama FGF-23.

4. Zaključci

Ukratko, ova je studija pružila dokaze da prehrana s fosfatima igra ulogu u progresiji CKD, mogućem povećanju intersticijske fibroze. Nadalje, prehrana bogata fosfatima može promijenitibubregproces autofagije. Identifikacija puta neovisnog o proteinima kroz koji fosfat pogoršava bubrežnu funkciju može otvoriti važan put za razvoj novih pristupa usmjerenih na prevenciju ili smanjenje progresije CKD u kliničkom okruženju.

5. Materijali i metode

U ovu studiju uključeni su odrasli muški štakori Munich-Wistar dobiveni iz lokalne ustanove. Štakori su držani na 23 ± 1 ◦C, s vlažnošću zraka od 60 ± 5 posto, u ciklusu svjetlo-mrak od 12:12-h. Sve su životinje imale slobodan pristup vodi iz slavine i hranjene su hranom s niskim sadržajem proteina (12 posto proteina). Životinje su žrtvovane dva mjeseca kasnije kada su analizirani krv, urin i bubrežno tkivo. Tlak u manšeti repa, klirens kreatinina i dnevno izlučivanje albumina u mokraći određeni su kod svih štakora. Eksperimentalni dizajn prikazan je u Dodatku A (Slika A1).

5.1. Analitičke tehnike

Šezdeset dana nakon Nx, životinje su anestezirane natrijevim tiopentalom (50 mg/kg tjelesne težine) i sakupljeni su uzorci krvi. Koncentracija kreatinina u serumu određena je kolorimetrijskom metodom. Serumski albumin, fosfat, urea, kalcij i hematokrit izmjereni su standardnim metodama. PTH je mjeren pomoću ELISA (Immutopics, San Clemente, CA, SAD). FGF-23 je mjeren pomoću ELISA kita (KAINOS, Japan) prema protokolu proizvođača. Izračunali smo glomerularnu filtraciju prema klirensu kreatinina na temelju razine kreatinina u serumu i urinu i izraženu u ml/min, izračunatu formulom: kreatinin u mokraći (mg/dL) × kolega u mokraći (mL/min)/kreatinin u serumu (mg/dL). Albumin u mokraći određen je radijalnom imunodifuzijom.

-trećine lijevobubregzatvaranjem dvije ili tri grane lijeve bubrežne arterije. Lažno operirani štakori bili su podvrgnuti anesteziji i manipulaciji bubrežnih peteljki bez smanjenja bubrežne mase. Nakon oporavka od anestezije, životinje su vraćene u izvorne kaveze, koji su grijani tijekom sljedeća 24 sata.

Frakcijsko izlučivanje fosfata (FEP) dobiveno je iz urina i serumskog fosfata (mg/dL), urina i serumskog kreatinina (mg/dL), i izraženo u postocima, sljedećom formulom: (urin/serumski fosfat)/ (urin/serum kreatinin) × 100.

5.2. Eksperimentalne skupine

Životinje su podijeljene u dvije skupine prema sadržaju fosfata u prehrani, kako je navedeno u nastavku: Dijeta s niskim udjelom fosfata (LoP): n=20; životinje su primile TD-90016, 12-postotnu proteinsku dijetu, modificiranu za 0.2 postotnu koncentraciju fosfata. Dijeta s visokim udjelom fosfata (HiP): n=19; životinje su primile TD-90016, 12-postotnu proteinsku ishranu, modificiranu za 0.95-postotnu koncentraciju fosfata.

5.3. Histološke tehnike

Ostatakbubregperfundiran je in situ na promatranom MAP fiziološkom otopinom, a zatim Duboscq-Brasil otopinom za fiksaciju. Nakon vaganja, dva srednjekoronalna rezna bubrega su naknadno fiksirana u puferiranom 4 posto formaldehida. Bubrežno tkivo je zatim ugrađeno u parafin i pripremljeno za histomorfometriju i imunohistokemiju kao što je prethodno opisano [57].

Sve morfometrijske procjene izvedene su u presjecima debljine 4-µm od strane jednog promatrača koji nije vidio skupine. Za svakog štakora procijenjena je ozbiljnost glomeruloskleroze (GS) u presjecima obojenim periodnom kiselinom Schiff (PAS), dodjeljivanjem svakom glomerulu (pregledano je najmanje 120 po štakoru) rezultata za procjenu sklerozirane frakcije područja čuperka. i izvođenje GS indeksa (GSI) za svakog štakora kao što je prethodno opisano [58]. Kako bi se procijenio stupanj širenja intersticija, postotak kortikalnog područja bubrega zauzetog intersticijalnom fibrozom (postotak IF) procijenjen je u rezovima obojenim po Massonu tehnikom brojanja točaka [59].

5.4. Imunohistokemija

Četiri µm debele, parafinom ugrađene bubrežne sekcije postavljene su na stakalce obložene sa 6 posto silana. Sekcije su deparafinizirane, rehidrirane i zatim zagrijane u citratnom puferu kako bi se poboljšalo pronalaženje antigena. Prethodno su inkubirani s 5 posto normalnog zečjeg (za ED-1) ili konjskog (za -aktin) seruma u tris puferiranoj fiziološkoj otopini (TBS) ili otopini proteinskog bloka na bazi kazeina (proteinski blok; DAKO Corporation, Santa Clara, CA, SAD (za PCNA, pSmad i Beclin)), kako bi se spriječilo nespecifično vezanje. Inkubacija s primarnim protutijelom provedena je preko noći na 4 ◦C. Negativne kontrole su izvedene izostavljanjem primarnog antitijela.

Korištena su sljedeća primarna protutijela: monoklonsko mišje anti-štakorsko ED-1 protutijelo (Serotec, Oxford, UK), za detekciju makrofaga; mišji monoklonski anti-alfa glatki (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, SAD), za detekciju -aktina; poliklonsko anti-Beclin 1 antitijelo (Boster, Pleasanton, CA, SAD), za analizu autofagije. Nakon ispiranja, rezovi su inkubirani s biotiniliranim anti-mišjim IgG (H plus L), (Vector, Burlingame, CA, SAD) 45 minuta, nakon čega je uslijedio VECTASTAIN® ABC-AP komplet, Vector® Red (Vector, Burlingame, CA). , SAD) 30 min. Sekcije su zatim razvijene otopinom brzocrvene boje.

Za monoklonski mišji nuklearni antigen protiv proliferacije stanica (Dako, Danska) i fosfor-smad2 (Ser465/467) protutijelo (Cell Signaling, Danvers, MA, SAD), endogena inhibicija peroksidaze provedena je s 3 postotnom otopinom vodikovog peroksida i metanolom tijekom 30 min. Sekcije su zatim inkubirane preko noći s primarnim protutijelom u vlažnoj komori na 4 ◦C. Sljedeći dan rezovi su inkubirani s biotiniliranim anti-mišjim IgG (H plus L) ili biotiniliranim anti-štakorskim IgG (H plus L) (Vector, Burlingame, CA, SAD) 45 minuta, nakon čega je uslijedila inkubacija s VECTASTAIN® ABC- HRP Kit (Vector, Burlingame, CA, SAD) 30 min. Sekcije su zatim razvijene korištenjem 3-amino-9-etil karbazol supstrata kromogena (AEC) (Sigma Chemical, St. Louis, MO, SAD). Svi su rezovi isprani u destiliranoj vodi, obojeni Mayer-ovom otopinom hemaluma (Merck, Darmstadt, Njemačka) prekriveni Kaiserovom glicerin-želatinom (Merck, Darmstadt, Njemačka).

Za procjenu intersticijske bubrežne gustoće ED-1, p-Smad, Beclin i PCNA, broj pozitivnih stanica/mm2 procijenjen je na slijepi način pri povećanju od 400x. Za procjenu -aktina upotrijebili smo tehniku ​​brojanja točaka, koristeći mikroskop s 100-točkastim okularom spojenim na video monitor. Analizirali smo 25 polja pod povećanjem od 3200. Rezultati su izraženi u postocima s obzirom na ukupnu površinu.

5.5. Apoptoza

Apoptoza je određena u bubrežnim tubularnim stanicama TUNEL tehnikom (TdT posredovano X-dUTP Nick end označavanje) korištenjem uputa koje je dao Apoptag plusPeroxidase in Situ Apoptosis Detection Kit (S7101, Millipore Sigma, MA, SAD). Apoptotičke stanice analizirane su u 25 polja, s povećanjem od 1000×, da bi se dobila konačna vrijednost izražena u stanicama/mm2.

5.6. Statistička analiza

Razlike između LoP i HiP skupina testirane su neovisnim Studentovim testom ili Mann-Whitneyjevim testom. Odnosi između varijabli ispitivani su Spearmanovim koeficijentom korelacije. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SE osim ako nije drugačije naznačeno. P-vrijednost od<0.05 was="" considered="" significant.="" analyses="" were="" performed="" using="" ibm="" spss="" statistics,="" version="" 20.0.1="" (ibm="" corp.,="" armonk,="" ny,="" usa)="" and="" graphpad="" prism9.1.2="" statistical="" software="" (graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">

Financiranje:Ovu studiju poduprla je Sáo Paulo Research Foundation (FAPESP—Grant #. 2010/05409-6). Moyses, Jorgetti, Zatz i Elias podržani su od strane CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnolgico), ali ta financijska potpora nije imala nikakvu ulogu u pisanju ovog rada.

Izjava institucionalnog odbora za reviziju:Ova studija je provedena u skladu s preporukama lokalnog etičkog odbora. Protokol je odobrio Comite detica em Pesquisa do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da USP (CEUA, proces #090/10 i datum odobrenja 10. kolovoza 2010.). Svi eksperimentalni postupci slijedili su strogo međunarodne standarde za manipulaciju i brigu o laboratorijskim životinjama.

Izjava o dostupnosti podataka:Podaci prikazani u ovoj studiji dostupni su na zahtjev autora za korespondenciju.

Zahvale:Autori zahvaljuju Wagneru Dominguezu na njegovoj stručnoj tehničkoj pomoći. Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Hill, NR; Fatoba, ST; Oke, JL; Hirst, JA; O'Callaghan, CA; Lasserson, DS; Hobbs, FD Globalna prevalencija kroničnebubregbolest—sustavni pregled i meta-analiza. PLoS ONE 2016, 11, e0158765.

2. Wen, CP; Chang, CH; Tsai, MK; Lee, JH; Lu, PJ; Tsai, SP; Wen, C.; Chen, CH; Kao, CW; Tsao, CK; et al. Dijabetes s ranimbubreguključenost može skratiti životni vijek za 16 godina. Kidney Int. 2017, 92, 388–396.

3. Kakinuma, Y.; Kawamura, T.; Bills, T.; Yoshioka, T.; Ichikawa, I.; Fogo, A. Učinak inhibicije angiotenzina neovisan o krvnom tlaku na vaskularne lezije kroničnog zatajenja bubrega.BubregInt. 1992., 42, 46–55.

4. Fried, LF; Orchard, TJ; Kasiske, BL Učinak smanjenja lipida na progresiju bubrežne bolesti: meta-analiza.BubregInt. 2001., 59, 260–269.

5. Ishidoya, S.; Morrissey, J.; McCracken, R.; Reyes, A.; Klahr, S. Antagonist receptora angiotenzina II ublažava bubrežnu tubulointersticijalnu fibrozu uzrokovanu jednostranom opstrukcijom uretera.BubregInt. 1995., 47, 1285–1294.

6. Audigier, JC; Kanjanbuch, T.; Ma, LJ; Brown, NJ; Fogo, AB Regresija postojeće glomeruloskleroze inhibicijom aldosterona. J. Am. Soc. Nefrol. 2005., 16, 3306–3314.

7. Nath, KA; Kren, SM; Hostetter, TH Dijetalna restrikcija proteina kod utvrđene bubrežne ozljede u štakora. Selektivna uloga glomerularnog kapilarnog tlaka u progresivnoj glomerularnoj disfunkciji. J. Clin. Istražite. 1986, 78, 1199–1205.

8. Brenner, BM; Meyer, TW; Hostetter, TH Dijetalni unos proteina i progresivna prirodabubregbolest: uloga hemodinamski posredovane glomerularne ozljede u patogenezi progresivne glomerularne skleroze u starenju, ablaciji bubrega i intrinzičkoj bubrežnoj bolesti. N. engl. J. Med. 1982, 307, 652–659.

9. Bellizzi, V. Niskoproteinska dijeta ili prehrambena terapija u kroničnombubregbolest? Pročišćavanje krvi. 2013, 36, 41–46.

10. Kušano, K.; Segawa, H.; Ohnishi, R.; Fukushima, N.; Miyamoto, K. Uloga prehrane s malo proteina i fosfora u napredovanju kroničnebubregbolest u uremijskih štakora. J. Nutr. Sci. Vitam. 2008., 54, 237–243.

12. Neves, KR; Graciolli, FG; dos Reis, LM; Pasqualucci, CA; Moyses, RM; Jorgetti, V. Štetni učinci hiperfosfatemije na hipertrofiju miokarda, bubrežnu funkciju i kosti kod štakora sa zatajenjem bubrega.BubregInt. 2004., 66, 2237–2244. [CrossRef] [PubMed]

12. Finch, JL; Lee, DH; Liapis, H.; Ritter, C.; Zhang, S.; Suarez, E.; Ferder, L.; Slatopolsky, E. Ograničenje fosfata značajno smanjuje smrtnost u uremijskih štakora s utvrđenom vaskularnom kalcifikacijom. Kidney Int. 2013, 84, 1145–1153.

13. Cupisti, A.; Blasco, P.; D'Alessandro, C.; Giannese, D.; Sabatino, A.; Fiaccadori, E. Zaštita rezidualne bubrežne funkcije i nutricionistički tretman: strategija prvog koraka za smanjenje uremičkih toksina u bolesnika s završnom fazom bubrežne bolesti. Toksini 2021, 13, 289.

14. Yan, B.; Su, X.; Xu, B.; Qiao, X.; Wang, L. Učinak restrikcije proteina u prehrani na napredovanje kroničnebubregbolest: sustavni pregled i meta-analiza. PLoS ONE 2018, 13, e0206134. [CrossRef] [PubMed]

15. Klahr, S.; Levey, AS; Beck, GJ; Caggiula, AW; Hunsicker, L.; Kušek, JW; Striker, G. Učinci restrikcije proteina u prehrani i kontrole krvnog tlaka na progresiju kronične bubrežne bolesti. Modifikacija prehrane u studijskoj skupini bubrežnih bolesti. N. engl.

J. Med. 1994., 330, 877–884. [CrossRef]

16. Hu, MC; Shi, M.; Cho, HJ; Adams-Huet, B.; Paek, J.; Hill, K.; Shelton, J.; Amaral, AP; Faul, C.; Taniguchi, M.; et al. Klotho i fosfat su modulatori patološkog uremičkog remodeliranja srca. J. Am. Soc. Nefrol. 2015, 26, 1290–1302.

17. Hu, MC; Shi, M.; Cho, HJ; Zhang, J.; Pavlenco, A.; Liu, S.; Sidhu, S.; Huang, LJ; Moe, OW Receptor eritropoetina je nizvodni efektor Klotho-inducirane citoprotekcije. Kidney Int. 2013, 84, 468–481.

18. Shi, M.; Flores, B.; Gillings, N.; Bian, A.; Cho, HJ; Yan, S.; Liu, Y.; Levine, B.; Moe, OW; Hu, MC alphaKlotho ublažava progresiju AKI u CKD aktivacijom autofagije. J. Am. Soc. Nefrol. 2016, 27, 2331–2345.

19. Ding, Y.; Kim, S.; Lee, SY; Koo, JK; Wang, Z.; Choi, ME Autofagija regulira TGF-beta ekspresiju i potiskujebubregfibroza izazvana jednostranom opstrukcijom uretera. J. Am. Soc. Nefrol. 2014, 25, 2835–2846.

20. Moustakas, A.; Souchelnytskyi, S.; Heldin, CH Smad regulacija u transdukciji TGF-beta signala. J. Cell Sci. 2001., 114, 4359–4369.