Indukcija perifernog treniranog imuniteta u gušterači potiče antitumorsku aktivnost za kontrolu napredovanja raka gušterače 2. dio

Rasprava

Dok je promet -glukana ranije karakteriziran, specifični tropizam -glukana na gušteraču nije prethodno prijavljen37. Pokazujemo da čestični -glukan može prometovati izravno u gušteraču i da ga također mogu fagocitirati makrofagi koji zatim prometuju u gušteraču. Odnos između peritonealne šupljine i gušterače nije dobro definiran, a studije koje se odnose na patofiziologiju akutnog pankreatitisa (AP) utvrdile su da peritonealni makrofagi glavni doprinose upalnom odgovoru u AP, podupirući tako vezu između peritoneuma i gušterača 38.

Naši slikovni podaci doista pokazuju da peritonealni makrofagi koji fagocitiraju izotopom obilježeni WGP prvenstveno prometuju u gušteraču. Studije o oštećenju jetre dodatno su podržale ovaj model dinamičke izmjene stanica između peritonealne šupljine i solidnih organa koja je neovisna o cirkulaciji 39. Sve zajedno sugerira da čak i u homeostatskim uvjetima postoji bazalna razina razmjene imunoloških stanica između gušterače i peritonealnu šupljinu koja se može iskoristiti u okruženju čestica -glukana.

Makrofagi su važan dio urođenog imunološkog sustava ljudskog tijela i imaju moćne funkcije identificiranja, fagocitiranja i uklanjanja bakterija i stranih tvari. Parodontitis, kronična zarazna bolest koju karakterizira upala gingive i gubitak alveolarne kosti, vodeći je uzrok gubitka zuba u odraslih osoba. Sada je jasno da je destrukcija tkiva parodontitisa uzrokovana imunološkim odgovorom domaćina na infekciju, a makrofagi, kao važan dio imunološkog odgovora domaćina, igraju važnu ulogu u nastanku i razvoju upale.

Stoga moramo poboljšati imunitet u svakodnevnom životu. U našem istraživanju otkrili smo da Cistanche može ojačati imunitet. Dodavanje Cistanche u kipuću vodu za pripremu čaja Cistanche i pijenje 1-2 puta dnevno može poboljšati imunološku funkciju tijela jer sadrži aktivne sastojke, poput polisaharida, flavonoida, alkaloida itd., koji mogu poboljšati imunološka funkcija tijela. U isto vrijeme, dodavanje Cistanche u juhu ili kašu, jednom ili dva puta tjedno može ojačati imunitet.

Kliknite da biste saznali čisti cistanche proizvod

Iako je ova studija istraživala čestični -glukan WGP, također bi moglo biti zanimljivo istražiti pokazuje li topljivi -glukan dobiven iz kvasca sličan tropizam i signalni mehanizam unutar gušterače. Poznato je da čestični -glukani signaliziraju izravno kroz dektin-1, dok se za topive -glukane smatra da funkcioniraju kroz CR3-ovisan put kako bi ispoljili svoja antitumorska svojstva40,41. Jedno je istraživanje pokazalo da je IP primjena topljivog -glukana rezultirala prometom u perifernu krv i APC-ove u peritoneumu, slezeni i koštanoj srži, što ukazuje da je unatoč različitim molekularnim signalnim mehanizmima moguća slična sposobnost aktiviranja treniranog imuniteta42. Međutim, s obzirom na to da naši podaci pokazuju da ovaj promet ovisi o dektinu-1, samo čestični -glukan može prikazati izravan promet u gušteraču putem čestica i topivih koji mogu pokrenuti mehanizme treniranog imuniteta.

Nadalje, prethodne studije koje karakteriziraju promet intravenozno ubrizganog topljivog -glukana pokazuju promet u slezenu, bubreg i jetru, iako ne spominju tropizam prema gušterači43. Budući da se dosad nije smatralo da je gušterača meta trgovine -glukanom, nije jasno je li gušterača jednostavno nikad proučavana ili se trgovina gušteračom ne događa.

Buduće studije trebale bi se pozabaviti biodistribucijom i topljivog i čestičnog -glukana kroz različite načine davanja.

- Trgovina glukanom u gušteraču ima multifaktorski utjecaj na imunološke populacije prisutne u gušterači. Prvo, dolazak glukana u gušteraču izravno utječe na populacije imunosupresivnih M2 rezidentnih makrofaga prisutnih unutar gušterače za koje se zna da su važni u promicanju tumora gušterače. CyTOF i scRNA-Seq podaci pokazali su gotovo potpuni nestanak rezidentne populacije makrofaga 7 dana nakon primjene WGP-a. Zanimljivo je da se nestanak rezidentne populacije makrofaga izravno podudara s recipročnom pojavom populacije makrofaga Ly6Clo. Ova populacija makrofaga Ly6Clo nosi slične fenotipske markere kao i rezidentna populacija, iako više naginje prema fenotipu M1.

Stoga je vjerojatno da rezidentni makrofagi dolaze u kontakt s -glukanom koji je dospio u gušteraču i te se stanice repolariziraju, stoga preuzimaju drugačiji stanični fenotip što rezultira stvaranjem jedinstvenog klastera. Drugo, dolazak -glukana u gušteraču rezultira pojačanom signalizacijom kemokina/kemokinskog receptora koji regrutira proupalne Ly6CHi infiltrirajuće makrofage izvedene iz monocita od periferije do gušterače. Dvadeset i četiri sata nakon primjene WGP-a, utvrđeno je da su razine CCL2 u cijelim lizatima gušterače povećane 30-puta. Sukladno tome, pokazujemo da robustan stanični priljev ovisan o -glukanu u gušteraču ovisi o CCR2.

Dok se usredotočujemo na dinamiku mijeloidnog odjeljka zbog uočene važnosti CCR2/CCL2 signalizacije, došlo je do zanimljivog početnog poboljšanja klastera 11 3. dana, a zatim nestanka do 7. dana nakon WGP tretmana. Skupina 11 okarakterizirana je kao ILC2 na temelju ekspresije nekoliko markera kao što su KLRG1, IL-5, IL-13 i ICOS. Poznato je da su ILC2 stanice koje dugotrajno žive u tkivima44. Nedavne studije su pokazale da aktivacija lokalnih ILC2 alarmina specifičnih za tkivo izaziva njihovu proliferaciju, migraciju limfnih čvorova i diseminaciju krvlju. Pokazalo se da ILC2 iz nekoliko tkiva, kao što su crijeva i pluća, ulaze u krv ekstruzijom iz ovih poremećenih tkiva i migriraju u druga tkiva kao što je jetra44-46.

Takav mehanizam mogao bi objasniti početno povećanje, a zatim nestanak ILC2 u gušterači. S obzirom na to da su ILC2 nedavno uključeni u odgovor tumora gušterače na imunoterapiju47, opravdano je više istraživanja koja istražuju utjecaj WGP-a i iniciranje treniranog imuniteta na ILC2 populaciju gušterače.

Iako je iniciranje priljeva proupalnih imunoloških stanica u gušteraču samo po sebi važno, upravo CCR2 plus Ly6CHi koji se infiltriraju u populacije makrofaga porijeklom iz monocita s periferije pokazuju značajke istrenirane imunosti koja nosi najvažnije implikacije kao indukciju periferni trenirani imunitet u gušterači još nije karakteriziran. Ovaj inducirani istrenirani imunitet također je povezan s metaboličkim i epigenetskim reprogramiranjem.

Dok je poznato da je CCR2 važan receptor u regrutiranju monocita, ovo je također prva indikacija da je CCR2 signaliziranje na monocitima potrebno za uspostavu periferno obučenog imuniteta. Primijećeno je da su CCR2 plus monociti/makrofagi povezani s metastazama i progresijom tumora48,49. Međutim, naši podaci sugeriraju da regrutiranje reprogramiranog, obučenog CCR2 plus monociti/makrofagi imaju snažne antitumorske učinke.

Ovo je izravno demonstrirano našim eksperimentom s mješavinom gdje su miševi koji su primili CCR2 plus mijeloidne stanice od WGP-treniranih miševa pokazali značajno smanjeno opterećenje tumorom u usporedbi s miševima koji su primili CCR2- mijeloidne stanice od istog treniranog miša.

Kako pokazujemo da je u gušterači uspostavljen periferni trenirani imunitet, pitamo se mogu li te stanice ponovno aktivirati tumorske stanice ili njihovi izlučeni faktori. Pokazalo se da ponovno izlaganje mijeloidnih stanica gušterače treniranih in vivo WGP-om tumorom kondicioniranom mediju snažno izaziva trenirani odgovor. Kalafati i sur. nedavno su pokazali ulogu granulocita u uvježbanim antitumorskim mehanizmima vođenim imunološkim sustavom21, međutim, s obzirom na njihovu upotrebu u potkožnim modelima raka, studija o kojoj se trenutačno izvještava prvi je slučaj koji sugerira da se mijeloidne stanice u određenom organu mogu uvježbati da izravno reagiraju na tumorske stanice tog istog organa.

Dobro je utvrđeno da su mijeloidne stanice sposobne izravno ubijati tumorske stanice kroz mehanizme fagocitoze i proizvodnje ROS-a50-54, a ovdje pokazujemo da trening WGP-a značajno regulira izravne antitumorske funkcionalnosti pojačane fagocitoze tumorskih stanica i citotoksičnosti posredovane ROS-om na tumorske stanice.

Nadalje, dok naglašavamo da medij uvjetovan tumorom može reaktivirati trenirane mijeloične stanice, također identificiramo specifični faktor, MIF, u mediju uvjetovanom tumorom koji je uključen u ovu aktivaciju. Ovi podaci sugeriraju da bi indukcija treniranog imuniteta mogla sudjelovati u mehanizmima imunološkog nadzora tumora. Na primjer, u ranim fazama razvoja tumora, tumori izlučuju topive čimbenike koji mogu ponovno stimulirati istrenirane urođene stanice što dovodi do iskorjenjivanja tih tumorskih stanica.

Zatim prevodimo ovo razumijevanje antitumorskog potencijala uvježbanih urođenih mijeloidnih stanica koje ulaze u gušteraču na ortotopske modele PDAC-a, gdje opažamo dramatično smanjenje opterećenja tumorom i povećanje preživljavanja miševa kojima je dat samo jedan lijek WGP. Nadalje pokazujemo da su stanice odgovorne za kontrolu tumora uglavnom trenirane CCR2 plus stanice izvedene iz mijeloida. Za razliku od drugih predloženih modela kontrole tumora za koje se čini da su u potpunosti vođeni indukcijom centralno treniranog imuniteta u BM21, umjesto toga, u ovom modelu rani promet WGP-a u gušteraču i rezultirajuća proizvodnja CCL2 u obučenim regrutima gušterače CCR2 plus mijeloidne stanice s periferije koje su uglavnom odgovorne za antitumorske učinke. Izravan promet WGP-a u gušteraču također repolarizira makrofage slične M2-rezidentnom tkivu prema makrofagima sličnim M1- koji također mogu obuzdati napredovanje tumora.

Dok je smanjenje tumora primijećeno kod miševa kojima su implantirani KPC tumori koji su pomiješani s CCR2 plus istreniranim stanicama bilo značajno, nije bilo tako zapanjujuće kao kod miševa kojima je dat IP WGP. Ovo potvrđuje da su antitumorski učinci IP WGP dvostruki; regrutiranje CCR2 plus istreniranih antitumorskih mijeloidnih stanica u gušteraču i repolarizacija pro-tumorogenih rezidentnih makrofaga rade usklađeno kako bi izazvali antitumorske urođene odgovore koji dovode do smanjenog opterećenja tumorom u modelima PDAC.

Također primjećujemo visoku ekspresiju MHCII na tim treniranim monocitima/makrofagima, koji vjerojatno igraju ulogu u obradi tumorskog antigena i komunikaciji s T-stanicama kako bi se izazvali adaptivni imunološki odgovori protiv tumora. Zanimljivo, iako smo potvrdili da ovi antitumorski mehanizmi ne ovise o adaptivnim imunološkim odgovorima, uočili smo značajno povećanje CD8 plus T-stanica prisutnih unutar CCR2 plus pomiješanih tumora. Dodatno, s obzirom na to da je uočeno da mijeloične stanice u tumorima pokazuju visoke razine PD-L1 i da se čini da prisutnost istreniranih CCR2 plus stanica u gušterači regrutira CD8 plus T-stanice, zaključili smo da WGP može pojačati učinke -PD-L1 terapija.

Prema literaturi, sama terapija anti-PD-L1 mAb nije imala koristi u preživljavanju, dok je kombinacija WGP-a i anti-PD-L1 sinergizirala da bi proizvela bolje ishode preživljavanja od samog WGP-a55. Ovo sugerira da uvježbane urođene imunološke stanice mogu aktivirati adaptivne imunološke stanice u TME, međutim, imunosupresivno mikrookruženje vjerojatno treba dodatno nadvladati popratnim učincima anti-PD-L1. Važno je napomenuti da su unatoč poboljšanom preživljavanju svi miševi na kraju podlegli tumoru, tako da su buduća istraživanja optimizacije ovog tretmana u smislu doziranja i broja tretmana opravdana.

Imunosupresivne mijeloične stanice igraju ključnu ulogu u stvaranju imunosupresivnog TME u PDAC. Ovdje demonstriramo sposobnost uključivanja ovih mijeloidnih stanica u okruženje PDAC-a kroz indukciju uvježbanog urođenog imuniteta u gušterači.

Važno je da također pokazujemo da sposobnost pokretanja treniranog imuniteta u gušterači potencira terapeutske učinke imunoterapije kao što je terapija blokade imunološke kontrolne točke protiv PD-L1. Dajući dodatnu kliničku primjenjivost ovim nalazima, također pokazujemo da indukcija treniranog imuniteta u adjuvantnom okruženju može smanjiti veličinu tumora i produljiti preživljenje. Ovi nalazi naglašavaju potencijal korištenja -glukana za terapeutsko ciljanje mijeloidnih stanica unutar TME-a i ističu da bi indukcija periferno treniranog imuniteta u gušterači mogla igrati posljedičnu ulogu u reprogramiranju supresivnog TME-a PDAC-a što bi moglo rezultirati produljenjem života pacijenata dijagnosticiran ovaj smrtonosni zloćudni tumor.

Metode

Etička izjava.

Svi pokusi koji su uključivali životinje provedeni su u skladu s etičkim smjernicama koje je postavio Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja Sveučilišta u Louisvilleu. Eksperimenti su provedeni prema odobrenim protokolima 19471 i 19536.

Miševi.

U svim eksperimentima korišteni su mužjaci i ženke miševa stari šest do osam tjedana. Divlji tip (WT) C57BL/6 J miševi kupljeni su od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, SAD) ili uzgojeni u životinjskom pogonu za specifične patogene (SPF) Sveučilišta u Louisvilleu. C57BL/6 Dectin-1 nokautirani miševi (Dectin-1−/−) opisani su ranije56. CCR2 globalno nokautirani miševi kupljeni su od Jackson Laboratoryja. Albino C57BL/6 miševe ljubazno je ustupio dr. Jonathan Warawa sa Sveučilišta Louisville. NOD/SCID/IL2r Null (NSG) miševi kupljeni su od Jackson Laboratoryja. Maksimalna veličina tumora koju je dopuštao IUCAC nije bila veća od 2000 mm3. Miševi su svakodnevno praćeni na rast tumora i eutanazirani kada je opterećenje tumorom premašilo ograničenu veličinu. Miševi su držani u ciklusu 12-h tamno/svjetlo na sobnoj temperaturi s kontroliranom vlagom (oko 55 posto).

Sve su životinje bile smještene u barijeru, a za pokuse su korišteni samo zdravi miševi. Svi su miševi bili stariji od najmanje 6 tjedana, a svi pokusi koji su uključivali životinje obavljeni su u skladu sa svim relevantnim zakonima i institucionalnim smjernicama koje je dao Pogon za uzgoj glodavaca (RRF) i odobrio Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja (IACUC) Sveučilišta u Louisvilleu.

Priprema -glukana.

Visoko pročišćeni čestični -glukan u obliku čestičnih cijelih -glukanskih čestica (WGP) izoliranih iz Saccharomyces cerevisiae osigurala je Biothera. Prije upotrebe, WGP je nježno sonikiran 15 s, dva puta korištenjem sonikatora Qsonica Q55-110 Q55 (Cole-Parmer) kako bi se osiguralo da su agregati razbijeni.

Priprema i korištenje DTAF-WGP.

DTAF (Sigma-Aldrich) u koncentraciji od 2 mg/mL pomiješan je sa suspenzijom od 20 mg/mL WGP u boratnom puferu (pH 10,8). Ovo je inkubirano na sobnoj temperaturi 8 h uz kontinuirano miješanje. Nakon inkubacije, WGP je centrifugiran i ispran hladnim sterilnim DPBS-om bez endotoksina (Sigma-Aldrich) pet puta ili dok supernatant više nije sadržavao vidljivi DTAF. Koncentracija je podešena na 10 mg/mL u DPBS-u bez endotoksina za skladištenje. Otprilike 1 mg DTAF-WGP-a ubrizgalo je IP u C57BL/6 i Dectin-1−/− miševe i organe sakupljene 3 dana kasnije.

Priprema 89Zr-WGP.

WGP (100 mg) je pomiješan s DeferoxamineSCN (2,7 mg, u 0,8 ml DMSO) i suspendiran u 10 ml natrijevog karbonatnog pufera (0,1 M, pH 9,4) preko noći na sobnoj temperaturi u mraku uz lagano mućkanje. Deferoksaminom obilježeni WGP je zatim ispran DI vodom (10 × 40 mL), a 30 mg deferoksaminom obilježenog WGP pomiješano je s 3 mCi 89Zr oksalata u 2 ml Tris•HCl pufera (0,5 M, pH 7,5) i zatim se inkubira na 37 oC 60 minuta uz mućkanje. 89Zr-WGP je zatim centrifugiran i ispran s 3 ml sterilnog PBS-a. Radioaktivnost 89Zr-WGP izmjerena je kalibratorom doze i korištena za in vitro i in vivo studije.

Biodistribucija i PET/CT skeniranje pomoću 89Zr-WGP.

Snimanje pozitronskom emisijskom tomografijom (PET)/kompjutoriziranom tomografijom (CT) provedeno je u C57BL/6 i Dectin-1−/− miševima 48 sati nakon IP injekcije 1 mg čistog 89Zr-WGP ili injekcije 1 × 106 peritonealne makrofage koji su bili kokultivirani s 25 ug/ml 89Zr-WGP 2 h i zatim nježno isprani da se ukloni višak 89Zr-WGP. Miševi su skenirani 15 minuta Siemens R4 MicroPET-om, nakon čega je uslijedilo 10 minuta CT skeniranja. Za akviziciju i rekonstrukciju PET signala korišten je Siemens IAW softver, a za spajanje i analizu slikovnih podataka korišten je Siemens IRW softver.

Na kraju slikovne studije, miševi su eutanazirani, a organi od interesa su sakupljeni. Za biodistribuciju, 50 uL periferne krvi sakupljeno je tehnikom retro-bulbarnog krvarenja. Mozak, srce, pluća, jetra, slezena, bubrezi, gušterača, debelo crijevo, tanko crijevo, želudac, bedrena kost, komad kože s boka miša i rektus femoris mišić su sakupljeni, izvagani i stavljeni u 2470 Wizard automatski gama brojač (PerkinElmer) za mjerenje radioaktivnosti svakog tkiva. Vrijednosti CPM izračunate su korištenjem Prism softvera (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Obrada gušterače.

Nakon eutanazije, gušterača miša je sakupljena i sterilnim škarama nježno izrezana na manje komade. Suspendirani su u epruveti od 15 mL u potpunom mediju (RPMI) s 1X puferom za probavu koji se sastoji od 300 U/ml kolagenaze I, 60 U/ml hijaluronidaze i 80 U/ml DNaze (Sigma). Oni su stavljeni u rotirajući inkubator na 37 stupnjeva s 5 posto CO2 na 15-20 minuta. Digestivni pufer je zatim ugašen s ledeno hladnim kompletnim RPMI 1640 i ispran. Stanice su propuštene kroz sterilni najlonski košarasti filtar od 40 µm, a mali neprobavljeni komadići tkiva razbijeni su sterilnim čepom štrcaljke kako bi se dobila jednostanična suspenzija. Ako je uočeno da u uzorku postoji znatan broj crvenih krvnih stanica (eritrocita), liza crvenih krvnih zrnaca izvršena je dodavanjem 2 mL sterilnog 10x ACK (Thermo Fisher Scientific).

In vivo WGP primjena.

Miševima je dana jedna intraperitonealna doza od 1 mg nježno sonicirano WGP-a, polistirenskih kuglica od 3 μm (Sigma-Aldrich) ili fluorescentnih mikrosfera od 3 μm (Polysciences) (sve 1 mg u 200 ul sterilni PBS) ili 200 ul sterilnog PBS-a na dan 0. Za tipično trenirane studije imuniteta, 7 dana nakon početne IP doze, miševi su eutanazirani pomoću CO2, a gušterača zajedno s drugim tkivima od interesa je uklonjena i obrađena. Za studije titracije doze, 0,5, 1 i 2 mg WGP-a isporučeno je IP u 200 uL sterilnog PBS-a. Za studije vremenske titracije, miševima je ubrizgan 1 mg WGP, a gušterača je sakupljena nakon 24 h, 48 h, 3, 7, 10, 16 i 30 dana kasnije.

Ex vivo restimulacija.

Za procjenu treniranog fenotipa mononuklearnih stanica u miševa tretiranih s WGP ili PBS ex vivo, nakon obrade gušterače, suspenzije stanica gušterače su stavljene na ploče s 24 jažice i stimulirane s LPS (10 ng/ml), supernatantom iz kulture KPC i Pan02 stanica (40 posto), i rekombinantni MIF (rMIF) (10 ng/ml). MIF je bio velikodušan dar dr. Roberta Mitchella sa Sveučilišta u Louisvilleu i bio je ekspresiran, pročišćen i presavijen prokariotskim saveznikom kao što je prethodno opisano57. Stanice su uzgajane u DMEM i inkubirane na 37 stupnjeva s 5 posto CO2 tijekom 5-6 sati u prisutnosti 1X brefeldina A (BioLegend). Stanice su zatim sakupljene pomoću strugala za stanice, isprane, peletirane i zatim obojene za unutarstaničnu ekspresiju citokina.

In vitro trening i test restimulacije.

Peritonealni makrofagi ili sortirane CD11b plus stanice iz mišje gušterače postavljene su na 24-ploču s jažicama 2 sata na 37 stupnjeva i 5 posto CO2 kako bi se omogućilo pričvršćivanje stanica na ploče, nakon čega su plutajuće stanice nježno postavljene aspirirani. Pričvršćene stanice su nježno isprane sterilnim PBS-om i zatim resuspendirane u 1 mL DMEM-a sastavljenog od 10 posto FBS-a i 1 posto penicilina/streptomicina.

Za početno treniranje stanica, 25 ug/ml čestica WGP-a, 25 ug/ml polistirenskih mikročestica od 3 µm (Sigma-Aldrich) ili 100 uL PBS-a dodano je u odgovarajuću jažicu i inkubirano 24 sata. Nakon 24 sata, jažice su nježno isprane kako bi se uklonio početni stimulans i dodan je svježi DMEM, a stanice su inkubirane s 5 posto CO2 na 37 stupnjeva tijekom 7 dana. Nakon 7 dana, medij je aspiriran i zamijenjen svježim medijem, a stanice su ponovno stimulirane s LPS (100 ng/mL), supernatantom KPC ili Pan02 stanica (40 posto), ili PBS kao kontrolom. Dvadeset i četiri sata nakon stimulacije, supernatanti su sakupljeni i korišteni u ELISA testu za TNF- i IL-6.

Medij uvjetovan tumorom.

Otprilike 1 × 106 KPC ili Pan02 stanica uzgojeno je u ploči sa šest jažica u 4 mL potpunog DMEM na 37 stupnjeva i 5 posto CO2. Nakon 3 dana supernatanti su sakupljeni i pohranjeni na -80 stupnjeva u alikvotima za upotrebu kao medij kondicioniran tumorom. Kao kontrola, gušterača miša C57BL/6 obrađena je u suspenziju jedne stanice i 1 × 106 tih stanica uzgojeno je u ploči sa šest jažica u 4 mL potpunog DMEM-a i na 37 stupnjeva i 5 posto CO2, i supernatanti su također sakupljeni nakon 3 dana. Kao kontrola, gušterača naivnih miševa prerađena je u jednostaničnu suspenziju i postavljena na ploču sa šest jažica na 1 dan. Neprilijepljene stanice su isprane i te su stanice zatim uzgajane 3 dana i supernatant je sakupljen.

Stjecanje peritonealnih makrofaga.

Miševi su eutanazirani i 5 mL sterilnog RPMI ubrizgano je u peritoneum pomoću 25-mjerne štrcaljke. Trbuh je masiran kako bi se oslobodili peritonealni makrofagi. Napravljen je mali rez i korištena je prijenosna pipeta za uklanjanje suspenzije. Peritonealna šupljina je zatim isprana nekoliko puta s hladnim RPMI i stanice su peletirane na 458 × g.

Protočna citometrija.

Suspenzije pojedinačnih stanica u PBS-u s 1 posto FBS-a blokirane su mišjim Fc blokom (anti-CD16/CD32) na 4 stupnja tijekom 15 minuta. Protutijela obilježena fluorokromom za održivost (APC/Cy7) i površinske markere CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, Ly6C, MHCII, CD3, CD4, CD8, NK1.1, Ki67 (Biolegend) i CCR2 (R&D Systems) su koristi se. Informacije koje se odnose na sve protoke Abs sažete su u Dodatnoj tablici 3. Nakon 30 minuta inkubacije u mraku na 4 stupnja, stanice su isprane hladnim PBS-om i filtrirane kroz filter od 40 µm mesh. Uzorci su prikupljeni pomoću citometra FACSCanto II (BD Biosciences) i analizirani pomoću softvera FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). FACSDiva verzija 6 softvera korištena je u FACSCanto za prikupljanje svih podataka.

intracelularno bojenje za ekspresiju citokina.

Nakon stimulacije, stanice su obojene na željene površinske markere kako je gore opisano. Stanice su zatim isprane hladnim PBS-om, a 500 ul pufera za fiksiranje (Biolegend) dodano je u epruvete, kratko promiješane i inkubirane u mraku na sobnoj temperaturi 20 minuta. Zatim je dodan oko 1 ml pufera za permeabilizaciju (Biolegend) i uzorci su centrifugirani na 458 × g tijekom 5 minuta na 4 stupnja nakon čega je uslijedilo još jedno ispiranje pomoću 1 ml pufera za permeabilizaciju. Stanice su resuspendirane u 200 ul pufera za permeabilizaciju i stanice su obojene antitijelima protiv TNF-, Ki67, Granzyme-B, IL12, IL-6 i IFN ili odgovarajuće kontrole izotipa preko noći na 4 stupnja. Stanice su zatim isprane, filtrirane, a podaci su prikupljeni pomoću protočnog citometra.

FACS izolacija CD11b plus makrofaga za in vitro trening.

Gušterača je prerađena u jednostaničnu suspenziju kao što je gore opisano. Stanice su isprane s 1 mL PBS-a i inkubirane s Fc blokom 10 minuta na 4 stupnja nakon čega je uslijedilo bojenje bojom za vitalnost (APC-Cy7), CD45 (PerCPcy5) i CD11b plus (APC) 30 minuta na 4 stupnja. Stanice su isprane s PBS-om i resuspendirane u hladnom MACS puferu za rad (Miltenyi Biotech). Stanice ViabilityCD45 plus CD11b plus sortirane su korištenjem FACS Aria III (BD Biosciences). Stanice su sakupljene u 50 posto FBS, 40 posto PBS i 10 posto HEPES (Corning). Nakon razvrstavanja stanice su isprane s PBS-om i zatim postavljene na ploče za in vitro trening, kao što je gore opisano.

ELISA.

Supernatanti iz in vitro treniranih stanica zajedno sa standardima analizirani su korištenjem mišjih TNF- i IL-6 ELISA kompleta (BioLegend). Test je izveden prema uputama proizvođača i svi uvjeti su izvedeni u triplikatu. ELISA kit za rMIF (R i D sustavi) također je korišten u skladu s uputama proizvođača za kvantificiranje rMIF u Pan02 i KPC tumor-kondicioniranom mediju i supernatantu iz kultiviranih netretiranih stanica gušterače. Za kvantificiranje modifikacija histona, ELISA setovi (komplet za kvantificiranje tri-metil histona H3K4, komplet za kvantificiranje acetil-histona H3K27, komplet za kvantificiranje tri-metil histona H3K27 i komplet za kvantificiranje ukupnog histona H3) kupljeni su od EpiGenteka, a testovi su izvedeni na temelju proizvođačevih upute. Laktat je mjeren L-Lactate testom Kit I (Eton Bioscience).

Western blot analiza.

CD11b plus stanice iz miševa kojima je ubrizgan PBS ili WGP (24 h) odvojene su upotrebom mikrozrna CD11b (Miltenyi Biotech). Histon je ekstrahiran prema uputama proizvođača (Active Motif, Inc.), a koncentracija proteina određena je pomoću Bradfordove kvantifikacije. Histonski proteini su odvojeni pomoću SDS-PAGE 15 posto Tris-HCl gelova i preneseni na PVDF membrane (Millipore). Membrana je blokirana s 5 posto BSA na sobnoj temperaturi 1 sat i inkubirana preko noći na 4 stupnja s primarnim antitijelima uključujući tri-metil-histonsko H3 (lys4) zečje mAb, acetil-histonsko H3 (lys27) XP zečje mAb, tri-metil -histonsko H3 (Lys27) zečje mAb i histonsko H3 XP zečje mAb (tehnologija stanične signalizacije), zatim inkubirano s HRP-konjugiranim sekundarnim protutijelima (GE Healthcare) na sobnoj temperaturi tijekom 1 h. Membrana je razvijena s Amersham ECL Prime Western Blotting Detection reagensom (GE Healthcare) i detektirana pomoću Medical Film Processor (Konica Minolta Medical & Graphic). Precision Plus Protein Kaleidoscope prethodno obojeni proteinski standardi korišteni su kao standardni proteinski marker (Bio-Rad).

qRT-PCR.

Nakon što su CD11b plus stanice izolirane iz mišjeg pankreasa kod WGP-tretiranih i netretiranih miševa, stanice su spremljene u TRIzolu. RNA su izolirane i obrnuto transkribirane korištenjem TaqMan Reverse Transcription Reagents (qRTPCR) pojačanja korištenjem Bio-Rad MyiQ jednobojnog RT-PCR detekcijskog sustava. Ukratko, cDNA je umnožena u reakcijskoj smjesi od 25 uL koja se sastoji od SYBR Green PCR super-mješavine (Bio-Rad), 100 ng komplementarne DNA šablone i odabranih početnica (200 nM) korištenjem preporučenih uvjeta ciklusa.

H plus E.

Sedam dana nakon injekcije s PBS/zrncima mikročestica ili WGP, gušterača je sakupljena i fiksirana u 4 posto formalina tijekom 1 tjedna, nakon čega je uslijedilo umetanje u parafin prema standardnim postupcima. Tkiva uklopljena u parafin izrezana su na dijelove debljine 5 mm i obojena hematoksilinom i eozinom (H & E) za morfološku analizu.

Mjerenje amilaze u serumu.

Amilaza mišjeg seruma je mjerena korištenjem Amylase Activity Assay Kit (Millipore Sigma) i korištena je prema uputama proizvođača. Ukratko, miševima je ubrizgan WGP i 7 dana kasnije, krv je sakupljena od miševa tehnikom retro-bulbarnog krvarenja. Ovi uzorci korišteni su za analizu serumske amilaze.

Deplecija T-stanica in vivo.

T-stanice su iscrpljene upotrebom samog anti-CD4 mAb, samog anti-CD8 mAb ili zajedno anti-CD4 i anti-CD8 mAb. Antitijela su napravljena u kući. U ovoj proceduri iscrpljivanja, miševima je ubrizgan IP s WGP na dan 1 i također im je ubrizgano IP sa 200 µg mAbs na dan 1 i dan 4 tijekom perioda liječenja. Miševi su eutanazirani 7. dana (CD4 klon GK1.5, CD8 klon 53-6.72). Učinkovitost iscrpljivanja potvrđena je 7. dana.

Deplecija NK stanica in vivo.

NK stanice su iscrpljene intraperitonealnom injekcijom 100 µg PK136 mAb (Proizvedeno u laboratoriju dr. Jun Yana na Sveučilištu Louisville) na dan -1 i 5 tijekom perioda liječenja. WGP je ubrizgan 0. dana, a 7. dana životinje su eutanazirane, a učinkovitost deplecije NK stanica procijenjena je bojenjem tkiva gušterače na NK1.1.

Ly6G osiromašenje.

Neutrofili su smanjeni ubrizgavanjem 300 µg anti-Ly6G mAb (Bio X Cell) ili izotipskog kontrolnog štakorskog IgG2a (Bio X Cell) u danima -1, 2 i 6 tijekom liječenja. Oko 1 mg WGP-a ubrizgano je IP prvog dana. Miševi su eutanazirani 7. dana, a gušterača je procijenjena na učinkovitost iscrpljivanja. U tumoru, modelnim miševima ubrizgano je 300 µg anti-Ly6G mAb ili izotipskog kontrolnog IgG2a štakora na dane -2, 4, 10 i 16. Miševima je dan WGP na dan 0 i implantirani su s ortotopnim KPC tumorima gušterače na dan 7. Miševi su eutanazirani 21. dana, a tkiva gušterače su obojena s Ly6G kako bi se procijenila učinkovitost deplecije granulocita u to vrijeme.

CyTOF priprema uzorka za citometriju mase.

Protutijela za masovnu citometriju kupljena su od Fluidigma ili su stvorena u tvrtki konjugiranjem komercijalno dostupnih pročišćenih protutijela s odgovarajućim metalnim izotopom pomoću MaxPar X8 Polymer ili MCP9 Polymer kitova (Fluidigm). Uzorci gušterače iz tri PBS i tri 7--dnevna WGP miša prerađeni su u jednostaničnu otopinu i izvedena je ex vivo stimulacija kako je gore opisano. Stanice su nježno sastrugane s ploča sterilnim strugačem za stanice, isprane PBS-om i stavljene u sterilnu epruvetu s kulturom. Korišteno je oko 2 × 106 stanica po uzorku. Stanice su prvo obojene na vitalnost s 5 uM cisplatinom (Fluidigm) u RPMI 1640 bez seruma tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Stanice su zatim isprane s RPMI 1640 koji sadrži 10 posto FBS-a tijekom 5 minuta pri 300 x g. Stanice su obojene površinskim protutijelima 30 minuta na sobnoj temperaturi i dva puta isprane puferom za bojenje stanica Maxpar (Fluidigm).

Za bojenje na intracelularne citokine, stanice su zatim fiksirane s 1 mL 1X Maxpar Fix I pufera 30 minuta na sobnoj temperaturi i zatim isprane dva puta s 2 mL 1X Maxpar Perm-S pufera 5 minuta pri 800 × g. Zatim je dodan koktel citoplazmatskih/izlučenih protutijela i inkubiran sa stanicama 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, stanice su isprane s 1 mL 1X Maxpar Perm-S pufera 5 minuta pri 800 × g i nježno upijene kako bi se uklonila sva tekućina iz epruvete.

Za bojenje na nuklearne antigene, stanice su zatim suspendirane u 1 mL 1X Maxpar pufera za bojenje nuklearnog antigena 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je dodan koktel protutijela nuklearnog antigena i inkubiran 30 minuta na sobnoj temperaturi. Stanice su isprane dva puta po 5 minuta pri 800 x g s 2 mL pufera za propusnost bojenja nuklearnog antigena. Na kraju, stanice su fiksirane s 1,6 posto formaldehida 10 minuta na sobnoj temperaturi, zatim inkubirane preko noći u 125 nM IntercalatorIridium (Fluidigm) na 4 stupnja.

CyTOF prikupljanje podataka.

Nakon što su stanice bile spremne za prikupljanje, uzorci su dvaput isprani puferom za bojenje stanica (Fluidigm) i držani na ledu dok se čekalo na prikupljanje. Neposredno prije prikupljanja, stanice su suspendirane u 1:9 otopini Cell Acquisition Solution: EQ 4 element kalibracijske kuglice (Fluidigm). Korišten je Helios CyTOF sustav, a nakon pravilnog pokretanja i postupaka podešavanja, uzorci su pokretani brzinom manjom od ili jednakom 500 događaja/sekundi do 300000 događaja. Pomoću softvera CyTOF, FCS datoteke su normalizirane. FCS datoteke i te datoteke su zatim spremne za analizu podataka.

CyTOF analiza podataka.

CyTOF podaci analizirani su pomoću FlowJo, softverskog paketa CytoBank58 i CyTOF radnog tijeka59 koji uključuje skup paketa dostupnih u R (r-project. org)60-63. Za analizu provedenu unutar tijeka rada CyTOF korištene su FlowJo datoteke radnog prostora eksportirane iz Flow Workspacea i CytoML-a61.

Sekvenciranje RNA: ekstrakcija i izolacija RNA.

Sedam dana nakon primjene PBS-a ili WGP IP-a, gušterača je sakupljena, obrađena u suspenziju jedne stanice, obojena na sposobnost preživljavanja, CD45 i CD11b, i sortirana pomoću FACS Aria III. Uzorci su pripremljeni u tri primjerka za svaku pokusnu skupinu. Nakon što su ove mijeloidne stanice izolirane, stanice su isprane 2 x s ledeno hladnim PBS-om i zatim lizirane s Trizolom (Invitrogen). RNA su ekstrahirane pomoću QIAGEN RNAeasy Kita (QIAGEN).

Cjelovitost izolirane RNA provjerena je pomoću sustava Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i kvantificirana pomoću Qubit fluorometrijskog testa (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Poly-A obogaćene mRNA-Seq biblioteke pripremljene su prema standardnom protokolu kompleta Universal Plus mRNASeq (Tecan Genomics, Redwood City, CA) korištenjem 10 ng ukupne RNA.

Svi uzorci su povezani s Illumina adapterima i pojedinačno označeni crtičnim kodom. Odsutnost adapterskih dimera i dosljedne veličine biblioteke od ~300 bp potvrđeni su korištenjem Agilent Bioanalyzer 2100. Koncentracija biblioteke i ponašanje sekvenciranja procijenjeni su oko standardiziranog pojačanog unosa PhIX-a pomoću Nano MiSeq protočne ćelije za sekvenciranje tvrtke Illumina. 1,8 pm združenih biblioteka s 1 posto PhiX spike-in učitano je u jednu protočnu ćeliju za sekvenciranje NextSeq 500/550 75 ciklusa High Output Kit v2 i sekvencirano na sekvenceru Illumina NextSeq 500 ciljajući 60 M 1x75 bp čitanja po uzorku.

Sekvenciranje RNA.

Biblioteke su pripremljene korištenjem Universal Plus mRNA-seq kompleta s NuQuant® kvantifikacijom knjižnice (NuGen). Šest uzoraka raspoređeno je u četiri linije sekvenciranja u jednom ciklusu. 24 single-end raw datoteke sekvenciranja (.fastq)64 preuzete su s Illumina BaseSpace65 na KBRIN poslužitelj radi analize. Kontrola kvalitete (QC) neobrađenih sekvenci podataka provedena je pomoću FastQC (verzija 0.10.1)66. Sekvence su poravnate s mm10 referentnim genomom miša pomoću STAR-a (verzija 2.6)67, generirajući datoteke za poravnanje u bam formatu. Diferencijalna ekspresija transkripata koji kodiraju protein ENSEMBL izvedena je pomoću DESeq268,69. Neobrađeni brojevi dobiveni su iz datoteka bam formata usklađenih sa STAR-om pomoću HTSeq (verzija 0.10.0)70. Neobrađeni zbrojevi normalizirani su metodom Relative Log Expression (RLE) i zatim filtrirani kako bi se isključili geni s manje od deset zbrojeva u uzorcima71. RNA-seq podaci pohranjeni su s GEO pristupom GSE187464.

Sekvenciranje RNA: analiza obogaćivanja skupa gena.

Analiza obogaćivanja skupa gena (GSEA) korištena je za daljnju karakterizaciju biologije gena koji čine uvjete WGP u odnosu na PBS i njihove razlike72. Skupovi gena dobiveni su iz baze podataka molekularnih potpisa (MSigDB) za biološke procese genske ontologije (GO) i puteve reakcije. Za svaki set gena, sve testirane lokacije gena u usporedbi WGP-a i PBS-tretiranih kontrolnih miševa razvrstane su od najvećeg do najnižeg značaja korištenjem p vrijednosti. Ovaj pristup omogućuje da se vrlo značajni geni s regulacijom na gore i naniže uključe unutar svakog skupa gena, pristup koji točnije odražava uvjete u biološkom putu. Za ovu analizu, nakon tablice obogaćenih skupova slijedi dijagram obogaćenja koji prikazuje profil rezultata obogaćenja (ES) i položaj članova skupa gena na rangiranoj listi.

Jednostanično sekvenciranje: izolacija pojedinačnih stanica i RNA sekvenciranje.

Žive CD45 plus stanice izdvojene su iz pankreate miša, isprane i resuspendirane u 1x PBS (bez kalcija i magnezija) koji sadrži 0.04 posto BSA. Pojedinačne stanice su uhvaćene i konstruirane su biblioteke cDNA s barkodom koristeći Chromium Next GEM Single-Cell 3ʹ Reagent Kit (v3.1, 10X Genomics) i Chromium Controller, prema uputama proizvođača. Biblioteke su skupljene i sekvencionirane korištenjem konfiguracije od 28 bp × 8 bp × 125 bp za read1 × i7 indeks x read2 na Illumina NextSeq 500 s NextSeq 500/550 150 ciklusom High Output Kit v2.5 (20024907).

Od sekvenciranja stanica: profiliranje ekspresije gena.

Bcl datoteke su demultipleksirane u fastq datoteke pomoću softvera CellRanger (10X Genomics, v3.1.{{10}}). Ukupan broj sekvenciranih čitanja bio je 506.913.062. Očitavanja su bila dobre kvalitete kako je utvrdio FastQC66. Brojevi gena izmjereni su korištenjem CellRanger "count", korištenjem referentnog genoma cell ranger-mm10-3.0.0 za miševe. Generirana je matrica brojanja za svaki uzorak i jedan agregirani uzorak s očekivanim brojem stanica postavljenim na 5000.

Neobrađeni podaci o broju koje je odredio CellRanger korišteni su kao ulaz za prilagođeni analitički cjevovod u R koji koristi različite alate za analizu jedne ćelije temeljene na Seuratu. Grafikon koljena (dopunska slika 7b) prikazuje grafikon koji prikazuje rangirane UMI brojeve za svaki ćelijski crtični kod za podatke prikupljene u tri skupine. Stanice iznad točke infleksije predstavljaju moguće dublete, dok one ispod koljena predstavljaju pozadinske stanice. Mjere kontrole kvalitete stanica analizirane su korištenjem Seurata v373, a stanični crtični kodovi sa sljedećim karakteristikama uklonjeni su iz analize: nizak broj (moguće pozadinske stanice) s FDR-om od 0.01 iz funkcije DropletUtils74 "emptyDrops", visok broj (moguće dubletne stanice) s većim brojem od točke infleksije dijagrama koljena, sadržaj mitohondrija veći od 30 posto i sadržaj ribosoma veći od 40 posto. Gen (značajke) je dalje filtriran kako bi se uklonili povučeni identifikatori gena i geni koji nisu bili eksprimirani u najmanje dvije stanice. Vidi dopunsku sliku 7a, b za početni i filtrirani broj staničnih barkodova i gena.

Podaci o ekspresiji su normalizirani pomoću SCTransform75 gdje su geni staničnog ciklusa, sadržaj ribosoma i sadržaj mitohondrija regresirani. Stanice su zatim grupirane i smanjenje dimenzija je izvedeno pomoću UMAP76. Početni nazivi klastera dodijeljeni su pomoću modificirane tehnike obogaćivanja GSVA77,78. Za svaki od ovih klastera identificirani su glavni markerski geni. Diferencijalno izraženi geni uspoređujući svaki klaster sa svakim drugim klasterom (sve usporedbe u paru) određeni su pomoću Seurat73 i MAST79. scRNA-seq podaci pohranjeni su s GEO pristupom GSE187464.

Identifikacija klastera generiranih sa scRNA-Seq.

Klasteri koji ne potječu od mijeloida klasificirani su općenito kao B-stanice (MS4A1), plazma stanice (SDC1), CD8 plus T-stanice (CD3e, C8a), CD4 plus T-stanice (CD3e, CD4), T-regulacijske stanice (T -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), δ T-stanice (CD3e, TRGC1, TRGC2,IL7Ra) i urođene imunološke stanice tipa 2 (ILC2s) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg,GATA3, IL-5 , IL-13, ICOS i Rxrg)80–82. Neutrofili su identificirani putem ekspresije MMP9, Csf3r, S100A8, S100A8 i ADAM8, iako mogu biti nedovoljno zastupljeni u ovim analizama zbog niskog sadržaja RNA i visokih razina intrinzičnih RNaza83. Konvencionalne dendritičke stanice (cDC) identificirane su putem ekspresije ITGAX i ITGAE, a plazmacitoidne DC (pDC) identificirane su pomoću ITGAX i Siglech.

Klasifikacija mijeloidnih klastera iz scRNA-Seq.

Grupa 5 izražavala je ITGAMINtADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- i nije izražavala TNFAIP2, što ukazuje da su te stanice rezidentni makrofagi. Klaster10 eksprimira ITGAM- HiADGRE1HiLyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2-. Skupine 3 i 4 izražavaju ITGAMINt ADGRE1Int Lyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2Hi, što sugerira da su obje podskupine infiltrirajućih monocita/makrofaga, iako su pojačani upalni geni izraženi u skupini 3 korišteni za identifikaciju skupine 3 kao upalne infiltracije monocita/makrofaga .

Testovi fagocitoze.

Gušterača miševa kojima je ubrizgan PBS/mikročestice i miševa treniranih in vivo WGP sakupljena je 7 dana nakon injekcije i obrađena kao što je prethodno opisano u suspenziju jedne stanice. Oko 2 × 106 je isprano s HEPES razrijeđenim 50x u RPMI 1640 i zatim inkubirano u 100 μL ove otopine 1 sat na 37 stupnjeva kako bi se aktivirale stanice. Invitrogen promovira Green S.

Aureus BioParticlesTM set za fagocitozu za protočnu citometriju (Thermo Fisher Scientific) korišten je prema uputama proizvođača. Oko 100 μL rekonstituiranih čestica ili 1 × 106 GFP plus KPC tumorskih stanica dodano je aktiviranim stanicama gušterače i inkubirano 1 sat na 37 stupnjeva. Uzorci su lagano vorteksirani svakih 15 minuta. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 1 mL hladnog PBS-a. Uzorci su inkubirani s Fc blokom 10 minuta na 4 stupnja, obojeni na vitalnost, CD45, CD11b i F4/80 30 minuta na 4 stupnja, a zatim analizirani pomoću BD FACSCanto. Za analizu, nakon usmjeravanja živih stanica i CD45, utvrđeno je da su stanice koje su fluorescirale u FITC kanalu fagocitne.

Ispitivanje citotoksičnosti.

Gušterača iz WGP i PBS-tretiranih miševa je sakupljena i CD11b plus populacije su izolirane pomoću magnetskih CD11b plus MicroBeads (Miltenyi Biotec) i autoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec). Pročišćene CD11b plus stanice su zatim isprane i izbrojane, te su nasađene u omjeru 1:20 tumor: efektorske stanice u 96-ploču s jažicama. Svi eksperimentalni uzorci testirani su u tri primjerka. Nakon postavljanja CD11b plus stanica, ROS inhibitori N-acetil-Lcistein (NAC) (1 mM, Sigma-Aldrich), Trolox (5 µM, Sigma-Aldrich) ili DFO (50 µM, Europska farmakopeja) dodani su u jedan set stanica izvedenih iz PBS-a i WGP-a 1 h prije dodavanja 5000 KPC s ekspresijom luciferaze plus stanica tumora gušterače u sve jažice. Nakon 24 sata zajedničkog uzgoja, ploče su centrifugirane i 20 µL supernatanta je pomiješano sa 100 µL reagensa za ispitivanje luciferaze (Promega). Aktivnost luciferaze izmjerena u supernatantu korelirala je s tumorskim stanicama koje su ubile efektorske stanice i izmjerene su pomoću luminometra (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation). Spontani signal luciferaze iz stanica tumora na pločici oduzet je od mjerenja supernatanta. Vrijednosti luciferaze predstavljene su kao jedinice relativne svjetlosti (RLU).

In vivo tumorski modeli raka gušterače.

KPC stanična linija na pozadini C57BL/6 izvedena iz LSL-KrasG12D/ plus; LSL-Trp53R172H/ plus; Model miša Pdx1-Cre (KPC) kupljen je od tvrtke Ximbio. Ove i Pan02 stanice koje su velikodušno darovao dr. Yong Lu sa Sveučilišta Wake Forest korištene su u ortotopskom modelu raka gušterače. KPC linija transficirana GFP-om i luciferazom (KPCGFP plus Luc plus) također je velikodušan doprinos dr. Michaela Dwinella s Medicinskog fakulteta u Wisconsinu. Ove su stanice korištene isključivo u albino C57BL/6 miševima.

Za implantaciju tumora, miševi su anestezirani pomoću izoflurana, a abdomen miševa je pripremljen betadinom i sterilno ogrnut. Središnja laparotomija od 2 cm učinjena je aseptičnom tehnikom sa sterilnim instrumentima. Nakon laparotomije eksternalizirane su gušterača i slezena. Tumorske stanice su suspendirane u ledeno hladnom PBS-u i pomiješane u omjeru 1:1 s matriksom bazalne membrane Matrigel (Corning). 0.1 × 106 tumorskih stanica u 50 uL otopine PBS-matrigela ubrizgano je u rep gušterače pomoću 30-inzulinske štrcaljke. Stvaranje malog mjehurića ukazuje na uspješnu implantaciju. Peritoneum je zatvoren korištenjem obloženog poliglikolnom kiselinom pletenog upijajućeg konca 5/0, a koža je zatvorena korištenjem svilenog pletenog neupijajućeg konca 5/0. (CP Medical). Buprenorfin je davan za kontrolu boli do 72 sata nakon operacije, a miševi su praćeni.

In vivo snimanje.

Miševima kojima je ortotopski implantiran GFP plus luciferaza plus KPC tumorske stanice ubrizgano je IP sa 150 mg/kg tjelesne težine u 100 µL XenoLight D-Luciferin-K plus Salt Bioluminescent Substrate (PerkinElmer). Nakon 10 minuta, miševi su anestezirani izofluranom i stavljeni u Biospace Lab Photon Imager, koji je in vivo namjenski optički modalitet pri slaboj razini osvjetljenja za bioluminiscentno i fluorescentno snimanje. Slike miševa su snimljene i korištene za mjerenje veličine i rasta tumora.

Model tumora s dodatkom.

Miševi su trenirani s 1 mg WGP-a i 7 dana kasnije populacije CD11b plus CCR2 plus i CD11b plus CCR2− su sortirane i pomiješane 1:1 s KPC tumorskim stanicama 1 × 105 tumorskih stanica. Stanice su implantirane ortotopski u WT miševe i 3 tjedna kasnije miševi su eutanazirani i procijenjena je veličina tumora.

Kombinirana terapija s anti-PD-L1 mAb.

C57BL/6 miševi liječeni su WGP-om na dan -7 i implantirani su s KPC ortotopnim tumorima gušterače na dan 0. Miševi su tretirani s 200 µg anti-mišjeg anti-PD-L1 mAb (Bio X Cell) ili kontrola izotipa štakorskog IgG2b (Bio X Cell) 3., 7. i 11. dana. Miševi su zatim praćeni na preživljavanje.

WGP kao tretman.

C57BL/6 miševima implantirani su KPC ortotopni tumori pankreasa na dan 0, a na dane 4 i 11 miševima je dano 1 mg IP WGP ili PBS. Miševi su zatim praćeni u pogledu preživljavanja.

Statistička analiza.

Svi rezultati ponovljeni su najmanje tri neovisna puta radi provjere osim ako nije drugačije navedeno. Prikazani su reprezentativni rezultati. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM. Podaci su analizirani dvostranim Studentovim t-testom ili Mann-Whitneyevim U-testom. Usporedbe više grupa provedene su korištenjem jednosmjerne ili dvosmjerne ANOVA praćene Tukeyjevim testom višestrukih usporedbi. Korelacijska analiza provedena je pomoću Pearsonovog koeficijenta korelacije (normalna distribucija). Statistička značajnost postavljena je na p < 0.05. Sve statističke analize provedene su korištenjem softvera GraphPad Prism Version 9 (GraphPad Inc., La Jolla, CA).

Sažetak izvješća.

Dodatne informacije o dizajnu istraživanja dostupne su u Sažetku izvješća o istraživanju prirode povezanom s ovim člankom.

Dostupnost podataka

U ovom radu navedeni su izvorni podaci. RNASeq podaci dostupni su pod GEO pristupom GSE187464, a podaci scRNA-Seq dostupni su pod GEO pristupom GSE187464. Izvorni podaci navedeni su u ovom radu.

Primljeno: 2. travnja 2021.; Prihvaćeno: 17. siječnja 2022.

Reference

1. ACS. Činjenice i brojke o raku 2020.

2. Rahib, L. i sur. Projekcija incidencije i smrti od raka do 2030.: neočekivani teret raka štitnjače, jetre i gušterače u Sjedinjenim Državama. Cancer Res. 74, 2913–2921 (2014).

3. Kommalapati, A., Tella, SH, Goyal, G., Ma, WW & Mahipal, A. Suvremeno liječenje lokaliziranog resektabilnog raka gušterače. Rakovi 10, 24 (2018).

4. Bliss, LA, Witkowski, ER, Yang, CJ & Tseng, JF Ishodi operativnog liječenja raka gušterače. J. Surg. Oncol. 110, 592–598 (2014).

5. Schizas, D. i sur. Imunoterapija raka gušterače: ažuriranje za 2020. Liječenje raka. Rev. 86, 102016 (2020).

6. Henriksen, A., Dyhl-Polk, A., Chen, I. & Nielsen, D. Inhibitori kontrolnih točaka kod raka gušterače. Liječenje raka. Rev. 78, 17–30 (2019).

7. Madden, K. & Kasler, MK Inhibitori imunoloških kontrolnih točaka kod raka pluća i melanoma. Semin. Oncol. Nurs. 35, 150932 (2019).

8. Kao, HF & Lou, PJ Inhibitori imunoloških kontrolnih točaka za karcinom skvamoznih stanica glave i vrata: Trenutno stanje i budući smjerovi. glava. Vrat 41, 4–18 (2019). 9. Leinwand, J. & Miller, G. Regulacija i modulacija antitumorske imunosti kod raka gušterače. Nat. Immunol. 21, 1152–1159 (2020).

10. Royal, RE i sur. Faza 2 ispitivanja pojedinačnog lijeka ipilimumaba (anti-CTLA-4) za lokalno uznapredovali ili metastatski adenokarcinom gušterače. J. Immunother. 33, 828–833 (2010).

11. O'Reilly, EM i sur. Durvalumab sa ili bez tremelimumaba za bolesnike s metastatskim duktalnim adenokarcinomom gušterače: faza 2 randomiziranog kliničkog ispitivanja. JAMA Oncol. 5, 1431–1438 (2019).

12. Weiss, GJ i sur. Studija faze Ib/II gemcitabina, nab-paklitaksela i pembrolizumaba u metastatskom adenokarcinomu gušterače. Investirati. Novi lijekovi 36, 96–102 (2018). 13. Whatcott, CJ, Posner, RG, Von Hoff, DD & Han, H. u Rak gušterače i mikrookruženje tumora (ur. Grippo, PJ & Munshi, HG) Ch. 8 (Transworld Research Network, 2012).

14. Karamitopoulou, E. Tumorsko mikrookruženje raka gušterače: imunološki krajolik je diktiran molekularnim i histopatološkim značajkama. Br. J. Rak 121, 5–14 (2019).

15. Daniel, SK, Sullivan, KM, Labadie, KP & Pillarisetty, VG Hipoksija kao prepreka imunoterapiji u adenokarcinomu gušterače. Clin. prev. Med. 8, 10–10 (2019).

16. Wang, W. i sur. RIP1 kinaza pokreće adaptivnu imunološku toleranciju posredovanu makrofagima kod raka gušterače. Cancer Cell 38, 585–590 (2020).

17. Netea, MG i sur. Istrenirani imunitet: program urođene imunološke memorije u zdravlju i bolesti. Science 352, aaf1098 (2016).

18. Bekkering, S. i sur. Metabolička indukcija trenirane imunosti kroz mevalonatni put. Cell 172, 135-146 e139 (2018).

19. van der Heijden, C. et al. Epigenetika i istrenirani imunitet. Antioksid. Redox signal. 29, 1023–1040 (2018).

20. Priem, B. i sur. Istrenirana nanobiološka terapija za promicanje imuniteta suzbija rast tumora i potencira inhibiciju kontrolnih točaka. Cell 183, 786-801 e719 (2020).

21. Kalafati, L. i sur. Urođeni imunološki trening granulopoeze potiče antitumorsku aktivnost. Cell 183, 771-785 e712 (2020).

22. Mitroulis, I. et al. Modulacija progenitora mijelopoeze integralna je komponenta treniranog imuniteta. Ćelija 172, 147–161.e112 (2018).

23. Bekkering, S., Dominguez-Andres, J., Joosten, LAB, Riksen, NP & Netea, MG Istrenirani imunitet: reprogramiranje urođenog imuniteta u zdravlju i bolesti. Annu Rev. Immunol. 39, 667–693 (2021).

24. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F. & Gomez Perdiguero, E. Razvoj i funkcija tkivnih makrofaga u miševa. Semin. Immunol. 27, 369–378 (2015). 25. Calderon, B. et al. Anatomija gušterače uvjetuje podrijetlo i svojstva rezidentnih makrofaga. J. Exp. Med. 212, 1497–1512 (2015).

26. Kim, H. Transkripcijski faktor MafB potiče protuupalnu M2 polarizaciju i efluks kolesterola u makrofagima. Sci. Rep. 7, 7591 (2017).

27. Kim, SY i sur. Protuupalni učinci apocinina, inhibitora NADPH oksidaze, kod upale dišnih putova. Immunol. Cell Biol. 90, 441–448 (2012).

28. Liu, M. i sur. Transkripcijski faktor c-Maf je kontrolna točka koja programira makrofage u raku pluća. J. Clin. Investirati. 130, 2081-2096 (2020).

29. Zimmerman, KA i sur. Jednostanično RNA sekvenciranje identificira potpise ekspresije gena makrofaga kandidata za bubrežne rezidente među vrstama. J. Am. Soc. Nefrol. 30, 767–781 (2019).

30. Bakoš, E. i sur. CCR2 regulira imunološki odgovor moduliranjem interkonverzije i funkcije efektorskih i regulatornih T stanica. J. Immunol. 198, 4659–4671 (2017).

31. Kurihara, T., Warr, G., Loy, J. & Bravo, R. Defekti u regrutiranju makrofaga i obrani domaćina kod miševa kojima nedostaje CCR2 kemokin receptor. J. Exp. Med. 186, 1757-1762 (1997).

32. Kuziel, WA i sur. Ozbiljno smanjenje adhezije leukocita i ekstravazacije monocita kod miševa s manjkom CC kemokinskog receptora 2. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 12053-12058 (1997).

33. Kratofil, RM, Kubes, P. & Deniset, JF Pretvorba monocita tijekom upale i ozljede. Arterioskler. Thromb. Vasc. Biol. 37, 35–42 (2017).

34. Funamizu, N. i sur. Inhibicijski čimbenik migracije makrofaga inducira prijelaz epitela u mezenhim, pojačava agresivnost tumora i predviđa kliničke ishode kod reseciranog duktalnog adenokarcinoma gušterače. Int. J. Rak 132, 785–794 (2013).

35. Denz, A. i sur. Inhibicija MIF dovodi do zaustavljanja staničnog ciklusa i apoptoze u stanicama raka gušterače. J. Surg. Res. 160, 29–34 (2010).

36. Su, LJ i sur. Peroksidacija lipida inducirana reaktivnim kisikovim spojevima u apoptozi, autofagiji i feroptozi. Oksid. Med. Cell Longev. 2019, 5080843 (2019).

37. Geller, A., Shrestha, R. & Yan, J. Glukan dobiven iz kvasca kod raka: nove upotrebe tradicionalnog terapeutika. Int. J. Mol. Sci. 20, 3618 (2019).

38. Shrivastava, P. & Bhatia, M. Bitna uloga monocita i makrofaga u napredovanju akutnog pankreatitisa. World J. Gastroenterol. 16, 3995-4002 (2010).

39. Wang, J. & Kubes, P. Rezervoar zrelih šupljinskih makrofaga koji mogu brzo upasti u visceralne organe i utjecati na popravak tkiva. Cell 165, 668-678 (2016).

40. Qi, C. i sur. Diferencijalni putovi reguliranja urođenih i adaptivnih antitumorskih imunoloških odgovora česticama i topivim glukanima dobivenim iz kvasca. Blood 117, 6825-6836 (2011).

41. Goodridge, HS i sur. Aktivacija urođenog imunološkog receptora dektina-1 nakon stvaranja 'fagocitne sinapse'. Nature 472, 471-475 (2011).

42. Masuda, Y. et al. Oralna primjena topivih -glukana ekstrahiranih iz Grifola frondosa inducira sustavni antitumorski imunološki odgovor i smanjuje imunosupresiju u miševa s tumorom. Int. J. Rak 133, 108–119 (2013).

43. Rice, PJ et al. Farmakokinetika gljivičnih (1-3)-beta-D-glukana nakon intravenske primjene u štakora. Int. Immunopharmacol. 4, 1209-1215 (2004).

44. Huang, Y. et al. S1P-ovisan međuorganski promet urođenih limfoidnih stanica grupe 2 podržava obranu domaćina. Znanost 359, 114–119 (2018).

45. Mathä, L. et al. Migracija urođenih limfoidnih stanica grupe 2 stanovnika pluća povezuje alergijsku upalu pluća i imunitet jetre. Ispred. Immunol. 12, 67950 (2021).

46. ​​Ricardo-Gonzalez, RR i sur. Putevi specifični za tkivo ekstrudiraju aktivirane ILC2 za širenje imuniteta tipa 2. J. Exp. Med. 217, e2019117 (2020).

47. Mattiola, I. & Diefenbach, A. Omogućavanje antitumorskog imuniteta oslobađanjem ILC2. Cell Res. 30, 461–462 (2020).

48. Qian, BZ & Pollard, JW Raznolikost makrofaga pojačava progresiju tumora i metastaze. Ćelija 141, 39–51 (2010).

49. Qian, BZ et al. CCL2 regrutira upalne monocite kako bi olakšao metastaziranje tumora dojke. Nature 475, 222-225 (2011).

50. Munn, DH & Cheung, NK Fagocitoza tumorskih stanica ljudskim monocitima uzgojenim u rekombinantnom faktoru stimulacije kolonija makrofaga. J. Exp. Med. 172, 231–237 (1990).

51. Jadus, MR i sur. Makrofagi ubijaju stanice tumora T9 glioma koje nose membranski izoform čimbenika stimulacije kolonije makrofaga kroz put ovisan o fagocitozi. J. Immunol. 160, 361-368 (1998).

52. Zhou, X., Liu, X. & Huang, L. Fagocitoza tumorskih stanica posredovana makrofagima: prilika za intervenciju nanomedicine. Adv. funkcija Mater. 31, 2006220 (2021).

53. Lecoultre, M., Dutoit, V. & Walker, PR Fagocitna funkcija makrofaga povezanih s tumorom kao ključna determinanta kontrole progresije tumora: pregled. J. Immunother. Rak 8, e001408 (2020).

54. Cui, S., Reichner, JS, Mateo, RB & Albina, JE Aktivirani mišji makrofagi induciraju apoptozu u tumorskim stanicama kroz mehanizme ovisne ili neovisne o dušikovom oksidu. Cancer Res. 54, 2462-2467 (1994).

55. Brahmer, JR i sur. Sigurnost i aktivnost anti-PD-L1 protutijela u bolesnika s uznapredovalim rakom. N. engl. J. Med. 366, 2455-2465 (2012).

56. Saijo, S. i sur. Dektin-1 je potreban za obranu domaćina od Pneumocystis carinii, ali ne i od Candide albicans. Nat. Immunol. 8, 39–46 (2007).

57. Bernhagen, J. et al. Pročišćavanje, bioaktivnost i analiza sekundarne strukture faktora inhibicije migracije makrofaga miša i čovjeka (MIF). Biokemija 33, 14144-14155 (1994).

58. Chen, TJ & Kotecha, N. Cytobank: pružanje analitičke platforme za analizu citometrijskih podataka zajednice i suradnju. Curr. Vrh. Microbiol. Immunol. 377, 127–157 (2014).

59. Nowicka, M. et al. Tijek rada CyTOF-a: diferencijalno otkrivanje u skupovima podataka visokodimenzionalne citometrije visoke propusnosti. F1000Res. 6, 748 (2017).

60. Wilkerson, MD & Hayes, DN ConsensusClusterPlus: alat za otkrivanje klasa s procjenama pouzdanosti i praćenjem stavki. Bioinformatika 26, 1572–1573 (2010). 61. Finak G., JM FlowWorkspace: Infrastruktura za predstavljanje i interakciju sa skupovima podataka citometrije bez i bez vrata. Verzija Bioconductor (2019).

62. Finak, G., Jiang, W. & Gottardo, R. CytoML za razmjenu podataka citometrije između platformi. Cytom. Dio A: J. Int. Soc. analno Cytol. 93, 1189–1196 (2018).

63. Crowell, HL, Zanotelli, VRT, Chevrier, S. & Robinson, MD KATALIZATOR: alati za analizu citometrijskih podataka. R paket verzija 1.10.3. HelenaLC/KATALIZATOR (2020).

64. Cock, PJ, Fields, CJ, Goto, N., Heuer, ML & Rice, PM Format datoteke Sanger FASTQ za sekvence s rezultatima kvalitete i Solexa/Illumina FASTQ varijante. Nucleic Acids Res. 38, 1767-1771 (2010).

65. Ilumina. BaseSpace korisnički priručnik. 2014.

66. Andrews, S. FastQC: alat za kontrolu kvalitete za podatke niza visoke propusnosti.

67. Dobin, A. i sur. STAR: ultrabrzi univerzalni RNA-seq aligner. Bioinformatika 29, 15–21 (2013).

68. Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Umjerena procjena promjene nabora i disperzije za RNA-seq podatke s DESeq2. Genome Biol. 15, 550 (2014).

69. Trapnell, C. et al. Diferencijalna analiza ekspresije gena i transkripta RNAseq eksperimenata s šeširom i manžetama. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

70. Anders, S., Pyl, PT & Huber, W. HTSeq–Python okvir za rad s podacima sekvenciranja visoke propusnosti. Bioinformatika 31, 166–169 (2015).

71. Boyle, EI i sur. GO::TermFinder–softver otvorenog koda za pristup informacijama o ontologiji gena i pronalaženje značajno obogaćenih termina ontologije gena povezanih s popisom gena. Bioinformatika 20, 3710–3715 (2004).

72. Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: kyoto enciklopedija gena i genoma. Nucleic Acids Res. 28, 27–30 (2000).

73. Stuart, T. et al. Sveobuhvatna integracija podataka jedne ćelije. Ćelija 177, 1888–1902. e1821 (2019).

74. Lun, AT, Riesenfeld, S., Andrews, T., Gomes, T. & Marioni, JC EmptyDrops: razlikovanje stanica od praznih kapljica u podacima sekvenciranja jednostanične RNK na bazi kapljica. Genome Biol. 20, 1–9 (2019).

75. Hafemeister, C. & Satija, R. Normalizacija i stabilizacija varijance jednostaničnih RNA-seq podataka korištenjem regularizirane negativne binomne regresije. Genome Biol. 20, 1–15 (2019).

76. Becht, E. et al. Smanjenje dimenzionalnosti za vizualizaciju podataka jedne ćelije pomoću UMAP-a. Nat. biotehnologija. 37, 38–44 (2019).

77. Diaz-Mejia, JJ et al. Evaluacija metoda za dodjeljivanje oznaka tipova stanica klasterima stanica iz podataka sekvenciranja RNK jedne stanice. F1000Res. 8 ISCB Comm J-296 (2019). 78. Hänzelmann, S., Castelo, R. & Guinney, J. GSVA: analiza varijacija skupa gena za podatke mikronizova i RNA-seq. BMC Bioinforma. 14, 7 (2013).

79. Finak, G. i sur. MAST: fleksibilan statistički okvir za procjenu transkripcijskih promjena i karakteriziranje heterogenosti u podacima sekvenciranja jednostanične RNA. Genome Biol. 16, 1–13 (2015).

80. Suffiotti, M., Carmona, SJ, Jandus, C. & Gfeller, D. Identifikacija urođenih limfoidnih stanica u jednostaničnim RNA-Seq podacima. Imunogenetika 69, 439–450 (2017).

81. Entwistle, LJ i sur. Urođeni fenotip limfoidnih stanica plućne skupine 2 specifičan je za kontekst: određivanje učinka soja, lokacije i podražaja. Ispred. Immunol. 10, 3114 (2020).

82. Ricardo-Gonzalez, RR i sur. Signali tkiva utiskuju identitet ILC2 s funkcijom predviđanja. Nat. Immunol. 19, 1093–1099 (2018).

83. Zilionis, R. i sur. Jednostanična transkriptomija raka pluća kod ljudi i miševa otkriva očuvane mijeloidne populacije kod pojedinaca i vrsta. Imunitet 50, 1317–1334.e1310 (2019).

Priznanja

Autori žele zahvaliti dr. Wolfgangu Zachariasu, dr. Mei Zhang i Sabine Waigel iz Brown Cancer Center Genomics Facility na njihovoj pomoći u RNA-Seq i scRNASeq. Također bismo željeli zahvaliti dr. Clintu Gelleru na lektoriranju rukopisa. Ovaj rad je podržan od strane NIH R01CA213990 i R01AI128818 (JY). CD i CTW su djelomično podržani od strane NIH P20GM135004. Dio ovog rada obavljen je uz pomoć UofL Genomics Facility, koji podržava NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence), Brown Cancer Center i korisničke naknade. CyTOF je izveden u Functional Immunomics Core uz podršku NIH P20GM135004 (Jun Yan/Jason Chesney, MPI). Podršku za sekvenciranje i bioinformatiku za ovaj rad pružili su NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) i NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI). Sadržaj ovog rada isključiva je odgovornost autora i ne predstavlja službena stajališta NIH-a ili Nacionalnog instituta za opće medicinske znanosti (NIGMS).

Autorski prilozi

AEG je dizajnirao i proveo eksperimente, analizirao podatke, interpretirao rezultate i napisao rukopis. RS, CD i HG pridonijeli su eksperimentalnom dizajnu, prikupljanju podataka i analizi podataka. MRW, XH i MZ pomogli su u prikupljanju podataka i pripremi materijala. KA i ECR pridonijeli su računskoj analizi i interpretaciji RNA-Seq analiza, a JHC i ECR pridonijeli su računskoj analizi i interpretaciji ScRNA-Seq analiza. DT i CTW pridonijeli su analizi CyTOF podataka. RAM, H.-gZ i YL pridonijeli su materijalima i vodili projekt. RAM je izvršio kritički pregled. JY je upravljao eksperimentalnim dizajnom i cjelokupnom studijom, tumačio podatke, nadzirao istraživanje i pomagao u pisanju i pregledu rukopisa.

Suprotstavljeni interesi

Autori izjavljuju da nema suprotstavljenih interesa.

Dodatne informacije

Dodatne informacije Mrežna verzija sadrži dodatni materijal dostupan na https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4.

Korespondenciju i zahtjeve za materijale treba uputiti na Jun Yan.

Informacije o recenziji

Nature Communications zahvaljuje Georgeu Milleru i drugim, anonimnim recenzentima na njihovom doprinosu recenziji ovog rada. Dostupna su izvješća recenzenata.

Ponovna izdanja i informacije o dopuštenjima dostupni su na http://www.nature.com/reprints

Napomena izdavača Springer Nature ostaje neutralan u pogledu tvrdnji o nadležnosti u objavljenim kartama i institucionalnim vezama.

Otvoreni pristup Ovaj je članak licenciran pod međunarodnom licencom Creative Commons Attribution 4.0, koja dopušta korištenje, dijeljenje, prilagodbu, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju ili formatu, pod uvjetom da izvornom autoru date odgovarajuće priznanje. (s) i izvor, navedite poveznicu na licencu Creative Commons i naznačite jesu li promjene napravljene.

Slike ili drugi materijali trećih strana u ovom članku uključeni su u Creative Commons licencu članka osim ako nije drugačije navedeno u kreditnoj liniji za materijal. Ako materijal nije uključen u Creative Commons licencu članka, a vaša namjeravana uporaba nije dopuštena zakonskim propisima ili premašuje dopuštenu upotrebu, morat ćete dobiti dopuštenje izravno od nositelja autorskih prava. Za pregled kopije ove licence.

For more information:1950477648nn@gmail.com