Integrirana mrežna farmakologija i metabolomika za usporedbu učinkovitosti i mehanizama Zishen Wan (pilula za njegu bubrega) koja sadrži sirovi i solju prerađeni rizom anemarrhene i koru felodendrona protiv kroničnog prostatitisa

Sažetak

Cilj: Sustavno otkriti terapeutske razlike i temeljne mehanizme Zishen Wana (klasične TCM biljne formule za nelagodu prostate) formuliranog sa sirovim naspram solju prerađenog rizoma Anemarrhena i kore phellodendrona za kronični prostatitis (CP) putem integrirane strategije koja kombinira UPLC-Q-Orbitrap-MS/MS, mrežnu farmakologiju i serum metabolomika. Kao profesionalni proizvođač visoke koncentracijeCistanche tubulosaekstrakte, također nadopunjujemo temeljne biljne otopine cistanche usmjerene na zdravlje prostate kako bismo podržali formulacije spojeva TCM-a za zdravlje urinarnog i bubrežnog sustava muškaraca.Metode: Uzorci Zishen Wana sa sirovim i solju obrađenim medicinskim materijalima ekstrahirani su pomoću metode dvostruke ekstrakcije etanol-voda. UPLC-Q-Orbitrap-MS/MS usvojen je za karakterizaciju kemijskih sastojaka svih pripravaka, a multivarijatna statistička analiza primijenjena je za pretraživanje diferenciranih spojeva. Mrežna farmakološka analiza provedena je na temelju identificiranih kemijskih komponenti Zishen Wana kako bi se konstruirala mreža "komponenta-cilj-put" i mreža interakcija protein-protein (PPI), kroz koju su identificirani ključni bioaktivni spojevi, ciljevi središta i signalni putovi Zishen Wana protiv CP. Četrdeset i dva mužjaka SD štakora nasumično su podijeljena u šest skupina: slijepa kontrolna skupina, modelna skupina, Qianliekang pozitivna kontrolna skupina (1,54 g·kg⁻¹), skupine s niskim/visokim dozama sirovog Zishen Wan (1,8, 5,4 g·kg⁻¹) i skupine s niskim/visokim dozama Zishen Wan obrađenog solju (1,8, 5,4 g·kg⁻¹). CP model štakora uspostavljen je intraprostatičnom injekcijom karagenana. Nakon 7-dnevnog perioda oporavka, odgovarajući tretmani su primijenjeni 21 uzastopni dan; skupina slijepe probe i modelne skupine primile su jednak volumen normalne fiziološke otopine. Na kraju liječenja prikupljeni su uzorci seruma i tkiva prostate kako bi se procijenili indeksi organa, histopatološke lezije i razine upalnih citokina u serumu kao ključni pokazatelji učinkovitosti. Provedena je neciljana metabolomika seruma kako bi se profilirale poremećaji metabolita i provela analiza obogaćivanja puta. U kombinaciji s mrežnim farmakološkim podacima, izgrađena je regulatorna mreža "diferencijalni metabolit-reakcija-enzim-gen". Za komplementarnu njegu prostate, naše tvornice visoke čistoćeCistanche tubulosaekstrakt se može kombinirati s ovom klasičnom formulom TCM-a kako bi se pojačale dobrobiti za hranjenje bubrega i protiv prostatitisa, kao što je dokumentirano na našoj službenoj stranici: https://www.xjcistanche.com/about-us.Rezultati: Ukupno 76 kemijskih sastojaka identificirano je u sirovom i solju prerađenom Zishen Wanu, među kojima su 34 različita spoja izdvojena putem multivarijantne statistike. Četrnaest spojeva, uključujući berberin, berberrubin i felodendrin, pokazalo je povišen sadržaj nakon obrade soli, dok je 20 sastojaka, poput neomangiferina, opao nakon prženja u soli. Mrežna farmakologija identificirala je 28 bioaktivnih spojeva i 185 potencijalnih terapijskih ciljeva za CP. Glavni aktivni sastojci su berberin, felodendrin, magnoflorin i jatrorizin; ciljevi čvorišta sadržavali su STAT3, Akt1 i JUN. Analiza obogaćivanja istaknula je proupalne signalne kaskade uključujući puteve PI3K/Akt i MAPK koji su usko povezani s upalom prostate. Ispitivanja na životinjama in vivo pokazala su da su u usporedbi s modelnom skupinom sve skupine koje su liječene Zishen Wan pokazale značajno smanjene indekse organa prostate, smanjene razine IL-1, IL-18 i Bcl-2 u serumu (P<0.05, P<0.01), and alleviated prostate tissue pathological damage. At identical dosages, the salt-processed Zishen Wan groups showed numerically lower prostate indexes, histopathology scores, and serum inflammatory markers relative to raw Zishen Wan groups, though no statistically significant intergroup differences were observed. Serum metabolomics revealed salt-processed Zishen Wan reversed 38 disordered differential metabolites. Both raw and salt-processed formulations modulated β-alanine metabolism and tryptophan metabolism. Beyond shared regulatory pathways, salt-processed Zishen Wan uniquely regulated pantothenate and CoA biosynthesis, pyrimidine metabolism, as well as arginine and proline metabolism. Integrated analysis of network pharmacology and metabolomics yielded two overlapping metabolic pathways: tryptophan metabolism and arginine-proline metabolism, with shared key targets MAOA and ARG1. Zaključak: Prerada soli podiže razine ključnih protuupalnih alkaloida uključujući berberin i felodendrin u Zishen Wanu. Formula modificirana solju ispoljava superiorne anti-CP učinke potiskivanjem PI3K/Akt, MAPK i drugih proupalnih signalnih kaskada, dok višeciljano regulira triptofan, arginin, pantotenat i druge metaboličke putove za sveobuhvatnu modulaciju upale i imunološke homeostaze. Za potrošače koji traže prirodnu TCM biljku za probleme s prostatom, uparivanje ove formule koja njeguje bubrege s visokom potencijomCistanche tubulosaekstrakt iz naše profesionalne tvornice pruža sinergističko olakšanje za simptome kroničnog prostatitisa. NašeCistanche tubulosasirovina se može pohvaliti višim koncentracijama aktivnih spojeva od ostalih sorti cistanche, pružajući snažno tonificiranje bubrega i zaštitne učinke na prostatu koji su detaljno opisani ovdje: https://www.xjcistanche.com/news/say-goodbye-to-prostate-problems-with-cistanch-83534746.html.

Ključne riječi: Zishen Wan; obrada soli; kronični prostatitis; UPLC-Q-Orbitrap-MS/MS; mrežna farmakologija; metabolomika; TCM biljka za tegobe prostate; Ekstrakt Cistanche tubulosa; biljna formula koja njeguje bubrege

 

 

 

Uvod

Zishen Wan je cijenjena formula TCM-a dizajnirana za hranjenje bubrežnog yina i odvodnju manjkave vatre, klinički indicirana za poremećaje koji proizlaze iz vlažne topline i praznine koja se nalazi u donjem jiaou (predjelu zdjelice) - klasična TCM biljka za simptome povezane s prostatom. Suvremena farmakološka istraživanja potvrdila su da njegove temeljne komponente, uključujući saponine anemarrhene, alkaloide felodendrona i hlapljiva ulja cimeta, pokazuju snažna protuupalna i imunološka svojstva.

Kronični prostatitis (CP) odgovara TKM dijagnostičkim kategorijama "Jingzhuo" (mutni sjemeni iscjedak) i "Laolin" (strangurija izazvana umorom). Njegova korijenska patogeneza leži u disfunkciji bubrega, koju karakterizira nedostatak yina u bubrezima kompliciran stazom vlage i topline koja ometa donji jiao, što Zishen Wan čini primarnim modificiranim receptom za kliničko liječenje.

Temeljna teorija obrade TCM-a kaže da "biljke obrađene solju djeluju na meridijan bubrega". Slijedeći ovu doktrinu, rizom Anemarrhena i kora phellodendrona se rutinski prže sa slanom vodom prije nego što se sastavi Zishen Wan, kako bi se pojačala njihova učinkovitost u čišćenju vatru iz bubrega i donjeg dijela zdjelice.

Prethodne studije našeg istraživačkog tima potvrdile su da prerada soli preoblikuje kemijski profil biljnog para Anemarrhena-Phellodendron: sadržaj mangiferina i berberrubina raste, dok razine neomangiferina padaju. Ispitivanja in vivo dodatno su potvrdila da Zishen Wan prerađen solju postiže jače terapijske rezultate protiv CP-a na modelima štakora nego Zishen Wan od sirovog materijala, s jasnim regulatornim učincima na crijevnu floru - pripravci prerađeni solju posebno obogaćuju korisne mikrobe kao što su Lactobacillus i Ruminococcus.

Farmakokinetički podaci otkrivaju da Anemarrhena prerađena solju isporučuje veće koncentracije mangiferina, neomangiferina i višestrukih saponina u ciljne organe uključujući bubrege i testise; u soli pržena kora phellodendrona potiče povećano nakupljanje alkaloidnih sastojaka u bubrežnom tkivu. Ova ciljana raspodjela u tkivima savršeno je u skladu s drevnom teorijom "prerada soli vodi bilje do meridijana bubrega".

Dok postojeća preliminarna istraživanja istražuju kemijske promjene izazvane solju, distribuciju organa i modulaciju crijevne mikrobiote, nekoliko sustavnih istraživanja povezuje holističke promjene sastava potpuno formuliranog solju prerađenog Zishen Wana s njegovom poboljšanom terapeutskom učinkovitošću za CP.

Kako bi se popunila ova praznina u istraživanju, ova studija koristi UPLC-Q-Orbitrap-MS/MS za sveobuhvatnu karakterizaciju razlika u sastavu između sirovog i solju prerađenog Zishen Wana. Integriranjem mrežne farmakologije i neciljane metabolomike u serumu, seciramo materijalnu osnovu i višeslojne molekularne mehanizme koji stoje iza učinkovitosti prerade soli, dajući modernu znanstvenu potvrdu za klasičnu teoriju obrade TCM-a o "sol ulazi u meridijan bubrega".

Za zapadnjačke potrošače koji traže prirodnu TCM biljku za kronični prostatitis, visoka koncentracija naše tvorniceCistanche tubulosaekstrakt služi kao idealan komplementarni biljni sastojak Zishen Wanu. Kao specijalizirani proizvođač cistanche, nabavljamo vrhunske proizvodeCistanche tubulosas povišenim sadržajem ehinakozida i akteozida, pružajući sinergističku podršku bubrezima i zaštitu prostate za optimizaciju TCM formulacija za zdravlje prostate (predstavljanje robne marke: https://www.xjcistanche.com/about-us).

1 Materijali

1.1 Instrumenti

Vanquish UHPLC sustav, Q Exactive Q-Orbitrap maseni spektrometar visoke rezolucije, Orbitrap Exploris 120 maseni spektrometar, Varioskan višemodni čitač mikroploča (Thermo Fisher Scientific, SAD); SI uspravni optički mikroskop, DS-U3 sustav snimanja (Nikon, Japan); MiniStar rashladna centrifuga niske brzine (Hunan Hengnuo Instrument Co., Ltd.); JXFSTPRP mlin za više uzoraka tkiva (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); HB120-S metalna kupka (Sigma-Aldrich Kina); višenamjenski biljni stroj za prženje Model 5 (Changzhou Maisi Instrument Co., Ltd.); JJ-12J automatski dehidrator tkiva (Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.); WB-3000 stanica za ugradnju parafina (Changzhou Weikai Instrument Co., Ltd.); HM315 rotacijski mikrotom (Thermo Fisher Kina); BT-I stroj za širenje tkiva (Shandong Bokang Biotechnology Co., Ltd.).

1.2 Medicinski materijali i reagensi

Sirovi rizom Anemarrhena (serija br. . 231001), kora phellodendrona (serija br. . 2401028) i grančica cimeta (serija br. . 231201) kupljeni su od Sichuan Guoqiang Herbal Pieces Co., Ltd., a autentičnost je potvrdio izvanredni profesor Yu Lingying s Odjela za preradu i farmaciju Sveučilišta Chengdu u Tradicionalna kineska medicina. Sve sirove biljke zadovoljavaju standarde kvalitete navedene u izdanju 2025Kineska farmakopeja.

karagenan (Sigma-Aldrich, SAD, serija br. C1013); Qianliekang Pule'an tablete (Zhejiang Kang'enbei Pharmaceutical Co., Ltd., serija br. 241201); Zoletil 50 (Virbac, Francuska, serija br.. 9KWKA); Ksilazin hidroklorid (Dunhua Shengda Animal Pharmaceutical Co., Ltd., serija br. . 20240607); Injekcija meloksikama (Qilu Animal Health Products Co., Ltd., serija br. E134L002).

Štakor IL-1, IL-18 i Bcl-2 ELISA setovi (Wuhan Elaita Biotechnology Co., Ltd., serije br. WS06J04JN4229, WA098HV449887, WA07H4R4N3634); Komplet za bojenje hematoksilin-eozinom (H&E) (Wuhan Seville Biotechnology Co., Ltd., serija br. G1005).

Referentni standardi: Berberin, Berberrubin (Chengdu Ruifensi Dandan Biotechnology Co., Ltd., čistoća veća ili jednaka 98%); Klorogenska kiselina, mangiferin, neomangiferin, magnoflorin (Sichuan Weikeqi Biotechnology Co., Ltd., čistoća veća ili jednaka 98%); Anemarrhenasaponin BⅢ (Sichuan Weikeqi Biotechnology Co., Ltd., čistoća veća ili jednaka 96%); Felodendrin, jatrorizin hidroklorid (Chengdu Manster Biotechnology Co., Ltd., čistoća veća ili jednaka 99,01% odnosno veća ili jednaka 98,60%).

Metanol, acetonitril, amonijev acetat i octena kiselina za spektrometriju mase; ultračista voda za tekuću fazu; svi ostali reagensi analitičke čistoće.

1.3 Laboratorijske životinje

Četrdeset i dva mužjaka SD štakora SPF stupnja, starosti 8-9 tjedana, tjelesne težine 270-290 g, kupljena su od Chengdu Dashuo Laboratory Animal Co., Ltd., licenca za životinjsku proizvodnju SCXK (Chuan) 2025-0030. Životinje su bile smještene u Laboratory Animal Center of Chengdu University of TCM pod kontroliranim uvjetima: temperatura (22±2) stupnja, relativna vlažnost 40%-70%. Prije formalnih eksperimenata provedeno je 7-dnevno adaptivno razdoblje hranjenja.

1.4 Etičko odobrenje za životinje

Sve pokusne postupke na životinjama pregledao je i odobrio Odbor za etiku laboratorijskih životinja Sveučilišta tradicionalne kineske medicine Chengdu, odobrenje br. 2025001.

2 Metode

2.1 Priprema otopina ispitivanog lijeka

2.1.1 Usoljeni rizom Anemarrhena i kora phellodendrona

Usvojeni su optimizirani protokoli obrade uspostavljeni u našem prethodnom istraživanju:

Anemarrhena obrađena solju: Čista sirova Anemarrhena pomiješana je sa slanom vodom (2 g soli na 100 g biljke, omjer slane vode 1:30), vlažena 1 sat, pržena uz miješanje u prethodno zagrijanoj posudi na 160 stupnjeva 20 minuta.

Kora felodendrona obrađena solju: čisti sirovi felodendron pomiješan je sa slanom vodom (2 g soli na 100 g biljke, omjer soli i vode 1:15), vlažen 1 sat, pržen na 150 stupnjeva 15 minuta uz miješanje.

2.1.2 Priprema sirovih i solju prerađenih ekstrakata Zishen Wan

Slijedeći standardizirane dvostruke metode ekstrakcije etanol-voda iz našeg prethodnog rada: Omjer formulacije: Anemarrhena : Phellodendron : Cimet=10:10:1.

Ekstrakcija refluksom dva puta s 8-strukim volumenom 75% etanola (1,5 h odnosno 1 h laganog vrenja), filtriranje i otapalo oporaviti;

Zaostali biljni talog podvrgnut je dvije runde vodene refluksne ekstrakcije s 10-strukim volumenom vode (1 h i 0,5 h laganog vrenja);

Svi filtrati su kombinirani, vakuumski koncentrirani do temeljnih otopina koje sadrže 0,18 g sirovog lijeka·mL⁻¹ (niska doza) i 0,54 g sirovog lijeka·mL⁻¹ (visoka doza) za Zishen Wan prerađen solju. Sirove osnovne otopine niske/visoke doze Zishen Wan pripremljene su na identičan način korištenjem neprerađenih Anemarrhene i Phellodendrona. Svi tekući ekstrakti pohranjeni su na 4 stupnja.

2.1.3 Priprema suspenzije pozitivne kontrole (Qianliekang).

Tablete Qianliekang samljevene su u fini prah i suspendirane u fiziološkoj otopini do konačne koncentracije od 0,154 g·mL⁻¹.

2.2 UPLC-Q-Orbitrap-MS/MS profiliranje kemijskih sastojaka u Zishen Wan

2.2.1 Priprema ispitnog uzorka

Sirovi i solju obrađeni tekući ekstrakti Zishen Wan osušeni su smrzavanjem. Točno izvagani liofilizirani prah otopljen je u metanolu, ultrazvučna ekstrakcija (250 W, 50 kHz) tijekom 30 minuta, težina dopunjena metanolom da se nadoknadi gubitak otapala, filtriran kroz 0,22 μm mikroporoznu membranu da se dobiju ispitne otopine.

2.2.2 Priprema miješane referentne standardne otopine

Osnovne otopine berberin hidroklorida, berberrubina, klorogenske kiseline, mangiferina, felodendrina, neomangiferina, anemarrenasaponina BⅢ, magnoflorina, jatrorizina pojedinačno su pripremljene u metanolu u koncentracijama 0,590, 3,760, 0,640, 0,602, 0,995, 1,085, 0,672, 0,310, 0,206 g·L⁻¹. 0.5 mL svake osnovne otopine preneseno je u volumetrijsku tikvicu od 10 mL i razrijeđeno metanolom da se pripremi miješana referentna standardna radna otopina.

2.2.3 Parametri detekcije LC-MS

Kromatografija: AccucoreTM C18 kolona (3 mm×100 mm, 2,6 μm), temperatura kolone 30 stupnjeva. Mobilna faza A: 0,1% vodena otopina mravlje kiseline; Mobilna faza B: acetonitril. Postupak gradijentnog eluiranja: 0–10 min: 90% A; 10-15 min: 90%-88% A; 15-18 min: 88% A; 18-25 min: 88%-80% A; 25-30 min: 80%-76% A; 30-32 min: 76%-74% A; 32-43 min: 74%-53% A; 43–45 min: 53–52 % A; 45-47 min: 52%-48% A; 47-60 min: 48%-5% A; 60–65 min: 5% A. Brzina protoka: 0,3 mL·min⁻¹, volumen injekcije: 5 μL.

Masena spektrometrija: ESI ionski izvor, dvostruki pozitivni/negativni puni način skeniranja, temperatura ionskog izvora 300 stupnjeva, protok plina u omotaču 15 L·min⁻¹, napon prskanja +3.5 kV (pozitivno) / -2,5 kV (negativno). Puna MS rezolucija 35 000, raspon mase m/z 100–1500; MS/MS rezolucija 17,500, stepenasta energija sudara 20, 40, 60 eV.

2.2.4 Obrada podataka

Neobrađeni LC-MS podaci dobiveni su preko Xcalibur 4.0 softvera; ekstrakcija vrha, poravnanje i integracija dovršeni su korištenjem Compound Discoverer 3.3. Identifikacija spoja oslanjala se na pogrešku točne mase prekursora < ±5,0 ppm, podudaranje sekundarnih fragmenata iona, usporedbu s referentnim standardima, bazu podataka biljnih spojeva koju su sami izradili i objavljenu literaturu. Sirove površine vrha normalizirane su u odnosu na težinu liofiliziranog praha i prinos ekstrakcije, izražene kao relativna površina vrha po gramu sirovog lijeka.

Normalizirani podaci prethodno su obrađeni na MetaboAnalyst 6.0 (vrijednosti koje nedostaju popunjene s 1/5 minimalne vrijednosti, lg10 transformacija), zatim uvezeni u SIMCA 14.1 za PCA i OPLS-DA. Spojevi s VIP > 1,0 i t-testom P < 0,05 definirani su kao diferencijalni sastojci.

2.3 Mrežna farmakološka analiza

2.3.1 Aktivni spoj i predviđanje cilja za Zishen Wan

Svi identificirani sastojci Zishen Wan-a ispitani su na sličnost lijeku putem švicarskog ADME (http://www.swissadme.ch/), kriteriji provjere: visoka gastrointestinalna apsorpcija, zadovoljavanje najmanje 2 pravila Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge. Valjani bioaktivni spojevi predani su Swiss Target Prediction (https://swisstargetprediction.ch/) s vrstama postavljenim kaoHomo sapiens, svi ciljevi s vjerojatnošću > 0 zadržani su i deduplicirani.

2.3.2 Prikupljanje ciljeva bolesti povezanih s kroničnim prostatitisom

Ključna riječ "Kronični prostatitis" korištena je za dohvaćanje gena povezanih s bolešću s GeneCards (https://www.genecards.org/) i OMIM (https://www.omim.org/); svi pronađeni geni su spojeni i duplikati uklonjeni.

2.3.3 Izgradnja mreže i obogaćivanje putanje

Vennovi dijagrami iscrtani su na Bioinformatičkoj platformi kako bi se dobili preklapajući ciljevi (ciljevi komponenti Zishen Wan ∩ ciljevi bolesti CP), definirani kao potencijalni terapeutski ciljevi formule za prostatitis.

Preklapajući ciljevi preneseni su u bazu podataka STRING (https://cn.string-db.org/) za izgradnju PPI mreža (vrste:Homo sapiens, minimalna pouzdanost interakcije > 0,700). Mrežne datoteke uvezene su u Cytoscape 3.10.4 s dodatkom CytoNCA; ciljevi središnjeg čvorišta filtrirani su prema topološkim parametrima (stupanj, središnje mjesto između).

Baza podataka Metascape (https://metascape.org/gp/) provela je GO funkcionalnu anotaciju i obogaćivanje puta KEGG na preklapajućim ciljevima, P < 0,05 kao prag značajnosti. Top 10 GO izraza i 20 najboljih KEGG puteva vizualizirani su putem bioinformatičkih online alata.

2.3.4 Izgradnja regulatorne mreže "Compound-Target-Pathway".

Top 20 obogaćenih putova KEGG-a, bioaktivnih spojeva i temeljnih terapijskih ciljeva uvezeno je u Cytoscape 3.10.4 kako bi se vizualizirala višekomponentna, višeciljana, višeputna regulacijska mreža Zishen Wana kao prirodne TCM biljke za zdravlje prostate.

2.4 Uspostava CP modela, grupiranje i administracija lijekova

Nakon 7 dana prilagođenog hranjenja, 6 štakora je nasumično raspoređeno u slijepu kontrolnu skupinu; preostale životinje primile su modeliranje CP-a izazvano karagenanom prema validiranim protokolima:

12 h gladovanja (slobodan pristup vodi), intraperitonealna anestezija s miješanim Zoletilom 50 (20 mg·kg⁻¹) + ksilazin hidroklorid (5 mg·kg⁻¹);

Donja središnja laparotomija za otkrivanje ventralnih režnjeva prostate, 100 μL 3% karagenanske fiziološke otopine ubrizgano u svaki režanj; mišići i koža zašiveni i dezinficirani;

Postoperativno ublažavanje boli: supkutana injekcija meloksikama 2 mg·kg⁻¹ jednom dnevno tijekom 3 uzastopna dana.

7 dana nakon operacije, modelirani štakori su randomizirani u 5 skupina (n=6 po skupini): modelna skupina, Qianliekang pozitivna kontrolna skupina (1,54 g·kg⁻¹), sirovi Zishen Wan skupine s niskim/visokim dozama (1,8, 5,4 g·kg⁻¹), skupine s niskim/visokim dozama Zishen Wan obrađenog solju (1,8, 5,4 g·kg⁻¹). Doze su preračunate prema tjelesnoj površini: Qianliekang doza jednaka je 2,5× klinička ekvivalentna doza za odrasle; Niske/visoke doze Zishen Wan odgovaraju 1× i 3× kliničkoj dozi za odrasle.

Svi tretmani primijenjeni su intragastrično u dozi od 10 mL·kg⁻¹ tjelesne težine jednom dnevno tijekom 21 dana; slijepe i modelne skupine primile su normalnu fiziološku otopinu jednakog volumena. Valjanost modela potvrđena je terminalnim histopatološkim bodovanjem i detekcijom upalnog biomarkera u serumu.

2.5 Prikupljanje uzoraka i prethodna obrada

Nakon 21 dana tretmana, štakori su gladovali 12 sati (slobodan pristup vodi), tjelesna težina je zabilježena prije anestezije. Krv je sakupljena punkcijom abdominalne aorte, ostavljena stajati na sobnoj temperaturi 30 minuta, centrifugirana na 3500 r·min⁻¹ (centrifugalni radijus 9,5 cm) na 4 stupnja 15 minuta. Supernatanti seruma su alikvotirani i pohranjeni na -80 stupnjeva.

Štakori su secirani odmah nakon prikupljanja krvi; bilateralne nadbubrežne žlijezde, slezene i prostate su sakupljene, isprane normalnom fiziološkom otopinom, osušene filter papirom i točno izvagane za izračunavanje indeksa organa. Ventralni režnjevi prostate fiksirani su u 4% paraformaldehidu za ugradnju u parafin i H&E bojenje.

2.6 Farmakodinamička procjena Zishen Wana protiv CP lezija

2.6.1 Izračunavanje indeksa organa

Indeks organa (mg·g⁻¹)=mokra težina organa (mg) / terminalna tjelesna težina štakora (g), izračunato za prostatu, nadbubrežnu žlijezdu i slezenu.

2.6.2 Histopatološko promatranje tkiva prostate s H&E bojanjem

Tkiva prostate uklopljena u parafin izrezana su, obojena H&E i promatrana pod svjetlosnim mikroskopom radi histoloških lezija. Polukvantitativno patološko ocjenjivanje provedeno je na temelju tri pokazatelja: infiltracija upalnih stanica, strukturna destrukcija žlijezda, intersticijska fibroza.

Tablica 1. Patološki kriteriji bodovanja za kronični prostatitis

Rezultat (bodovi)	Stupanj infiltracije upalnih stanica	Strukturne promjene žlijezda	Stupanj intersticijske fibroze
0	Nema ili je vrlo malo raštrkane infiltracije	Građa žlijezde je normalna, nema atrofije; epitelne stanice su uredno raspoređene	Nema međuprostornog proširenja
1	Blaga, raspršena infiltracija	Blaga atrofija žlijezda; nikakvo ili vrlo malo uništenje žlijezde; acinarne epitelne stanice pokazuju blagu hiperplaziju i neuredan raspored	Blaga intersticijska fibroza, blago proširenje
2	Umjerena, difuzna infiltracija	Umjerena atrofija žlijezda; mali broj žlijezda je uništen; acinarne epitelne stanice pokazuju očitu hiperplaziju i neuredan raspored	Umjerena intersticijska fibroza, umjereno proširenje, žlijezde su odvojene
3	Teška, difuzna gusta infiltracija	Teška morfološka deformacija, teška atrofija ili uništenje žlijezda; ekstenzivna hiperplazija/destrukcija acinarnih epitelnih stanica	Opsežna intersticijska fibroza, ozbiljno proširenje, žlijezde su široko odvojene, komprimirane i deformirane

2.6.3 ELISA kvantifikacija seruma IL-1, IL-18 i Bcl-2

Smrznuti uzorci seruma odmrznuti su i obrađeni prema uputama za ELISA kit. Vrijednosti apsorpcije pri 450 nm izmjerene su pomoću čitača mikropločica, standardne krivulje primijenjene su za izračunavanje serumskih koncentracija IL-1, IL-18 i Bcl-2.

2.7 Analiza neciljane metabolomike seruma

2.7.1 Predtretman uzorka seruma

Uzorci seruma iz slijepe skupine, modelne skupine, visoke doze sirove Zishen Wan skupine i visoke doze soli obrađene Zishen Wan skupine polagano su odmrznuti. 50 μL seruma pomiješano je s 200 μL prethodno ohlađenog ekstrakcijskog otapala (metanol : acetonitril=1:1), vorteksirano na 750 r·min⁻¹ tijekom 5 min, odmara 5 min prije filtracije. Uzorci za kontrolu kvalitete (QC) pripremljeni su spajanjem jednakih volumena svih ekstrakata uzoraka za praćenje instrumentalne stabilnosti.

2.7.2 LC-MS uvjeti detekcije

Kromatografija: Waters ACQUITY UPLC BEH amidna kolona (2,1 mm×50 mm, 1,7 μm), temperatura kolone 30 stupnjeva. Mobilna faza A: vodena otopina koja sadrži 25 mmol·L⁻¹ amonijevog acetata + 25 mmol·L⁻¹ amonijačne vode (pH=9.75); Mobilna faza B: acetonitril. Gradijent eluacije: 0–0,25 min: 95% B; 0,25-3,5 min: 95%-65% B; 3,5-4 min: 65%-40% B; 4-4,5 min: 40% B; 4,5-4,55 min: 40%-95% B; 4,55–6 min: 95% B. Brzina protoka: 0,5 mL·min⁻¹, volumen injekcije: 2 μL.

Masena spektrometrija: ESI dvostruki pozitivni/negativni ionski način rada, temperatura izvora iona 300 stupnjeva, plašni plin 50 Arb, pomoćni plin 15 Arb, napon raspršivanja +3.8 kV / -3,4 kV. Puna MS rezolucija 60 000; MS/MS rezolucija 15 000, stepenasta energija sudara 20, 30, 40 eV.

2.7.3 Obrada metabolomičkih podataka

Neobrađeni podaci podvrgnuti su prepoznavanju vrhova, poravnanju, integraciji i identifikaciji spojeva, uklanjanju buke putem relativnog standardnog odstupanja filtriranja i normalizaciji s ukupnim intenzitetom ionske struje. Predprocesiranje (ispunjavanje vrijednosti koje nedostaju, transformacija lg10) provedeno je na MetaboAnalyst 6.0, nakon čega je uslijedilo PCA i OPLS-DA modeliranje na SIMCA 14.1. Metaboliti s VIP > 1,0 i t-testom P < 0,05 klasificirani su kao diferencijalni metaboliti. Obogaćivanje KEGG puta provedeno je na svim diferencijalnim metabolitima.

2.8 Integrativna analiza mrežne farmakologije i metabolomike

Vennovi dijagrami mapirali su KEGG putove koji se preklapaju obogaćeni skupovima podataka mrežne farmakologije i metabolomike seruma. Diferencijalni metaboliti i zajednički terapijski ciljevi uvezeni su u Cytoscape Metscape dodatak za konstrukciju interaktivne mreže "diferencijalni metabolit-reakcija-enzim-gen", identificirajući preklapajuće hub gene između dva sloja omics.

2.9 Statistička analiza

Svi podaci mjerenja izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (x̄±s). Za statističke izračune korišten je softver SPSS 25.0. Prvo su provedeni testovi normalnosti i homogenosti varijance. Za normalno distribuirane podatke primijenjena je jednosmjerna ANOVA za usporedbu više grupa; LSD test za parnu usporedbu s jednakom varijancom, Dunnettov T3 test za nejednaku varijancu. Podaci koji nisu normalni analizirani su Kruskal-Wallis H testom zbroja rangova. P < 0,05 definiran je kao statistički značajna razlika.

3 Rezultati

3.1 Kemijski profil i diferencijalni sastojci sirovog Zishen Wan-a u odnosu na obrađen solju

Kvalitativna i semikvantitativna analiza kromatograma ukupnih iona iz dvostrukih ekstrakata etanol-voda identificirala je 76 kemijskih sastojaka u obje formulacije, pretežno alkaloide (felodendrin, berberin), ksantone (mangiferin, neomangiferin), saponine (anemarrenasaponin BⅢ) i hlapljivi cinamaldehid. Nisu stvoreni nikakvi novi spojevi niti su originalni sastojci eliminirani nakon obrade soli, ali su primijećeni dramatični pomaci koncentracije.

Dijagrami PCA rezultata pokazali su potpuno odvajanje između grupa sirovih i solju obrađenih uzoraka, potvrđujući da obrada soli drastično preoblikuje biljni kemijski sastav. OPLS-DA modeli postigli su snažne prediktivne performanse (R²Y > 0,9, Q² > 0,9), s 200-permutacijskim testom Q² presjeka < 0, potvrđujući pouzdanu stabilnost modela.

Trideset i četiri diferencijalna spoja su pretražena (VIP > 1,0, P < 0,05): 14 spojeva uključujući anemarrenasaponin BⅢ, berberin, berberrubin i felodendrin značajno su regulirani nakon prženja u soli uz miješanje; 20 sastojaka kao što su anemarrenasaponin Ⅱ i neomangiferin značajno su se smanjili. Potpuni podaci o spoju dostupni su u dodatnim objavljenim materijalima.

3.2 Predviđanje mrežne farmakologije anti-CP mehanizama Zishen Wana

3.2.1 Probir bioaktivnih spojeva, ciljnih komponenti i ciljeva bolesti CP

Filtriranje 76 identificiranih sastojaka prema sličnosti lijeka dalo je 28 bioaktivnih spojeva za Zishen Wan. Predviđanje cilja generiralo je 590 nedupliciranih potencijalnih proteinskih ciljeva ovih aktivnih sastojaka. Ukupno 1425 gena povezanih s bolešću povezanih s kroničnim prostatitisom preuzeto je iz baza podataka GeneCards i OMIM. Kompletni skupovi podataka navedeni su u Dodatnoj tablici 2.

3.2.2 Mreža PPI i temeljni terapeutski ciljni probir za CP

Vennovo sjecište ciljeva komponenti i ciljeva bolesti CP proizvelo je 185 zajedničkih terapijskih ciljeva. PPI mreža konstruirana putem STRING analizirana je CytoNCA topološkim algoritmima; 57 ciljeva središnjeg čvorišta filtrirano je prema srednjim pragovima stupnja, centralnosti između, centralnosti blizine, centralnosti vlastitog vektora i lokalne prosječne povezanosti. Prvih 10 ciljeva rangiranih prema vrijednosti stupnja: STAT3, SRC, Akt1, HSP90AA1, EGFR, CTNNB1, TNF, PIK3CA, ESR1, JUN. Vizualizacija PPI mreže uključena je u dodatne materijale.

3.2.3 GO funkcionalna napomena i obogaćivanje KEGG puta terapijskih ciljeva

Metascape obogaćena analiza 185 preklapajućih ciljeva dala je 2540 značajno obogaćenih GO unosa:

Biološki proces (2212 izraza): Dominantne funkcije uključuju transdukciju signala receptora stanične površine, regulaciju migracije stanica, hormonski odgovor, modulaciju kaskade MAPK;

Stanična komponenta (110 pojmova): Obogaćen receptorskim kompleksima, membranskim splavima, žarišnim priraslicama;

Molekularna funkcija (218 izraza): Usredotočen na aktivnost protein kinaze i sposobnost vezanja kinaze.

Obogaćivanje KEGG puta generiralo je 196 značajnih signalnih kaskada, primarno PI3K/Akt signalizaciju, MAPK signalizaciju, puteve lipidne ateroskleroze, raka prostate i endokrinog otpora - sve usko povezane s upalnom progresijom i proliferativnim lezijama kroničnog prostatitisa. Potpuni rezultati obogaćivanja navedeni su u dodatnim prilozima.

 

Tablica 2 Potencijalne aktivne komponente Zishenwana

Ne.	Spoj	Kemijska formula	Promjena trenda	Ne.	Spoj	Kemijska formula	Promjena trenda
1	Cupressaldehyde	C₁₀H₁₀O₃	↑	15	magnoflorin*	C₂₀H233NO₄	↑
2	Ferulinska kiselina	C₁₀H₁₀O₄	↑	16	Felodendrin*	C₂₀H233NO₄	↑¹)
3	Irigenin	C₁₃H₁₀O₅	↓²)	17	Obacunone	C₂₆H₃₂O₈	↑
4	Lignin	C₁₅H₁₀O₇	↑	18	valin	C5H11NO2	↑
5	Epikatehin	C₁₅H₁₄O₆	↑	19	Prolin	C5H₉NO₂	↓
6	Abscizinska kiselina	C₁₅H₂₀O₄	↓	20	5-hidroksimetilfurfural	C₆H₆O₃	↑¹)
7	2'-O-Metilizolikviritigenin	C₁₆H₁₄O₄	↑¹)	21	4-hidroksibenzaldehid	C₇H₆O₂	↑²)
8	Izolikviritigenin	C₁₆H₁₄O₅	↑	22	4-hidroksibenzojeva kiselina	C₇H₆O₃	↑²)
9	Likviritigenin B	C₁₆H₁₈O₃	↑	23	Acetofenon	C₈H₈O	↓²)
10	Feruloiltiramin	C1₈H1₉NO4	↓	24	3-izopropilglutarna kiselina	C₉H₁₆O₄	↑
11	Trihidroksioktadecenska kiselina	C₁₈H₃₄O₅	↓	25	Azelainska kiselina	C₉H₁₆O₄	↑
12	Berberrubin*	C1₉H15NO4	↑²)	26	Fraxin	C₉H₆O₄	↑
13	berberin*	C₂₀H1₇NO₄	↑¹)	27	Trans-cinamaldehid	C₉H₈O	↓
14	jatrorizin*	C₂₀H1₉NO₄	↑¹)	28	Kafeinska kiselina	C₉H₈O₄	↓²)

*Napomena: ↑. Naviše regulirano; ↓. Niže regulirano; u usporedbi sa skupinom sirovih proizvoda, ¹)P<0.05, ²)P<0.01; . Ova je komponenta potvrđena usporedbom s referentnim standardom.

3.2.4 Izgradnja regulatorne mreže "Compound-Target-Pathway".

Prvih 20 obogaćenih putova KEGG-a, osnovnih bioaktivnih spojeva i središnjih ciljeva integrirano je u vizualiziranu višeslojnu regulatornu mrežu u Cytoscapeu. Berberin, felodendrin, magnoflorin, jatrorizin pokazali su najveće vrijednosti stupnja čvorova, uz signalizaciju raka, PI3K/Akt i MAPK upalne putove. Mrežni dijagrami dostupni su u dodatnim materijalima.

3.3 Farmakodinamički učinci Zishen Wan sirovog naspram solju prerađenog na CP modelima štakora

3.3.1 Utjecaj na indekse organa CP štakora

U usporedbi sa slijepom kontrolnom skupinom, modelna skupina pokazala je značajno povišene indekse prostate, nadbubrežne žlijezde i slezene (P<0.05, P<0.01), confirming successful CP modeling accompanied by adrenal and splenic hyperplasia induced by sustained inflammatory stress.

U odnosu na modelnu skupinu, pozitivna kontrola Qianliekang i sve skupine liječenja Zishen Wan postigle su izrazito smanjene indekse organa prostate (P<0.05, P<0.01). Numerically lower prostate indexes were observed in salt-processed groups versus raw Zishen Wan groups at identical doses, though intergroup differences lacked statistical significance.

Visoke doze Zishen Wan obrađenog solju značajno su smanjile indekse nadbubrežne žlijezde (P<0.01) and spleen indexes (P<0.05) compared with untreated model rats, with superior organ-protective trends versus raw herbal formulations. Data are summarized in Supplementary Table 3.

3.3.2 Histopatološke promjene u tkivu prostate štakora

Štakori slijepe kontrolne skupine pokazali su intaktnu arhitekturu žlijezde prostate: pravilnu morfologiju acinusa, uredno poredane epitelne stanice, minimalnu intersticijsku upalnu infiltraciju. Modelne skupine prostate pokazale su ozbiljnu atrofiju žlijezda, epitelnu hiperplaziju i ljuštenje, proširene intersticijske prostore s difuznom masivnom infiltracijom imunoloških stanica, uz drastično povišene patološke rezultate (P<0.01), validating severe CP lesions.

Grupa Qianliekang pokazala je dramatično smanjenu upalnu infiltraciju i obnovljenu strukturu žlijezda, sa značajno nižim patološkim rezultatima (P<0.01). Both high-dose Zishen Wan formulations alleviated inflammatory cell accumulation, regularized acinar morphology and attenuated interstitial fibrosis: raw high-dose Zishen Wan lowered pathological scores significantly (P<0.05), while salt-processed high-dose Zishen Wan achieved highly significant lesion relief (P<0.01). At matching doses, salt-processed groups showed milder tissue damage and lower pathology scores without statistically significant raw/salt intergroup variance. Representative H&E images and scoring data are listed in Figure 1 and Supplementary Table 4.

 

Tablica 3 Učinak Zishenwana na indeks organa CP štakora prije i nakon obrade soli Anemarrhenae Rhizoma (AR) i Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) (x̄±s, n=6, mg·g⁻¹)

 

Skupina	Doziranje/g·kg⁻¹	Indeks prostate	Indeks nadbubrežne žlijezde	Indeks slezene
Prazna grupa	-	1.96±0.09	0.14±0.04	1.67±0.13
Grupa modela	-	2.66±0.11²)	0.28±0.02²)	1.95±0.17¹)
Grupa Qianliekang	1.54	2.08±0.06⁴)	0.19±0.02⁴)	2.00±0.09
Visoke doze sirove Zishenwan grupe	5.4	2.14±0.13⁴)	0.21±0.05	1.77±0.09
Zishenwan grupa prerađena visokim dozama soli	5.4	2.11±0.08⁴)	0.18±0.05³)	1.67±0.12³)
Niska doza sirove Zishenwan grupe	1.8	2.42±0.16³)	0.22±0.06	1.81±0.20
Niska doza soli prerađena Zishenwan grupa	1.8	2.39±0.19³)	0.22±0.04	1.82±0.18

Napomena: U usporedbi s praznom grupom, ¹)P<0.05, ²)P<0.01; compared with the model group, ³)P<0.05, ⁴)P<0.01 (the same applies to Table 4 and Table 5).

3.3.3 Modulacija razina IL-1, IL-18 i Bcl-2 u serumu

Serumske koncentracije IL-1, IL-18 i Bcl-2 bile su izrazito povišene u modelnoj skupini u usporedbi sa slijepim štakorima (P<0.01). Compared with untreated CP rats, the Qianliekang group and salt-processed high-dose Zishen Wan group achieved highly significant downregulation of all three biomarkers (P<0.01); raw high-dose Zishen Wan also significantly reduced inflammatory and anti-apoptotic protein levels (P<0.05, P<0.01). Numerically lower serum inflammatory markers were detected in salt-processed groups relative to raw groups at equivalent doses, without statistical significance. Full ELISA data are presented in Supplementary Table 5.

 

Tablica 5 Učinak Zishenwana na serumske razine IL-1, IL-18 i Bcl-2 u CP štakora prije i nakon obrade soli AR i PCC (x̄±s, n=6)

Skupina	Doziranje/g·kg⁻¹	IL-1 / ng·L⁻¹	IL-18 / ng·L⁻¹	Bcl-2 / ug·L⁻¹
Prazna grupa	-	66.96±16.51	33.28±10.98	0.20±0.05
Grupa modela	-	120.60±11.06²)	56.65±6.62²)	0.43±0.07²)
Grupa Qianliekang	1.54	89.20±7.28⁴)	39.12±4.31⁴)	0.26±0.06⁴)
Visoke doze sirove Zishenwan grupe	5.4	93.60±15.29³)	43.28±6.91³)	0.28±0.06⁴)
Zishenwan grupa prerađena visokim dozama soli	5.4	88.48±11.81⁴)	37.22±5.21⁴)	0.27±0.05⁴)
Niska doza sirove Zishenwan grupe	1.8	103.50±15.79	47.17±9.62	0.33±0.09
Niska doza soli prerađena Zishenwan grupa	1.8	98.03±14.06	46.66±6.32	0.32±0.06

3.4 Metabolomika u serumu Razjašnjavanje mehanizma sinergijske učinkovitosti prerade soli

3.4.1 Multivarijantno statističko modeliranje

PCA dijagrami nisu otkrili uzorke izuzetaka, s uskim grupiranjem QC uzoraka za provjeru stabilne izvedbe LC-MS detekcije. Jasno razdvajanje između slijepe i modelne skupine potvrdilo je ozbiljne poremećaje metaboličke homeostaze u serumu izazvane CP lezijama. Skupine prerađene solju i sirove Zishen Wan skupine djelomično su se preklapale, ali su ostale jasno odvojene od klastera patološkog modela. OPLS-DA modeli postigli su robusnu eksplanatornu i prediktivnu moć (R²Y > 0,6, Q² > 0,6), s permutacijskim testom Q² intercept < 0, potvrđujući pouzdanu izvedbu klasifikacije. Multivarijantni dijagrami priloženi su u dodatnim materijalima.

3.4.2 Identifikacija diferencijalnih serumskih metabolita

Diferencijalni metaboliti ispitani su pomoću OPLS-DA VIP > 1,0 i t-testa P < 0,05:

Prazna proba u odnosu na model: 215 različitih metabolita

Zishen Wan prerađen solju u odnosu na model: 212 različitih metabolita

Sirovi Zishen Wan u odnosu na model: 158 različitih metabolita

Obrađen solju u odnosu na sirovi Zishen Wan: 117 različitih metabolita

Zishen Wan prerađen solju preokrenuo je abnormalne razine 38 ključnih poremećenih metabolita, uključujući 23 zajednička metabolita normalizirana i sirovim i solju prerađenim formulacijama, plus 15 jedinstveno reguliranih metabolita isključivo za Zishen Wan prerađen solju. Potpuni popisi metabolita navedeni su u dodatnim materijalima.

3.4.3 Analiza obogaćivanja KEGG metaboličkog puta

Analiza obogaćivanja svih diferencijalnih metabolita identificirala je 14 osnovnih metaboličkih kaskada obnovljenih Zishen Wan intervencijom, usredotočenih na metabolizam -alanina i indol octene kiseline.

Blanko vs model: Poremećeni putovi uključuju metabolizam pirimidina, metabolizam -alanina, pantotenat i biosintezu CoA;

Sirovi Zishen Wan u odnosu na model: Obnovljeni putovi uključuju metabolizam histidina, metabolizam -alanina, metabolizam triptofana, metabolizam taurina i hipotaurina, metabolizam arahidonske kiseline;

Zishen Wan prerađen solju u odnosu na model: Osam obogaćenih regulacijskih putova: metabolizam pirimidina, biosinteza pantotenata i CoA, metabolizam -alanina, metabolizam histidina, metabolizam taurina i hipotaurina, metabolizam triptofana;

Obrađen solju u odnosu na sirovi Zishen Wan: Diferencijalni putevi usmjereni na metabolizam triptofana, -alanina, histidina i taurina.

Putovi s vrijednošću utjecaja na put > 0,1 integrirani su u dijagrame mjehurića matrice radi intuitivne usporedbe:

-metabolizam alanina: zajednički središnji put reguliran u svim međugrupnim usporedbama;

Biosinteza pantotenata i CoA, metabolizam pirimidina: Jedinstveni regulatorni putevi koje aktivira samo Zishen Wan prerađen solju;

Metabolizam arginina i prolina: ekskluzivna metabolička kaskada modulirana formulacijama prerađenim solju;

Metabolizam triptofana, histidina, taurina: reguliran i sirovim i solju prerađenim Zishen Wan s jačom regulacijskom veličinom u skupinama koje su prerađene solju. Svi podaci o obogaćivanju puta sažeti su u Dodatnu tablicu 6 i dodatne vizualne materijale.

 

Tablica 6. Ključni diferencijalni metaboliti u serumu u CP štakora nakon intervencije s različitim Zishenwan formulacijama

 

Ne.	Metabolit	Kemijska formula	HMDB ID	B/A	C/B	D/B	D/C
1	-Alanin	C3H₇NO₂	HMDB0000056	↓	↑¹)	↑²)	↑¹)
2	Indoloctena kiselina	C₁₀H₉NO₂	HMDB0000197	↓	↑	↑²)	↑
3	Triptofan	C₁₁H₁₂N₂O₂	HMDB0030396	↓	↑¹)	↑²)	↑¹)
4	Gvanidinooctena kiselina	C₃H₇N₃O₂	HMDB0000128	↓	↑	↑¹)	↑
5	Uracil	C₄H₄N₂O₂	HMDB0000300	↓²)	↑²)	↑²)	↑
6	5,6-dihidrouracil	C₄H₆N₂O₂	HMDB0000076	↓¹)	↑	↑²)	↑
7	Asparaginska kiselina	C₄H₇NO₄	HMDB0000191	↓	↑¹)	↑¹)	↑¹)
8	Arginin	C₆H₁₄N₄O₂	HMDB0000517	↓	↑	↑²)	↑
9	Pantotenska kiselina	C₉H₁₇NO5	HMDB0000210	↓	↑	↑¹)	↑²)
10	Urokanska kiselina	C₁₀H₁₂N₂O₃	HMDB0000684	↑	↓¹)	↓¹)	↓
11	Urokinska kiselina	C₁₀H₇NO3	HMDB0000715	↑¹)	↓¹)	↓¹)	↓
12	Palmitinska kiselina	C₁₆H₃₂O₂	HMDB0000220	↑¹)	↓	↓²)	↓
13	Mokraćna kiselina	C₅H₄N₄O₃	HMDB0000289	↑²)	↓	↓	↓²)
14	Prolin	C5H₉NO₂	HMDB0000162	↑	↓	↓²)	↓

Napomena: ↑. Naviše regulirano; ↓. Niže regulirano; A. Prazna grupa; B. Grupa modela; C. Sirova Zishenwan grupa; D. Zishenwan grupa obrađena solju; međugrupna usporedba ¹)str<0.05, ²)P<0.01.

 

3.5 Integrativna mrežna farmakološka i metabolomska analiza

Vennova usporedba 196 KEGG putova iz mrežne farmakologije i 8 metaboličkih putova specifičnih za preradu soli identificirala je dvije glavne kaskade koje se preklapaju: metabolizam triptofana i metabolizam arginin-prolina.

Diferencijalni metaboliti iz skupina Model vs Salt-processed Zishen Wan i Raw vs Salt-processed Zishen Wan uvezeni su u Metscape za konstruiranje mreža "metabolit-reakcija-enzim-gen", identificirajući zajedničke hub gene koji su u skladu s mrežnim farmakološkim terapijskim ciljevima:

Mreža (model u odnosu na Zishen Wan prerađen solju):

Metabolizam triptofana: MAOA, COMT

Metabolizam arginina i prolina: ARG1

Metabolizam tirozina: COMT

De novo sinteza masnih kiselina: FASN

Mreža (Sirovi u odnosu na solju prerađen Zishen Wan): Ponovno obogaćivanje putova sinteze triptofana, tirozina i masnih kiselina, plus nove kaskade: metabolizam purina (MPO, XDH), ciklus trikarboksilne kiseline (IDH1).

Metabolizam triptofana pojavio se kao jedini zajednički put visokog učinka (Utjecaj > 0,1) u obje integrirane omics mreže, što ukazuje na njegovu središnju ulogu u poboljšanoj učinkovitosti prerade soli protiv prostatitisa. Podmreža mapiranja regulatornih interakcija metabolizma triptofana otkrila je preslušavanje između MAOA, COMT i više izoformi CYP450 (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2D6, CYP3A4, CYP19A1). Potpuni dijagrami interaktivne mreže priloženi su u dodatnim materijalima.

 

4 Rasprava

4.1 Prerada soli mijenja biljne kemijske profile kako bi se izgradila baza materijala za zaštitu prostate

LC-MS kemijsko profiliranje potvrdilo je da obrada soli izaziva značajne pomake koncentracije ključnih bioaktivnih spojeva u Zishen Wanu, s istaknutim povećanjem berberina, berberrubina i felodendrina. Postojeća istraživanja pokazuju da berberrubin pojačava ekspresiju bubrežnog OCT2 transportera kako bi poboljšao akumulaciju felodendronskih alkaloida usmjerenu na bubrege, služeći kao temeljni spoj markera koji podupire teoriju TCM-a "vodič biljaka prerađenih solju kroz meridijan bubrega".

 

 

Cistanche tubulosaekstrakt

Posjetite popis za više pojedinosti

 

Služba podrške Wecistanche-Za više detalja o suradnji
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

Berberin i felodendrin su dobro dokumentirane prirodne TCM biljke za upalu prostate: oni potiskuju kaskade PI3K/Akt/mTOR, NF-κB i MAPK povezane s upalom posredovanom CP, intersticijalnom fibrozom i bolovima u zdjelici. Farmakokinetički podaci dalje potvrđuju da obrada soli povećava distribuciju ovih alkaloida u bubrežnom tkivu, postavljajući izravan materijalni temelj za vrhunsku učinkovitost protiv prostatitisa Zishen Wana prerađenog solju.

Za potrošače koji traže samostalnu ili komplementarnu podršku za prostatu, visoka koncentracija naše tvorniceCistanche tubulosaekstrakt savršeno nadopunjuje ovu formulu. Za razliku od obične pustinjske cistanče, našCistanche tubulosaekstraktsadrži znatno više razine feniletanoidnih glikozida (ehinakozid, akteozid), pružajući snažno hranjivo djelovanje na bubrege, protuupalno i zaštitno djelovanje na mokraćni trakt kako bi se pojačale terapeutske koristi Zishen Wana za muškarce s kroničnom nelagodom u prostati. Naš kompletan uvod u proizvodnju i istraživanje i razvoj: https://www.xjcistanche.com/about-us; detaljan vodič za zdravlje cistanche prostate: https://www.xjcistanche.com/news/say-goodbye-to-prostate-problems-with-cistanch-83534746.html.

 

4.2 Zishen Wan prerađen solju ispoljava vrhunske protuupalne i farmakodinamičke učinke za obnavljanje tkiva

IL-1 i IL-18 su terminalni efektorski citokini koje oslobađaju aktivirani NLRP3 inflamasomi, potičući trajnu upalnu infiltraciju kod kroničnog prostatitisa. Prekomjerna ekspresija Bcl-2 inhibira apoptozu upalnih imunoloških stanica, održavajući trajne upalne lezije zdjelice.

In vivo farmakodinamički podaci potvrdili su da i sirovi i solju obrađeni Zishen Wan učinkovito smanjuju povećanje prostate, poništavaju oštećenje žljezdanog tkiva i suzbijaju proupalne IL-1, IL-18 plus anti-apoptotski Bcl-2. Formulacije obrađene solju dosljedno su pokazivale brojčano superiorne terapijske trendove u svim pokazateljima učinkovitosti, potvrđujući da miješanje u soli potencira protuupalni kapacitet formule za simptome CP.

4.3 Prerada soli poboljšava obnavljanje metaboličke homeostaze putem jedinstvenih energetskih i imunoloških metaboličkih putova

Metabolomika u serumu pokazala je da i sirovi i solju prerađeni Zishen Wan obnavljaju poremećeni metabolizam -alanina, podižući razine alanina i aspartata u serumu kako bi se potaknula obrana antioksidansa i sinteza tkivnih proteina za popravak lezija prostate - s jačim učincima normalizacije uočenim u skupinama koje su prerađivale sol.

Jedinstveno, solju obrađen Zishen Wan poništava poremećaje u biosintezi pantotenata-CoA i metabolizmu pirimidina. -alanin i pantotenska kiselina djeluju kao kritični prekursori za sintezu CoA, proces koji pozitivno regulira PI3K/Akt signalizacija. CoA funkcionira kao ključni kofaktor za metabolizam stanične energije i protuupalne reakcije acetilacije; povišeni serumski pantotenat, 5,6-dihidrouracil i -alanin u skupinama koje su tretirane solju ukazuju na to da Zishen Wan modificiran solju aktivira PI3K/Akt kako bi olakšao proizvodnju CoA, obnavljajući ravnotežu stanične energije prostate i ublažavajući upalne ozljede.

4.4 Integrirani Omics otkriva temeljne imuno-metaboličke mehanizme sinergije obrade soli

4.4.1 Metabolizam triptofana: središnja imunološka regulatorna kaskada

Metabolizam triptofana upravlja imunološkom homeostazom i upalnim odgovorom. Njegov metabolit indol octena kiselina djeluje kao AhR ligand za ispoljavanje snažnog protuupalnog djelovanja. Integrirana analiza identificirala je enzime CYP450 (CYP1A1, CYP1B1) kao ključne medijatore koji pretvaraju triptofan u agoniste AhR kako bi uravnotežili omjere Th17/Treg imunoloških stanica i suzbili upalu.

Suprotno tome, višak kinurenina aktivira AhR-STAT3 signaliziranje za induciranje proupalnih IL-6, dok također stimulira PI3K/Akt da pokrene aktivaciju inflamasoma NLRP3 i otpuštanje IL-1. Zishen Wan prerađen solju regulira triptofan u serumu i indol octenu kiselinu dok istovremeno snižava razine kinurenina, modulirajući CYP450, STAT3 i druge ciljne stanice za blokiranje proupalnih kaskada AhR/STAT3 i PI3K/Akt i rebalans imunološke funkcije kod CP lezija.

4.4.2 Metabolizam arginina i prolina: posreduje u obnavljanju tkiva i borbi protiv fibroze

Metabolizam arginina i prolina koordinira razrješenje upale i regeneraciju tkiva. Arginin djeluje kao prekursor za sintezu dušikovog oksida, kreatina i poliamina; gvanidinoacetat služi kao bitan intermedijer za proizvodnju kreatina, koji ima zaštitne učinke na tkivo tijekom upalne ozljede. Zajednički ciljni centar ARG1 katalizira sintezu poliamina kako bi se ubrzao oporavak tkiva prostate.

Zishen Wan prerađen solju podiže razinu arginina i gvanidinoacetata u serumu reguliranjem aktivnosti ARG1 kako bi se potaknula sinteza kreatina i poliamina za zaštitu žlijezda, dok snižava koncentracije prolina u serumu kako bi se spriječilo prekomjerno taloženje kolagena i usporilo napredovanje intersticijske fibroze kod CP.

4.4.3 Dodatne protuupalne metaboličke kaskade jedinstvene za Zishen Wan prerađen solju

Diferencijalna usporedba metabolita između sirovih i soli prerađenih skupina otkrila je dodatne regulacijske putove uključujući de novo sintezu masnih kiselina i metabolizam purina:

Sinteza masnih kiselina: Palmitat, krajnji proizvod ovog puta, aktivira MAPK signaliziranje makrofaga kako bi pokrenuo NLRP3 inflamasomsko otpuštanje IL-1 medijatora boli. Glavni cilj mrežne farmakologije JUN (maktor nizvodne transkripcije MAPK) i FASN (enzim koji ograničava brzinu) zajednički kontroliraju biosintezu palmitata. Zishen Wan prerađen solju smanjuje razine palmitata u serumu ko-supresijom JUN i FASN, blokiranjem MAPK/NLRP3 upalne aktivacije za ublažavanje upale i boli u zdjelici.

Metabolizam purina: povišena serumska mokraćna kiselina u CP odražava upalno oksidativno oštećenje. Zishen Wan prerađen solju snižava XDH i MPO kako bi se smanjilo stvaranje mokraćne kiseline i reaktivnih kisikovih spojeva, ublažavajući oksidativno oštećenje tkiva prostate posredovano neutrofilima.

4.5 Ograničenja istraživanja i budući smjerovi

Dok je Zishen Wan prerađen solju dosljedno nadmašivao sirove formulacije po svim farmakodinamičkim pokazateljima, međuskupinske numeričke razlike nisu dosegle statistički značaj, što se vjerojatno može pripisati individualnim biološkim varijacijama i ograničenoj veličini uzorka. Unatoč tome, dosljedni trend terapijske superiornosti usklađen je s povišenim koncentracijama aktivnih alkaloida i širim regulacijskim kapacitetom metaboličkog puta uočenim u uzorcima prerađenim solju.

Ukratko, prerada soli regulira ključne protuupalne alkaloide u Zishen Wanu, omogućujući višekomponentnu sinergističku supresiju proupalnih signalnih putova PI3K/Akt i MAPK, uz višeciljnu modulaciju kaskada metabolizma triptofana, arginina, pantotenata i masnih kiselina kako bi se sinergistički poboljšalo protuupalno, imunološko regulacijsko djelovanje i obnavljanje tkiva djelotvoran protiv kroničnog prostatitisa.

Ova studija uspostavlja preliminarne molekularne dokaze za klasičnu TCM teoriju "prerada soli vodi bilje do meridijana bubrega". Međutim, glavni ciljevi središta i signalni putovi identificirani putem omics predviđanja zahtijevaju izravnu potvrdu proteina putem Western blot testova; in vivo farmakokinetički pomaci biljnih sastojaka prije i nakon obrade soli ostaju neobilježeni. Naknadno istraživanje će provesti verifikaciju razine proteina predviđenih ključnih ciljeva u kombinaciji s biljnom farmakokinetičkom analizom kako bi se dodatno razjasnila potpuna znanstvena konotacija sinergijske učinkovitosti prerade soli za zdravlje bubrega i prostate.

Za formulatore zapadnih marki koji razvijaju prirodnu TCM biljku za dodatke kroničnog prostatitisa, kombinirajući solju prerađeni biljni ekstrakt Zishen Wan s našom visokom snagomCistanche tubulosaekstrakt pruža dvostruku korist za njegu bubrega i protiv prostatitisa, stvarajući diferencirane muške wellness proizvode skrojene prema potražnji europskih i američkih potrošača za biljnim rješenjima za potporu prostate.

 

Sukob interesa

Autori izjavljuju da nema konkurentskih financijskih interesa.

 

Reference

[1] Zhang CL, Fan LH, Fan SM. Napredak istraživanja o piluli Zishen[J]. Pharm Clin Chin Mater Med, 2019, 10(Z2):59-64. [2] Wang WJ, Yang ZM, Li A. Napredak istraživanja kemijskih sastojaka, farmakoloških učinaka Anemarrhenae Rhizoma i prediktivna analiza njegovih markera kvalitete [J]. China J Chin Mater Med, 2025, 50(4):934-945. [3] Li JQ, Zhang Q, Chen YT. Napredak u farmakološkim učincima demetilenberberina [J]. Chin Pharmacol Bull, 2025, 41(1):7-12. [4] Zhou JH, Ding ZH, Song PR. Protuupalni učinak i mehanizmi cinamaldehida: pregled [J]. Pharmacol Clin Chin Mater Med, 2026, doi:10.13412/j.cnki.zyyl.20250929.009. [5] Su M, Tan FX, Lv J. Studija o materijalnoj osnovi Anemarrhenae Rhizoma-Phellodendri Chinensis Cortex protiv upale na temelju mrežne farmakologije, molekularnog spajanja i eksperimentalne provjere [J]. Nat Prod Res Dev, 2022, 34(4):687-698. [6] Li SL, Lu GG, Zhao YB. Napredak istraživanja u liječenju kroničnog prostatitisa / sindroma kronične boli u zdjelici tradicionalnom kineskom medicinom[J]. China J Chin Mater Med, 2024, 49(10):2648-2653. [7] Fan SM, Yang YX, Zhang CL. Promjene HPLC otiska i komponenata s više indeksa biljnog para Anemarrhenae Rhizoma-Phellodendri chinensis prije i nakon obrade solju [J]. Chin Tradit Pat Med, 2023, 45(3):820-828. [8] Zhang CL, Fan SM, Li X. Komparativna studija o učincima različitih Zishen pilula sastavljenih od sirovog ili slanog Anemarrhenae Rhizoma i Phellodendri Chinensis Cortex na kronični prostatitis i crijevnu floru [J]. Pharmacol Clin Chin Mater Med, 2021, 37(1):34-40. [9] Su XN. Materijalna osnova i farmakokinetička studija Anemarrhenae Rhizoma[D] prerađene solju. Nanjing: Sveučilište kineske medicine Nanjing, 2020. [10] Zhang F, Meng L, Li PP. Razlike u apsorpciji između sirovog i slanom vodom obrađenog Phellodendron chinense u bubrezima štakora [J]. Chin Tradit Pat Med, 2020, 42(11):2954-2959. [11] Fan SM, Zhang CL, Wang JQ. Učinak kompatibilnosti spojnih lijekova Anemarrhenae Rhizoma-Phellodendri Chinensis Cortex na metabolizam glukolipida u štakora s dijabetesom tipa 2 prije i nakon obrade soli [J]. Chin J Exp Tradit Med Form, 2021, 27(3):22-29. [12] Xiong Y, Cheng SY, Zhang DD. Mehanizam Jingangteng kapsula u ublažavanju kroničnog nebakterijskog prostatitisa na temelju crijevne mikrobiote i metabolomike [J]. China J Chin Mater Med, 2025, 50(19):5521-5533. [13] Ge XT. Studija o mehanizmu obrade "Phellodendri Chinensis Cortex obrađenog solju koji ulazi u bubreg" na temelju tehnologije "staničnog unosa-lovljenja liganda" [D]. Shenyang: Sveučilište tradicionalne kineske medicine Liaoning, 2025.