Konzervirani sekretorni protein bogat cisteinom MaCFEM85 stupa u interakciju s MsWAK16 kako bi aktivirao obranu biljaka
Oct 26, 2023
Sažetak: Metarhizium anisopliaeje entomopatogena gljiva koja može poboljšati rast i otpornost biljaka kada djeluje kao endofit u biljkama domaćinima. Međutim, malo se zna o interakcijama proteina ili njihovim mehanizmima aktiviranja. Uobičajeni proteini izvanstanične membrane gljiva (CFEM) identificirani su kao regulatori imunološkog sustava biljaka koji suzbijaju ili aktiviraju reakcije otpornosti biljaka. Ovdje smo identificirali protein koji sadrži domenu CFEM, MaCFEM85, koji je uglavnom lokaliziran u plazma membrani. Dvohibridni test kvasca (Y2H), glutation-S-transferaze (GST) i bimolekularne fluorescentne komplementacijske analize pokazale su da je MaCFEM85 u interakciji s izvanstaničnom domenomMedicago sativa(lucerna) membranski protein, MsWAK16. Analize ekspresije gena pokazale su da su MaCFEM85 i MsWAK16 značajno pojačano regulirani uM. anisopliaeiM. sativa, odnosno od 12 do 60 sati nakon koinokulacije. Dodatni dvohibridni testovi kvasca i mutacija specifična za aminokiselinsko mjesto pokazali su da su CFEM domena i posebno 52. cistein potrebni za interakciju MaCFEM85 s MsWAK16. Ispitivanja obrambene funkcije pokazala su da je JA bio pojačano reguliran, ali veličina lezije Botrytis cinerea i reprodukcija Myzus persicae bili su potisnuti prolaznom ekspresijom MaCFEM85 i MsWAK16 u modelu biljke domaćina Nicotiana benthamiana. Zajedno, ovi rezultati daju nove uvide u molekularne mehanizme koji leže u osnovi interakcija M. anisopliae s biljkama domaćinima.
koristi dodatka cistanche-povećavaju imunitet
Ključne riječi: zidna kinaza; CFEM-ovi; Metahizium anisopliae; imunitet biljaka; Medicago sativa
1. Uvod
Interakcije između biljaka i mikroba su raširene i rezultat su prošle i tekuće koevolucije. Ove interakcije mogu imati ili korisne, neutralne ili negativne ishode za svakog sudionika [1-3]. Korisna rizosferska mikrobiota može pospješiti rast biljaka i poboljšati cjelokupno zdravlje štiteći od bolesti koje se prenose tlom ili povećavajući unos hranjivih tvari [4,5]. Širok raspon korisnih mikroba može poboljšati sposobnosti biljaka kao što su unos hranjivih tvari, rast i obrana od patogena i insekata [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın je važan rod entomopatogenih gljiva sa sposobnošću koloniziranja biljaka [8], ali također postoje dokazi koji upućuju na to da članovi roda mogu povećati otpornost biljnih patogena. Na primjer, laboratorijska studija je otkrila 60% inhibiciju Fusarium solani (Mart.) Sacc. u prisutnosti Metarhizium robertsii (ranije poznat kao M. anisopliae) u usporedbi s kontrolama bez M. robertsii [9]. Neki sojevi Metarhiziuma imaju potencijal poboljšati otpornost biljaka na insekte i bolesti mijenjanjem ekspresije obrambenih gena biljaka. Endofitna kolonizacija s M. Roberts aktivira ekspresiju i jasmonske kiseline (JA) i salicilne kiseline (SA) u lišću kukuruza; nadalje, takva je kolonizacija povezana s poticanjem rasta biljaka i suzbijanjem razvoja ličinki Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Metarhizium guizhouense aktivirao je -1,3-glukanazu i hitinazu u kori voća Lansium parasiticum što je rezultiralo inhibicijom rasta Botrytis sp. i Fusarium sp. na plodu Aglaia dookkoo Griff [11]. Štoviše, kada je M. anisopliae primijenjen na sadnice kikirikija, aktivirali su se različiti transkripcijski faktori uključujući WRKY, MYC, TGA i transkripcijske faktore koji reagiraju na etilen, dok su transporteri nitrata i proteini koji vežu elemente koji reagiraju na dehidraciju također različito izraženi [12] . Ovo sugerira da M. anisopliae regulira obrambene gene biljke dok kolonizira biljku. Međutim, relativno malo se zna o mehanizmima koji leže u pozadini obrambenih odgovora biljaka nakon infekcije Metarhiziumom. Efektori su uobičajeno sredstvo kojim mikroorganizmi reguliraju otpornost biljaka [13]. Aktivacija otpornosti biljaka obično je karakterizirana oksidativnim praskom i indukcijom hormona, metabolita i drugih signala [13]. Biljni hormoni SA i JA igraju važnu ulogu u induciranju otpornosti biljaka, posredujući u dva odvojena obrambena signalna puta [14]. SA signalni put primarno funkcionira u alergijskom odgovoru biljaka i sistemskoj stečenoj otpornosti na patogene, ali također može biti uključen u neizravne obrambene reakcije biljaka izazvane hranjenjem insekata ubodom [15]. Akumulacija SA povezana je s povećanom ekspresijom gena koji kodiraju proteine prijenosa lipida (LTP) i fenilalanin amonijak-liazu (PAL) [16], koji posreduju u sintezi i nakupljanju nizvodno specijaliziranih metabolita kao što su flavonoidi i lignin [17]. JA signalni put funkcionira u izravnim i neizravnim odgovorima na mehanička oštećenja, gljivične patogene i insekte štetočine. Studije su pokazale da JA signalizacija ima regulatorni učinak na sintezu specijaliziranih metabolita kao što su terpenoidi, fenilpropanoidi i alkaloidi, koji imaju širok raspon bioloških funkcija [18]. Pokazalo se da se neki specijalizirani metaboliti nakupljaju u biljnim stanicama nakon tretmana s methylJA (MeJA), uključujući paklitaksel u vrstama Taxus [19,20], terpenoide u Centella Asiatica (L.) Urban [21] i saponine u ginsengu [22] . Primjena SA i hitozana (CHT) kao elicitora inducirala je nakupljanje lignina i reakcije obrambenih enzima u rajčicama, što je smanjilo učestalost infekcije Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi [23]. Osim toga, razine JA i SA u pšenici značajno su akumulirane primjenom elicitora PeaT, pojačavajući obrambenu reakciju na zobenu lisnu uš Sitobion avenae (Fabricius) [24]. To ukazuje da bi biljni imunitet mogao biti reguliran ovim efektorima putem biljnih hormona i metabolita.
cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav
Proteini koji su uobičajeni u izvanstaničnoj membrani gljiva (CFEM) prisutni su u širokom rasponu gljiva. Oni kodiraju domene koje su obično duge 60 aminokiselina (aa) i sadrže osam karakteristično raspoređenih cisteina [25]. CFEM domene slične su domenama sličnim epidermalnom faktoru rasta (EGF), koje funkcioniraju kao izvanstanični receptori, pretvarači signala ili adhezijske molekule u interakcijama domaćin-patogen [26]. Proteini koji sadrže CFEM domene mogu manipulirati reakcijom otpornosti biljaka djelujući kao efektori. U pšeničnoj gljivici hrđe lišća Puccinia triticina Erikas, kandidat za CFEM efektor PTTG_08198 ubrzao je napredak stanične smrti i pospješio nakupljanje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) [27]. Gljiva antraknoza Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils sadrži pet efektora (CgCFEM6, 7, 8, 9 i 15) za koje se pokazalo da suzbijaju BAX-induciranu programiranu staničnu smrt u Nicotiana benthamiana Domin [28]. Prijavljeno je da fitosimbiozna mikorizna gljiva Laccaria bicolor (Maire) PDOrton izlučuje nekoliko CFEM proteina, kao što su Lac310796, Lac296573 i Lac296572, u simbiotska tkiva [29]. Iako složene funkcije ovih proteina nisu dalje proučavane u mikoriznoj simbiozi, prethodni rezultati sugeriraju da CFEM proteini mogu funkcionirati u signalizaciji između gljiva i biljaka. M. anisopliae može djelovati ili kao entomopatogena ili kao endofitna gljiva u biljci domaćinu [30]. Međutim, uloge CFEM proteina još nisu objavljene. Prethodno smo identificirali protein koji sadrži CFEM domenu u M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31]. Ovdje izvještavamo o odnosu između MaCFEM85 i kinaze MsWAK16 povezane sa zidom Medicago sativa. Analizirali smo sekvencu MaCFEM85 i proveli eksperimente kako bismo odredili koji su ostaci kritični za interakciju s MsWAK16. Na kraju, koristeći N. benthamiana kao našu model biljku, procijenili smo obrambene odgovore biljaka na Botrytis cinerea i lisnu uš Myzus persicae sa i bez prolazne ekspresije MaCFEM85 i MsWAK16.
Dobrobiti cistanche tubulosa- ojačati imunološki sustav
Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta
【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2. Rezultati
2.1. MaCFEM85 bio je najbliže povezan s nepatogenim gljivičnim CFEM-ovima i lokaliziran na plazma membranu
Izgrađeno je filogenetsko stablo za analizu odnosa između MaCFEM85 i drugih CFEM proteina iz patogenih i nepatogenih modela gljiva. Među njima su Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl.), Neurospora crassa Shear & BODodge i Beauveria bassiana (Bals.) (vidi Odjeljak 4). MaCFEM85 bio je najbliži srodan s CFEM proteinima u B. bassiana, te stoga evolucijski bliži nepatogenim nego patogenim gljivama (Slika 1a).
Slika 1a
2.2. MaCFEM85 je pojačano reguliran tijekom interakcija s M. sativa
Receptor-like kinaze (WAK) povezane sa zidom predstavljaju podskupinu unutar superfamilije protein kinaza (RLK) i uključuju izvanstaničnu domenu, transmembransku spiralu i intracelularnu kinaznu domenu. Oni igraju važnu ulogu u regulaciji rasta biljaka, razvoja, reakcije na stres i signalnih putova otpornosti na patogene [32]. RNA je ekstrahirana iz hifa M. anisopliae i korijena M. sativa nakon koinkubacije kako bi se istražili obrasci ekspresije MaCFEM85 i MsWAK16. I MaCFEM85 i MsWAK16 eksprimirani su na značajno višim razinama tijekom koinkubacije od 12 do 60 h (Slika 1c,d). Od 0 do 36 sati, ekspresija MaCFEM85 postupno je rasla, dostigavši vrhunac u 36 sati. Bio je × 593 puta jače izražen u kombinaciji M. anisopliae i M. sativa u usporedbi s M. anisopliae uzgojenom samostalno. Iako je ekspresija MaCFEM85 bila neznatno smanjena u razdoblju od 48-60 h, još uvijek je bila izražena na značajno višim razinama nego u M. anisopliae uzgojenoj samostalno. MsWAK16 također je značajno pojačan, s ekspresijom koja je dosegla vrhunac nakon 36 sati. U M. sativa zaraženom s M. anisopliae, MsWAK16 bio je × 89,06 puta jače izražen nego u M. sativa bez M. anisopliae. Od 36 do 60 sati, razine MsWAK16 blago su se smanjile, ali je njegova ekspresija još uvijek bila značajno veća nego u neinokuliranim biljkama.
2.3. MaCFEM85 stupa u interakciju s MsWAK16 in vitro i in vivo
Kako bi se istražio potencijalni funkcionalni mehanizam MaCFEM85 kao odgovor na tretman M. anisopliae, provedeno je dvohibridno (Y2H) ispitivanje kvasca kako bi se preliminarno identificirali proteini domaćina koji su u interakciji s MaCFEM85. Interakcija između izvanstanične domene MsWAK16 (MsWAK16-ED) i MaCFEM85 ispitana je dvohibridnim testom kvasca jedan na jedan upotrebom MaCFEM85 u pGBKT7 kao BD vektoru i MsWAK16 u pGADT7 kao AD vektoru. Svi transformirani kvasci dobro su rasli na podlozi s nedostatkom SD-T/L, a pozitivna kontrolna skupina i eksperimentalna skupina uspješno su rasle na podlozi s nedostatkom SD-T/L/H/A + X- -gal. Ovo je pokazalo da bi MaCFEM85 mogao djelovati u interakciju s MsWAK16-ED (Slika 2a).
Slika 2. Validacija interakcije između MaCFEM85 i MsWAK16.
Za in vitro validaciju, MsWAK16-ED (koji kodira produkt od 60 kDa) označen glutation-S-transferazom (GST) umetnut je u pGEX6-P2, a MaCFEM85 označen polihistidinom (His) ( koji kodira produkt od 17 kDa) umetnut je u pET-21b. Imunoblotiranje s His i GST protutijelima pokazalo je da je rekombinantni protein MaCFEM85-His djelovao u interakciji s GST-MsWAK16-ED plijenom, ali ne i samo s GST-om te da je GST-MsWAK16- ED djelovao u interakciji s His -MaCFEM85 (Slika 2b). Kako bismo dodatno potvrdili interakciju između MaCFEM85 i MsWAK16, proveli smo test bimolekularne fluorescentne komplementacije (BiFC) s MaCFEM85-YFPN i MsWAK16-YFPC konstruktima. Zajednička ekspresija MaCFEM85-YFPN i MsWAK16-YFPC u listovima duhana generirala je žuti fluorescentni signal, što ukazuje da je MaCFEM85 stupio u interakciju s MsWAK16 (Slika 2c).
2.4. Ključna mjesta za interakcije MaCFEM85 i MsWAK16
Kako bi se definirala regija MaCFEM85 koja je potrebna za interakciju s MsWAK16-ED, proteinske domene su predviđene pomoću online softvera SMART (Slika 3a). MaCFEM85 je sadržavao CFEM domenu u 19-86 aa regiji. Predviđena je i tercijarna struktura (Slika 3b). Osam cisteina u ovoj domeni rezultiralo je s četiri disulfidne veze (CYS26 i CYS69, CYS30 i CYS64, CYS43 i CYS50 te CYS52 i CYS85), održavajući stabilnost proteina (Slika 3b). Kako bi se potvrdilo pretpostavljeno mjesto(a) interakcije u MaCFEM85, generirano je sedam mutiranih verzija proteina i umetnuto u pGBKT7 kao proteini mamac. Svaki rekombinantni vektor kotransfektiran je s AD-MsWAK16-ED u soju Y2H Gold. Soj s mutiranim CYS52 nije rastao na selektivnom mediju (Slika 3c, označena crvenom bojom), što ukazuje da je CYS52 potreban za interakciju MaCFEM85 s MsWAK16-ED.
2.5. Interakcija MaCFEM85 s MsWAK16 aktivira imunološki odgovor biljaka
2.5.1. Procjena uloge MaCFEM85 i MsWAK16 u otpornosti na bolesti protiv B. cinerea
Kako bismo istražili moguću uključenost MaCFEM85 i MsWAK16 u obrambene odgovore patogena, ispitali smo može li prekomjerna ekspresija MaCFEM85, MsWAK16 ili MaCFEM85 i MsWAK16 povećati otpornost na B. cinerea. Prolazno smo eksprimirali ove vektore u lišću N. benthamiana. Western blot test pokazao je da su MaCFEM85 i MsWAK16 eksprimirani na usporedivim razinama kada su eksprimirani sami ili zajedno, što pokazuje da su MaCFEM85 i MsWAK16 uspješno eksprimirani u duhanu (Slika 4a). Testovi bolesti također su provedeni pomoću N. benthamiana infiltriranog s MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 ili GFP kontrolom. Lezije su bile značajno manje (za ~30% 2 dana nakon inokulacije) na lišću infiltriranom s MaCFEM85, MsWAK16 ili MaCFEM85+MsWAK16 u usporedbi s kontrolnim biljkama (Slika 4b). Ovi podaci pokazuju da je prolazna ekspresija MaCFEM85 u N. benthamiana donijela povećanu otpornost na B. cinerea i da su MaCFEM85 i MsWAK16 pozitivno regulirali obrambeni odgovor protiv B. cinerea.
Slika 3. Identifikacija mjesta interakcije između MaCFEM5 i MsWAK16.
Slika 4. Indukcija otpornosti biljaka prolaznom ekspresijom MaCFEM85 i MsWAK16.
2.5.2. Procjena uloge MaCFEM85 i MsWAK16 u obrani od lisnih uši kod N. benthamiana
Da bi se dalje istražila uloga MaCFEM85 i MsWAK16, biljke N. benthamiana koje prolazno eksprimiraju MaCFEM85 i MsWAK16 bile su inficirane s M. persicae, te su procijenjene populacije. Za ovaj eksperiment, velika površina svakog lista N. benthamiana je agroinfiltrirana s rekombinantnim binarnim vektorom pYBA1132 koji sadrži MaCFEM85 i MsWAK16. GFP je korišten kao kontrola. 12 sati nakon infiltracije, 20 odrasle jedinke M. persicae stavljene su u kavez na svaki list, izlažući infiltrirano područje lisnim ušima. U sljedeća tri dana zabilježena je smrtnost odraslih lisnih uši i broj nimfi; nimfe su zatim uklonjene. Nije bilo značajne razlike u riziku smrtnosti među populacijama M. persicae koje su se hranile biljkama koje izražavaju MaCFEM85, MsWAK16 ili MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081 ) (Slika 4c). Međutim, nakon 24, 48 i 72 sata, prosječan broj potomaka koje je proizvela svaka odrasla lisna uš bio je znatno veći na N. benthamiana koja je eksprimirala GFP kontrolu u usporedbi s onima koje su eksprimirale MaCFEM85, MsWAK16 ili MaCFEM85+MsWAK16 (Slika 4d).
2.5.3. Procjena uloge MaCFEM85 i MsWAK16 u akumulaciji hormona i ekspresiji gena povezanoj s hormonima
Kako bismo analizirali razlike između obrambenih odgovora biljaka N. benthamiana koje izražavaju eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 i MaCFEM85+MsWAK16, izmjerili smo JA, SA i ukupne razine flavonoida te ekspresiju povezanih gena. Rezultati su pokazali da se razine JA i SA razlikuju između biljaka koje izražavaju eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 i MaCFEM85+MsWAK16 (Slika 5a). U usporedbi s onima koje izražavaju eGFP, razine JA bile su značajno niže u biljkama koje izražavaju MaCFEM85; Razine SA bile su blago povećane, ali razlike nisu bile značajne. Nasuprot tome, biljke koje eksprimiraju MsWAK16 nisu pokazale značajne razlike u razinama JA u usporedbi s kontrolom eGFP, dok su razine SA bile značajno niže nego u kontroli (Slika 5a). Razine JA i SA bile su značajno povećane odnosno smanjene u biljkama koje izražavaju MaCFEM85+MsWAK16 u usporedbi s eGFP.
Slika 5. Razine hormona i ekspresija gena za hormonski odgovor
Ukupni sadržaj flavonoida bio je značajno viši u biljkama koje su eksprimirale MaCFEM85+MsWAK16 u usporedbi sa svim drugim tretiranim skupinama (Slika 5a). Biosintetske razine ekspresije gena bile su slične u biljkama koje eksprimiraju MsWAK16 i MaCFEM85+MsWAK16. Na primjer, geni povezani s JA odgovorom, naime COI1, MYC2 i PDF1.2, bili su značajno pojačano regulirani u usporedbi s biljkama koje izražavaju GFP (Slika 5b). Slično tome, geni NPR1, WRKY70 i PR1 povezani sa SA bili su značajno različito izraženi u biljkama koje eksprimiraju MsWAK16 i MaCFEM85+MsWAK16; NPR1 je bio reguliran prema gore, dok su WRKY70 i PR1 bili regulirani prema dolje u usporedbi s kontrolom (Slika 5b). Također smo ispitali ekspresiju ključnih gena u putevima sinteze šikiminske kiseline i fenilpropanoida, koji su povezani sa sintezom flavonoida. Općenito, sama ekspresija MaCFEM85 nije inducirala značajno veću ekspresiju ovih gena u duhanu. Međutim, ti su geni bili pojačano regulirani u duhanu koji eksprimira MsWAK16 ili MsWAK16+MaCFEM85 u usporedbi s GFP kontrolom (Slika 5c).
cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav
3. Rasprava
3.1. Konzervirani CFEM proteinski motiv služi više funkcija u gljivičnim vrstama
CFEM domena je jedinstvena za gljive i obično se pojavljuje u proteinima izvanstanične membrane gljivica. Domena potječe od najnovijeg zajedničkog pretka Ascomycota i Basidiomycota [33]. Nedavna istraživanja su pokazala da CFEM proteini u gljivičnim patogenima mogu djelovati kao imunološki regulatori biljaka, uzrokujući supresiju ili aktivaciju imunološkog sustava biljke domaćina ovisno o vrsti infekcije [28,34,35]. Bilo je nekoliko izvješća o proteinima koji sadrže CFEM domenu u M. anisopliae, samo u kontekstu evolucijske usporedbe s drugim gljivama [36]. U ovoj studiji usporedili smo CFEM proteine M. anisopliae s drugim poznatim CFEM proteinima u patogenim i nepatogenim gljivama. Potvrdili smo da je najbliži homolog MaCFEM85 Cfem5 pronađen u Beauveria bassiana, jednom od 12 CFEM proteina u toj vrsti (dodatna slika S1). BbCfem5 je neophodan za dobivanje željeza [37]. Štoviše, na temelju predviđene tercijarne strukture, domena CFEM u MaCFEM85 vrlo je slična proteinu površinskog antigena 2 (CSA2) pronađenom u Candida albicans (CPRobin) Berkhout, u kojem je 65 ostataka (96% sekvence) modelirano s 99,8 % pouzdanosti [31]. Candida albicans je životinjski patogen; CSA2 igra važnu ulogu u rastu i patogenosti izdvajanjem hema iz hemoglobina i transportom hema iz stanične stijenke u plazmu [38-40]. Pretpostavljamo da bi MaCFEM85 mogao biti uključen u virulenciju M. anisopliae insekata domaćina. Ove kombinirane funkcije MaCFEM85 kod životinjskih patogenih infekcija i aktivacija biljnog imuniteta čine protein uzbudljivim fokusom budućih istraživanja.
3.2. Disulfidne veze važne su strukture za funkcioniranje proteina
Konformacijski integritet strukture proteina izravno je povezan s njegovom sposobnošću funkcioniranja. Disulfidne veze koje formiraju cisteinski parovi potiču savijanje proteina i konformacijsku stabilnost te se smatra da tvore ključna mjesta za prepoznavanje i vezanje specifičnih receptora ili liganada [41]. Na primjer, prekidanje bilo koje od tri očuvane disulfidne veze u efektorskom proteinu AVR4 biljnog patogena Cladosporium fulvum rezultira osjetljivošću na proteazu i smanjenom sposobnošću vezanja hitina [42]. U tri druga proteina C. fulvum (ECP1, ECP2 i ECP5), pojedinačne supstitucije alanina za cisteine prigušuju preosjetljivi odgovor rajčice, što ukazuje da su cisteini ključni za održavanje stabilnosti i aktivnost koja izaziva preosjetljivi odgovor [43]. Štoviše, u zrelom proteinu MC69 Magnaporthe oryzae, mutageneza dvaju konzerviranih cisteinskih ostataka (Cys36 i Cys46) može oslabiti funkciju MC69 bez utjecaja na sekreciju, što ukazuje na važnost disulfidne veze posebno u patogenosti MC69 [44]. Čini se da je domena CFEM po veličini i uzorku cisteinskih ostataka slična domenama sličnim EGF-u, koje sadrže tri ili četiri para disulfidnih veza. EGF proteini mogu djelovati kao receptori na površini stanice, pretvarači signala ili adhezijske molekule u interakcijama domaćin-patogen [45]. U ovoj studiji ne samo da smo otkrili da CFEM domena MaCFEM85 sadrži osam konzerviranih cisteina koji formiraju četiri para disulfidnih veza (Slika 3b), već smo također potvrdili da je CFEM kritična domena za interakciju između MaCFEM85 i MsWAK16. Nadalje, putem mutacije usmjerene na mjesto cisteinskih ostataka u alanin, otkrili smo da je cisteinski ostatak na položaju 52 središnje mjesto potrebno za interakciju (Slika 3c). Ovi rezultati pružaju osnovu za daljnja istraživanja fizioloških funkcija interakcije CFEM85-WAK16.
3.3. Interakcija MaCFEM85 s MsWAK16 aktiviranom obranom biljaka
U interakcijama između mikroba i biljke, obrambene reakcije biljaka općenito se aktiviraju mikrobnim efektorskim proteinima. Inducirana obrana postaje važan alat u biološkoj kontroli štetnika za promicanje otpornosti. CFEM proteini identificirani su kao efektori uključeni u regulaciju aktivacije ili inhibicije imunološkog sustava biljaka [28,46]. Međutim, malo je objavljenih istraživanja koja povezuju regulaciju ovih imunoloških čimbenika s njihovom specifičnom ulogom u biljnim bolestima i otpornosti insekata. U ovoj studiji upotrijebili smo entomopatogenu i endofitnu gljivicu, M. anisopliae, kako bismo identificirali interakciju između MaCFEM85 i kinaze povezane sa staničnom stijenkom, MsWAK16, u M. sativa. Rezultati su pokazali da je ova interakcija smanjila omjer lezija nakon inokulacije s B. cinerea (Slika 4b) i smanjila stopu rasta populacije M. persicae (Slika 4d), što ukazuje da je interakcija između MaCFEM85 i MsWAK16 povećala otpornost M. sativa na lisne uši. Promjene u razinama JA, SA i etilena (ET) mogu se koristiti kao markeri za procjenu indukcije otpornosti biljaka [47,48]. Ovdje smo pokazali da je MaCFEM85 u interakciji s MsWAK16 kako bi utjecao na otpornost biljaka kroz hormonsku regulaciju i inhibirao stopu reprodukcije M. persicae (Slika 4d). Slične studije su objavljene ranije. Na primjer, pokazalo se da Brevibacillus laterosporus efektorski protein PeBL1 inducira nakupljanje JA i SA u rajčicama i smanjuje stopu rasta druge i treće generacije populacija M. persicae koje su se hranile tim biljkama. Štoviše, biljke rajčice prskane efektorima imaju repelentni učinak na M. persicae [49]. Primjena proteina elicitora PeBC1 na grah (Phaseolus vulgaris L.) dovodi do izraženih i značajnih subletalnih učinaka na zelene breskvine lisne uši. Biljke tretirane s PeBC1 pokazuju značajnu regulaciju gena povezanih s JA i SA [50]. Elicitor Beauveria bassiana PeBb1 smanjuje plodnost M. persicae na duhanu i inducira ekspresiju gena povezanih s JA i ET [51]. U ovoj studiji, prolazna ekspresija MaCFEM85 i MsWAK16 u duhanu značajno je regulirala gene COI1, MYC2 i PDF1.2 povezane s odgovorom na JA (Slika 5b) i povećala JA i ukupni sadržaj flavonoida (Slika 5a), što je bilo usporedivo s rezultatima u literaturi kako je gore opisano. Međutim, nismo otkrili visoke razine SA u duhanu 12 sati nakon infiltracije, a biljke koje prolazno izražavaju MsWAK16 ili MaCFEM85+MsWAK16 pokazale su značajno smanjene razine SA i nižu regulaciju gena uključenih u odgovor SA (Slika 5a,b) . Ovo je pokazalo da stimulacija različitih biljnih hormona može dovesti ne samo do sinergističkih aktivnosti, već i do preslušavanja i povratne sprege, omogućujući biljkama da odgovarajuće odgovore na različite podražaje. U biljkama su ranije zabilježene povećane razine JA, ali niske razine SA. Na primjer, u A. thaliana s defektom za nakupljanje SA, razine JA bile su 25-puta više nego u divljeg tipa A. thaliana, a geni koji reagiraju na JA bili su aktivirani [52]. Također je objavljeno da neke bakterije mogu povećati razine JA u biljkama kako bi spriječile nakupljanje SA, izbjegavajući štetu uzrokovanu SA. Na primjer, Pseudomonas syringae cilja na COI1 receptor putem toksina, coronatine, koji negativno regulira JA put [53]. Ovo promiče MYC2-induciranu regulaciju transkripcijskih faktora ANAC019, ANAC055 i ANAC072 [54], inhibirajući transkripciju ICS1 (ključnog gena za sintezu SA) i tako smanjujući proizvodnju SA i transdukciju signala. U ovoj studiji, interakcija između MaCFEM85 i MsWAK16 dovela je do povećane akumulacije JA i pojačane regulacije gena koji reagiraju na JA, ali inhibicije akumulacije SA i transkripcije gena povezanih sa SA. To je pokazalo da je interakcija između MaCFEM85 i MsWAK16 inducirala JA, čime se poboljšava otpornost biljaka na lisne uši.
U N. benthamiana koja prolazno eksprimira MaCFEM85 i MsWAK16, razine JA bile su povećane, a veličina lezija B. cinerea smanjena (Slika 4b), u skladu s prethodnim studijama. JA je uključen u otpornost biljaka na insekte i nekrotrofne patogene [52,55]. Kao nekrotrofni patogen, B. cinerea je inhibirana nakupljanjem JA i ET [56]. U A. thaliana ET-deficijentan mutant ein2-1 i JA-odgovor mutant coi1-1, razine nizvodnog obrambenog gena, PDF1.2 bile su značajno smanjene, a osjetljivost na B. cinerea bila je pojačana [ 57]. Ovdje smo otkrili da su akumulacija JA i transkripcija gena povezanih s JA bili značajno povećani u N. benthamiana koja prolazno izražava MaCFEM85 i MsWAK16, dok su akumulacija SA i transkripcija gena povezanih sa SA bili inhibirani. Ekspresija MaCFEM85 i MsWAK16 također je pokazala inhibitorni učinak na B. cinerea. To je pokazalo da su JA aktivirali MaCFEM85 i MsWAK16 i da je imao vodeću ulogu u otpornosti biljaka na B. cinerea.
4. Materijali i metode
4.1. Sojevi gljiva, biljni materijali i metode uzgoja
Sojevi izolata Metarhizium anisopliae Ma 9 uzgajani su na mediju krumpir-šećer-agar (PSA) (200 g ekstrakta oguljenog krumpira kuhanog u vodi, 20 g saharoze i 15 g agara/L). Svježi prah sporangija sakupljen je nakon 10 dana. Biljke Nicotiana benthamiana uzgajane su u umjetnoj klimatskoj komori s ciklusom svjetlo/tama 14/10 h (27/25 ◦C). Za prolaznu ekspresiju gena preko Agrobacterium-posredovane transformacije, Agrobacterium tumefaciens soj GV3101 je uzgajan u mediju Luria Broth (LB) (10 g triptona, 5 g ekstrakta kvasca i 10 g NaCl/L). Soj kvasca Gold (OE Biotech Co., Ltd., Šangaj, Kina) uzgojen je na mediju peptonske dekstroze (YPDA) ekstrakta kvasca (10 g ekstrakta kvasca, 20 g peptona, 20 g glukoze i 0,03 g adenin hemisulfata/L). Za svaki vektor i soj korišteni su odgovarajući antibiotici, naime rifampin, kanamicin ili ampicilin (25, 50, odnosno 50 µg/mL). Sojevi i plazmidi korišteni u ovoj studiji navedeni su u Dodatnoj tablici S1. Sjeme Medicago sativa površinski je sterilizirano 75% etanolom 1 minutu, a zatim 50% NaClO (5,5%) 15 minuta. Sjemenke su temeljito promiješane i zatim isprane u sterilnoj vodi tri puta po 5 minuta. Sjemenke su inkubirane na 4 ◦C u mraku više od 24 sata, zatim su klijale na pločama s 1% vodenim agarom na sobnoj temperaturi preko noći. Tri dana nakon klijanja, klijanci u razvoju prebačeni su na filter papir na 9-cm sterilne petrijeve zdjelice, s 20 klijanaca po zdjelici. Tretmani i kontrola raspoređeni su u po 15 posuda. Sadnice su zatim navodnjavane s 10 mL suspenzije spora M. anisopliae koja sadrži 107/mL, a kontrola je navodnjavana s 10 mL sterilne vode. U 0, 12, 24, 48 i 60 h, nasumično odabrane sadnice su uzete iz tri petrijeve zdjelice za svaki vremenski interval. Uzorci su zamrznuti u tekućem dušiku i pohranjeni na -80 ◦C.
4.2. qRT-PCR i konstrukcija plazmida
Ukupna RNA ekstrahirana je iz M. anisopliae (hife) i M. sativa (korijen) s TRIzol reagensom (Invitrogen, CA, SAD) prema uputama proizvođača. Kvaliteta i obilje dobivene RNA izmjereni su NanoPhotometrom® (Implen, München, Njemačka). Sinteza prvog lanca cDNA (do 2 ug RNA) izvedena je korištenjem 5× All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Kanada) prema uputama proizvođača. qRT-PCR je izveden korištenjem 2×SYBR Green qPCR Master Mixa iz US EVER BRIGHT ® INC. i ABI QuantStudio 5 sustava prema uputama proizvođača. Početnice koje se koriste za svaki gen navedene su u Dodatnoj tablici S2. Maury [58], Msactin [59] i Nbactin [60] korišteni su kao interni referentni geni za normalizaciju podataka o ekspresiji. Reakcija je izvedena pod sljedećim uvjetima: 5 minuta na 95 ◦C, nakon čega je uslijedilo 40 ciklusa na 95 ◦C tijekom 15 s i na 60 ◦C tijekom 40 s. Postojale su tri tehničke replike za svaki uzorak. Relativni izraz izračunat je metodom 2−∆∆Ct [61]. Statistička značajnost određena je pomoću jednosmjerne analize varijance (ANOVA) i Duncanovog višestrukog testa u SPSS v20.0 (SPSS).
4.3. Prolazna ekspresija proteina u N. benthamiana
MaCFEM85 kodirajuća sekvenca (CDS) je pojačana ultra-vjernom DNA polimerazom korištenjem cDNA kao kalupa. Za testove subcelularne lokalizacije, PCR proizvodi koji sadrže CDS za MaCFEM85 klonirani su u pYBA1132-eGFP (probavljen s EcoRI i SalI) odnosno pcambia1300-trešnja (EcoRI i SacI). Svi su konstrukti potvrđeni sekvenciranjem (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Peking, Kina). Primeri korišteni u ovoj studiji navedeni su u Dodatnoj tablici S2. Za prolaznu ekspresiju MaCFEM85-eGFP i MaCFEM85-mCherry u N. benthamiana, A. tumefaciens soj GV3101 transformiran je sa svakim plazmidom i potvrđen PCR-om. Agrobacterium je uzgajan preko noći na 28 ◦C uz mućkanje. Stanice su sakupljene 5 minuta centrifugiranja na 5000 okretaja u minuti na sobnoj temperaturi, isprane tri puta sa sterilnom dvostruko destiliranom vodom i resuspendirane u 10 mM MgCl2 puferu (koji sadrži 10 mM MES i 10 mM acetosiringona, pH 5,7). Suspenzija stanica je podešena na OD600 od 0,5, zatim je infiltrirana u donju stranu 4- do 5-tjedno starih listova N. benthamiana sa 1-mL štrcaljkom. Svaki list je infiltriran s 50 uL A. tumefaciens; tri su lista tretirana po biljci i tri su biljke bile u svakoj tretiranoj skupini. Tretirano lišće sakupljeno je nakon 30 sati i vizualizirano konfokalnim mikroskopom Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Njemačka) kako bi se odredila substanična lokalizacija.
dobrobiti cistanche za muškarce-jačanje imunološkog sustava
4.4. Filogenetska analiza
Filogenetsko stablo konstruirano je pomoću metode spajanja susjeda u MEGA X. 1000 replika za pokretanje koristilo je model P-udaljenosti. Aminokiselinske sekvence korištene za generiranje stabla dobivene su BLASTP pretraživanjem prema NCBI bazi podataka srodnih gljiva (npr. Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus, Lasiodiplodia theobromae, Gliocladium roseum , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana i Paecilomyces lilacinus) koristeći MaCFEM85 kao upit.
4.5. Dvohibridni testovi kvasca
Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech Laboratories, Inc.; sada Takara Bio USA, Inc.) korišten je za provjeru interakcije između MaCFEM85 i MsWAK16. MaCFEM85 bez signalnog peptida umetnut je u pGBKT7 kao mamac, a izvanstanična domena MsWAK16 (MsWAK16-ED) umetnuta je u pGADT7 kao plijen. Priprema stanica kompetentnih za kvasce i transformacije provedene su korištenjem Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, SAD) prema uputama proizvođača. Plazmidi mamca i plijena ko-transformirani su u soj kvasca Gold. Interakcije protein-protein analizirane su na temelju rasta na pločama SD dvostrukog ispadajućeg medija (DDO, SD/-Trp-Leu) i SD četverostrukog ispadajućeg medija (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade).
4.6. BiFC test
Za generiranje BiFC konstrukata, pUC-SPYNE i pUC-SPYCE vektori su linearizirani digestijom s BamHI. CDS pune duljine MaCFEM85 i MsWAK16 svaki je kloniran i umetnut u linearizirane plazmide pomoću rekombinantnog enzima da bi se dobili MaCFEM85-YFPN i MsWAK16-YFPC konstrukti. Plazmidi koji sadrže MaCFEM85 i MsWAK16 ko-transformirani su s praznim vektorima kao negativnim kontrolama (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE i pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Svi vektori su uvedeni u N. benthamiana putem transformacije posredovane Agrobacterium kako je gore opisano. Fluorescencijski signali promatrani su u epidermalnim stanicama lista korištenjem konfokalnog mikroskopa Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Njemačka). Primeri korišteni za konstrukciju vektora navedeni su u Dodatnoj tablici S2.
4.7. GST Pull-Down test
Za GST padajuće testove, MsWAK16-ED je umetnut u pGEX-6P-2 vektor, a MaCFEM85 je umetnut u pET-21b. Pročišćeni fuzijski proteini (GST- MsWAK16- ED) i pGEX-6P-2 protein bez opterećenja (GST) korišteni su kao protein mamac i pročišćeni pET-21 b-MaCFEM85 fuzijski protein (His-MaCFEM85) korišten je kao plijen. GST testovi padanja provedeni su s Mag-Beads GST Fusion sustavom za pročišćavanje proteina (Sangon Biotech, Šangaj, Kina) prema uputama proizvođača. Ukratko, Mag-Beads su isprani pet puta s 1 × fosfatno puferiranom fiziološkom otopinom (PBS, pH 7,4) kako bi se oslobodio alkoholni protektor, a zatim je dodano 10 mL GST ili GST-MsWAK16-ED. Kuglice su miješane inverzijom na sobnoj temperaturi 30 minuta. Nakon uklanjanja supernatanta, Mag-beads su isprani pet puta s 1x PBS. His-MaCFEM85 je dodan u Mag-Beads već vezan s GST, a smjesa je inkubirana preko noći na 4 ◦C uz rotaciju. Kuglice su zatim isprane pet puta s 1x PBS da se uklone nevezani proteini. Zatim su proteini imobilizirani na zrncima odvojeni SDS-PAGE, prebačeni na nitroceluloznu membranu (100 V, 1 h) i analizirani Western blotom. Membrane su isprane tri puta po 10 minuta s PBS + Tween (PBST). Membrane su blokirane 2 sata na sobnoj temperaturi s 5% obranim mlijekom, zatim inkubirane s ProteinFind anti-His mišjim monoklonskim protutijelom (TransGen Biotech, Peking, Kina) (razrijeđeno 1:3000) ili ProteinFind anti-GST mišjim monoklonskim protutijelom tijekom 2 h na 4 ◦C. Membrane su zatim uronjene u ProteinFind kozje anti-zečje IgG(H+L) (HRP) antitijelo (TransGen Biotech, Peking, Kina) (razrijeđeno 1:5000) na 1 sat na sobnoj temperaturi. Membrane su vizualizirane EasySee® Western Blot kompletom (TransGen Biotech, Peking, Kina) prema uputama proizvođača.
4.8. Identifikacija ključnog mjesta u MaCFEM85
Kako bi se odredila veličina potrebna za interakciju MaCFEM85 s MsWAK16, izvedena je PCR amplifikacija kako bi se generirali višestruki skraćeni oblici MaCFEM85. CFEM domena (MaCFEM85-CFEM; aa ostaci 19–86) i C terminal bez CFEM domene (MaCFEM85-C, aa ostaci 87–170) umetnuti su u vektor pGBKT7 kao protein mamac (dodatna tablica S1). Drugih pet varijanti konstruirano je pomoću sinteze polipeptida za mutaciju cisteina u alanin na pozicijama 26, 30, 43, 52 i 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8543, ∆ CFEM8552, odnosno ∆CFEM858). Ove su varijante korištene za izvođenje Y2H eksperimenata s MsWAK16-ED. Transformirane stanice kvasca ispitane su na rast na sintetičkim ispadajućim SD/-Trp-Leu pločama i SD/-Trp-Leu-His-Ade pločama koje sadrže X- -galaktozidazu (X- -Gal).
4.9. Testovi otpornosti biljaka
Myzus persicae dobivene su od Henan Quanying Biological Co., Ltd. Tjedan dana prije početka bioloških testova, 150 odraslih lisnih uši stavljeno je na tri biljke N. benthamiana (50 lisnih uši po biljci). Nakon 72 h, sve su odrasle jedinke uklonjene mekim umjetničkim kistom, a nimfama je ostavljeno da se hrane dodatna četiri dana prije nego što su prebačene u N. benthamiana radi ispitivanja performansi lisnih ušiju.
4.10. Ispitivanja učinka lisnih ušiju
Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) korišten je za procjenu učinka M. persicae, otpornosti biljaka na bolesti protiv B. cinerea i ekspresije gena povezanih s hormonima. Agrobakterije koje nose ili pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 ili pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 uzgajane su u LB-u uz dodatak odgovarajućih antibiotika 36 h na 28 ◦C. Stanice su isprane tri puta, zatim resuspendirane u puferu za infiltraciju (10 mM MgCl2, 10 mM MES i 100 µM acetosiringona, pH 5,6) do OD600 od 0,6. Za koinfekciju, bakterije koje nose MaCFEM85 i MsWAK16 podešene su na OD600 od 1,2, a zatim pomiješane u jednakim volumenima. Potpuno prošireni listovi infiltrirani su bakterijama pomoću 1-mL štrcaljki bez igle. Tri lista su infiltrirana na svaku biljku i svaki tretman je primijenjen na tri biljke za ukupno 12 biljaka po eksperimentu.
Za ispitivanje učinkovitosti lisnih uši, 20 odraslih lisnih uši primijenjeno je na infiltrirano područje svakog lista 12 sati nakon primjene Agrobacterium. Lisne uši su zatvorene korištenjem kaveza sa stezaljkama promjera 5 mm. Svaki tretman je ponovljen pet puta. Smrtnost odraslih lisnih uši i broj novopoloženih nimfi bilježeni su svakodnevno tijekom tri dana. B. cinerea je uzgajana pet dana na PDAY. 12 h nakon infiltracije Agrobacteriumom, novouzgojena B. cinerea je probijena u 5- mm kolač gljive, a površina za rast micelija je pričvršćena za područje infiltracije na površini lista. Kako bi se olakšao razvoj bolesti, biljke su održavane vlažnima pokrivajući ih plastičnom folijom u posudama na 22 ◦C kako bi se olakšalo napredovanje bolesti. Nakon 48 sati, napredak bolesti procijenjen je u inokuliranom lišću mjerenjem veličine lezija. Za kvantificiranje relativne ekspresije relevantnih gena, tri infiltrirana lista sakupljena su iz svake biljke 12 sati nakon infiltracije, zatim zamrznuta u tekućem dušiku i pohranjena na -80 stupnjeva. Ekstrakcija ukupne RNA, sinteza cDNA i qRT-PCR provedeni su kako je opisano u odjeljku 3.2. Razine salicilne kiseline (SA), jasmonske kiseline (JA) i flavonoida izmjerene su u 15 infiltriranih listova N. benthamiana po tretmanu. Listovi su sakupljeni, zamrznuti u tekućem dušiku, zatim pohranjeni na -80 stupnjeva. Biljni hormoni kvantificirani su pomoću kompleta ELISA za biljne salicilne kiseline i biljne jasmonske kiseline (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.), a flavonoidi su kvantificirani pomoću kompleta za analizu mikro biljnih flavonoida (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) nakon upute proizvođača.
4.11. Statistička analiza
Podaci su analizirani u SPSS v20.0. Značajne razlike u razinama ekspresije MaCFEM85 i MsWAK16 određene su Studentovim t-testom. Značajne razlike u razinama SA, JA i flavonoida utvrđene su pomoću jednosmjerne ANOVA-e i Duncanovog testa višestrukog raspona s pragom od p < 0,05.
5. Zaključci
U ovoj smo studiji identificirali i karakterizirali novi izlučeni protein, MaCFEM85, u M. anisopliae. Utvrđeno je da je to konzervirani efektor koji može komunicirati s MsWAK16 i aktivirati obrambeni odgovor N. benthamiana. Pokazali smo da su domena CFEM i cisteinski ostatak na poziciji 52 u MaCFEM85 kritični za interakciju. Ova interakcija može aktivirati imunološke odgovore povezane s JA i mehanizme otporne na bolesti i insekte u biljci.
Reference
1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, LA; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Kilmurray, C.; Bueno, MA; García, MB; Dardanelli, MS Partnerstvo biljaka i mikroba: Implikacije za rast i zdravlje biljaka. U simbioza biljnih mikroba: osnove i napredak; Springer: Berlin/Heidelberg, Njemačka, 2013.; str 105–117. [CrossRef]
2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Razotkrivanje interakcija biljaka i mikroba: može li transkriptomija više vrsta pomoći? Trendovi Biotehnologija. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]
3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Nahranite svoje prijatelje: oblikuju li biljni izlučevine korijenski mikrobiom? Trends Plant Sci. 2018, 23, 25–41. [CrossRef]
4. Lugtenberg, B.; Kamilova, F. Rizobakterije koje potiču rast biljaka. Annu. Rev. Microbiol. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]
5. Shoresh, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Inducirana sustavna otpornost i odgovor biljaka na sredstva za biokontrolu gljivica. Annu. Rev. Phytopathol. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]
6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Dicke, M.; Raaijmakers, JM Metaboličke i transkriptomske promjene izazvane u Arabidopsis rhizobacterium Pseudomonas fluorescens SS101. Plant Physiol. 2012., 160, 2173–2188. [CrossRef]
7. Lareen, A.; Burton, F.; Schafer, P. Komunikacija korijena biljke i mikroba u oblikovanju mikrobioma korijena. Biljka Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]
8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Insekto-patogena gljiva Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) također je endofit koji stimulira razvoj korijena biljke. Am. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [CrossRef]
10. Sasan, RK; Bidochka, MJ Antagonizam endofitne insektne patogene gljive Metarhizium robertsii protiv patogena biljke graha Fusarium solanif. sp. phaseoli. Limenka. J. Plant Pathol. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]
10. Ahmad, I.; Jiménez-Gasco, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endofitski Metarhizium robertsii potiče rast kukuruza, suzbija rast insekata i mijenja ekspresiju obrambenog gena biljke. Biol. Control 2020, 144, 104167. [CrossRef]
11. Chairin, T.; Petcharat, V. Indukcija obrambenih odgovora u hongkonškom voću (Aglaia dookkoo Griff.) protiv gljivica truleži voća pomoću Metarhizium guizhouense. Biol. Kontrola 2017, 111, 40–44. [CrossRef]
12. Hao, K.; Wang, F.; Nong, X.; McNeill, MR; Liu, S.; Wang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Odgovor korijena kikirikija Arachis hypogaea na prisutnost korisnih i patogenih gljiva analizom transkriptoma. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]
14. Patel, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM Poglavlje 11—Uloga elicitora gljivica u obrambenom mehanizmu biljaka. U Molekularni aspekti korisnih mikroba za biljke u poljoprivredi; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., ur.; Academic Press: Cambridge, MA, SAD, 2020.; str 143–158. [CrossRef]
14. Dong, X.; Sa, JA Etilen i otpornost biljaka na bolesti. Curr. Opin. Plant Biol. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]
15. Thomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Odvojeni putovi obrambenog odgovora ovisni o jasmonatu i salicilatu kod Arabidopsisa ključni su za otpornost na različite mikrobne patogene. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]
16. Pant, SR; Irigoyen, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Phenylalanine ammonia lyase (PAL) Promiče antivirusnu obranu protiv virusa Panicum mozaika i njegovih satelita. mBio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]
17. Liu, R.; Xu, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Profil ekspresije PAL gena iz Astragalus membranaceus var. Mongholicus i njegova ključna uloga u protoku u biosintezu flavonoida. Plant Cell Rep. 2006, 25, 705–710. [CrossRef]
18. De Geyter, N.; Gholami, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Transkripcijski strojevi u sekundarnom metabolizmu biljaka izazvanom jasmonatom. Trends Plant Sci. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]
20. Mirjalili, N.; Linden, JC Učinci sastava plinske faze na suspenzijske kulture Taxus cuspidata. biotehnologija. bioinž. 1995., 48, 123–132. [CrossRef]
20. Li, ST; Zhang, P.; Zhang, M.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Transkripcijski profil stanica taxus chinensis kao odgovor na metil jasmonat. BMC Genom. 2012, 13, 295. [CrossRef]
22. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Steenkamp, PA; Dubery, IA Metabolomics izvedeni uvidi u manipulaciju sinteze terpenoida u stanicama Centella asiatica pomoću metil jasmonata. Biljna biotehnologija. Rep. 2015, 9, 125–136. [CrossRef]
22. Lu, M.; Wong, H.; Teng, W. Učinci izazivanja na proizvodnju saponina u staničnoj kulturi Panax ginsenga. Plant Cell Rep. 2001, 20, 674–677. [CrossRef]
23. Mandal, S.; Kar, I.; Mukherjee, AK; Acharya, P. Elicitor-inducirani obrambeni odgovori u Solanum lycopersicum protiv Ralstonia solanacearum. Sci. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]
24. Li, L.; Wang, S.; Yang, X.; Franjo, F.; Qiu, D. Proteinski elicitor PeaT1 pojačao otpornost protiv lisnih uši (Sitobion avenae) u pšenici. Upravljanje štetočinama Sci. 2020., 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]
25. Bujalowski, W. Proširenje fiziološke uloge heksamerne DnaB helikaze. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]
27. Vaknin, Y.; Shadkchan, Y.; Levdansky, E.; Morozov, M.; Romano, J.; Osherov, N. Tri Aspergillus fumigatus CFEM-domena GPI-usidrena proteina (CfmA-C) utječu na stabilnost stanične stijenke, ali ne igraju ulogu u virulenciji gljivica. Gljivične. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]
27. Zhao, S.; Shang, X.; Bi, W.; Yu, X.; Liu, D.; Kang, Z.; Wang, X.; Wang, X. Genome-Wide Identification of effector kandidata s očuvanim motivima iz pšenične lisne hrđe gljive Puccinia triticina. Ispred. Microbiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]
28. Gong, A.; Jing, Z.; Zhang, K.; Tan, Q.; Wang, G.; Liu, W. Bioinformatska analiza i funkcionalna karakterizacija CFEM proteina u gljivici kukuruzne antraknoze Colletotrichum graminicola. J. Integr. Agric. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]
30. Martin, F.; Aerts, A.; Ahren, D.; Brun, A.; Danchin, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V.; et al. Genom Laccaria bicolor pruža uvid u mikoriznu simbiozu. Nature 2008, 452, 88–92. [CrossRef]
31. Stefan, V.; Lara, RJ Entomopatogene gljive kao endofiti: Interakcije biljaka, endofita i biljojeda i izgledi za upotrebu u biološkoj kontroli. Curr. Sci. 2015, 109, 46–54.
31. Cai, N.; Liu, R.; Yan, D.; Zhang, N.; Zhu, K.; Zhang, D.; Nong, X.; Tu, X.; Zhang, Z.; Wang, G. Bioinformatička analiza i funkcionalna karakterizacija CFEM proteina Metarhizium anisopliae. J. Gljive. 2022, 8, 661. [CrossRef]
32. Stephens, C.; Hammond-Kosack, KE; i Kanyuka, K. WAKsing biljni imunitet, slabljenje bolesti. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]
33. Zhang, ZN; Wu, QY; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z.; Zou, CG Sustavne analize otkrivaju jedinstvenost i porijeklo CFEM domene u gljivama. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]
34. Fang, A.; Gao, H.; Zhang, N.; Zheng, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Zhou, S.; Cui, F.; Sun, W. Novi efektorski gen SCRE2 doprinosi punoj virulenciji Ustilaginoidea virens na rižu. Ispred. Microbiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]
35. Zhu, W.; Wei, W.; Wu, Y.; Zhou, Y.; Peng, F.; Zhang, S.; Chen, P.; Xu, X. BcCFEM1, protein koji sadrži domenu CFEM s navodnim mjestom usidrenim za GPI, uključen je u patogenost, proizvodnju konidija i otpornost na stres kod Botrytis cinerea. Ispred. Microbiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]
36. Xu, X.; Li, G.; Li, L.; Su, Z.; Chen, C. Usporedna analiza genoma navodnih Pth11-srodnih G protein-spregnutih receptora u gljivama koje pripadaju Pezizomycotina. BMC Microbiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]
37. Peng, YJ; Hou, J.; Zhang, H.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH Sustavni doprinosi proteina koji sadrže domenu CFEM u preuzimanju željeza ključni su za interakciju među vrstama filamentozne patogene gljive Beauveria bassiana. okoliš. Microbiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]
38. Roy, U.; Kornitzer, D. Stjecanje hem željeza u gljivama. Curr. Opin. Microbiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]
39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, član obitelji proteina Rbt5, uključen je u iskorištavanje željeza iz ljudskog hemoglobina tijekom rasta hifa Candide albicans. FEMS Kvasac Res. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]
40. Perez, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Casanova, M.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Formiranje biofilma mutantima Candide albicans za gene koji kodiraju proteine gljivica koji pokazuju CFEM domenu koja sadrži osam cisteina. FEMS Kvasac Res. 2006, 6, 1074–1084. [CrossRef]
41. Hogg, PJ Disulfidne veze kao prekidači za funkciju proteina. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 210–214. [CrossRef]
42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Roth, R.; Woestenenk, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Mutanti AVR4 patogena rajčice Cladosporium fulvum s poremećenom prirodnom disulfidnom vezom osjetljivi su na proteolizu, zaobilaze otpornost posredovanu Cf-4-, ali zadržavaju svoju sposobnost vezanja hitina. J. Biol. Chem. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Zhang, J.; Xia, F.; Ključ.; Zhang, H.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; et al. Poboljšanje višestrukih agronomskih svojstava pomoću gena otpornosti na bolesti putem ojačanja stanične stijenke. Nat. Plants 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]
44. Saitoh, H.; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; et al. Poremećaj gena velikih razmjera kod Magnaporthe oryzae identificira MC69, izlučeni protein potreban za infekciju gljivičnim patogenima jednosupnica i dvosupnica. PLoS Patog. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]
45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. CFEM domena koja sadrži osam cisteina jedinstvena za skupinu gljivičnih membranskih proteina. Trends Biochem. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]
46. Peng, J.; Wu, L.; Zhang, W.; Zhang, Q.; Xing, Q.; Wang, X.; Li, X.; Yan, J. Sistemska identifikacija i funkcionalna karakterizacija uobičajenih proteina izvanstanične membrane gljivica u Lasiodiplodia theobromae. Ispred. Plant Sci. 2021, 12, 804696. [CrossRef]
48. Bari, R.; Jones, JD Uloga biljnih hormona u obrambenim reakcijama biljaka. Biljka Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]
49. Verma, V.; Ravindran, P.; Kumar, PP Regulacija odgovora na stres posredovana biljnim hormonima. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [CrossRef]
50. Javed, K.; Qiu, D. Protein elicitor PeBL1 od Brevibacillus laterosporus povećava otpornost protiv Myzus persicae u rajčici. Pathogens 2020, 9, 57. [CrossRef]
50. Basit, A.; Hanan, A.; Nazir, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. Molekularna i funkcionalna karakterizacija elicitora PeBC1 ekstrahiranog iz Botrytis cinerea koji je uključen u indukciju otpornosti protiv zelene breskvine lisne uši (Myzus persicae) kod graha (Phaseolus vulgaris L.). Insekti 2019, 10, 35. [CrossRef]
52. Nazir, T.; Hanan, A.; Basit, A.; Majeed, MZ; Anwar, T.; Nawaz, I.; Qiu, D. Pretpostavljena uloga još neokarakteriziranog proteinskog elicitora PeBb1 Izvedeno iz soja Beauveria bassiana ARSEF 2860 protiv Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) u Brassica rapa ssp. pekinensis. Pathogens 2020, 9, 111. [CrossRef]
52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Claessens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Mueller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, JP; Brown, R.; Kazan, K.; et al. NPR1 modulira unakrsne razgovore između obrambenih putova ovisnih o salicilatu i jasmonatu kroz novu funkciju u citosolu. Biljna stanica 2003, 15, 760–770. [CrossRef]
53. Xin, XF; He, SY Pseudomonas syringae pv. rajčica DC3000: model patogena za ispitivanje osjetljivosti na bolesti i signalizaciju hormona u biljkama. Annu. Rev. Phytopathol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]
54. Zhang, X.; Wang, C.; Zhang, Y.; Sun, Y.; Mou, Z. Podjedinica16 posredničkog kompleksa Arabidopsis pozitivno regulira sistemsku stečenu otpornost posredovanu salicilatom i obrambene putove izazvane jasmonatom/etilenom. Biljna stanica 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]
55. Doares, SH; Narvaez-Vasquez, J.; Conconi, A.; Ryan, CA Salicilna kiselina inhibira sintezu inhibitora proteinaze u lišću rajčice induciranu sisteminom i jasmonskom kiselinom. Plant Physiol. 1995., 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]
56. Pieterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC Umrežavanje hormona malih molekula u imunitetu biljaka. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]
57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Buchala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF Za indukciju gena biljnog defenzina u Arabidopsisu potrebna je istodobna aktivacija jasmonatnih i etilenskih odgovornih putova. Biljna stanica 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]
58. Fang, W.; Bidochka, MJ Ekspresija gena uključenih u klijanje, konidiogenezu i patogenezu u Metarhizium anisopliae korištenjem kvantitativne RT-PCR u stvarnom vremenu. Mycol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]
60. Guerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Ekspresija gena alfalfa celulozne sintaze pod abiotičkim stresom: Autostoperski vodič za normalizaciju RT-qPCR. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]
60. Yang, Y.; Zhang, Y.; Li, B.; Yang, X.; Dong, Y.; Qiu, D. Verticillium dahliae pectate lyase inducira biljne imunološke odgovore i doprinosi virulenciji. Ispred. Plant Sci. 2018, 9, 1271. [CrossRef]
62. Livak, KJ; Schmittgen, TD Analiza podataka o relativnoj ekspresiji gena korištenjem kvantitativne PCR u stvarnom vremenu i 2(-Delta Delta C(T)) metode. Metode 2001, 25, 402–408. [CrossRef]