Beta-glukan pojačao imunološki odgovor na cjepivo protiv newcastleske bolesti i promijenio ekspresiju MRNA slezene kod pilića

SAŽETAK

Ovo je istraživanje provedeno kako bi se istražio učinak oralne primjene b-glukana (G70), produkta dobivenog iz stanične stijenke kvasca, na titre inhibicije hemaglutinacije (HI) specifične za virus Newcastleske bolesti (NDV), proliferaciju limfocita i uloga subpopulacija T limfocita u pilića liječenih živim NDV cjepivom. Osim toga, utjecaj b-glukana na ekspresiju gena u slezeni istražen je sekvenciranjem transkriptoma. Rezultati su otkrili da je dodatak b-glukana povisio titar serumskog NDV HI, povećao indeks NDV stimulacije limfocita u perifernoj krvi i crijevnom traktu, te pospješio diferencijaciju T limfocita u CD4+ T stanice. Analiza RNA sekvenciranja (RNA-seq) pokazala je da G70 pojačava ekspresiju mRNA koja se odnosi na G-protein spregnuti receptor i MHC polipeptid klase I, te smanjuje ekspresiju mRNA koja se odnosi na katelicidin i betadefensin. Imunomodulacijski učinak G70 mogao bi funkcionirati kroz signalni put protein kinaze aktiviran mitogenom. Ukratko, G70 bi mogao pojačati imunološku učinkovitost živog NDV cjepiva kod pilića i mogao bi se primijeniti kao potencijalni kandidat za pomoćno sredstvo u peradarskoj industriji.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Ključne riječi: cjepivo protiv newcastleske bolesti, beta-glukan, adjuvans, kokoš s crnom kosti, RNA-seq

UVOD

Polisaharidi stanične stijenke kvasca izravno se dobivaju iz stanične stijenke Saccharomyces cerevisiae i naširoko se koriste kao stimulatori rasta, antimikrobna sredstva ili imunomodulatori u peradi za poboljšanje proizvodnje i zdravlja (Schiavone i sur., 2017.; Hasted i sur., 2021.). Prethodno je dokazano da proizvod pod nazivom PW220, koji sadrži polisaharide stanične stijenke kvasca, jača imunološki odgovor izazvan virusom newcastleske bolesti (NDV) i mijenja mikrobnu zajednicu cekuma kokoši oralnom primjenom (Bi et al., 2020. ). Polisaharidi stanične stijenke kvasca prvenstveno se sastoje od b-glukana i manan-oligosaharida (Wang i sur., 2018.). U ovoj studiji ispitivan je učinak b-glukana na imunološki odgovor na NDV cjepivo kod pilića. Slezena je ključni organ za pokretanje imunološkog odgovora. Nedavna studija pokazala je da PW220, koji je produkt stanične stijenke kvasca, pojačava ekspresiju mRNA TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 i T-bet u slezeni kokoši ( Bi i sur., 2022). Međutim, potrebno je razjasniti specifični mehanizam. Sekvenciranje RNA (RNA-seq) jedna je od tehnologija visoke propusnosti koja se može primijeniti za ispitivanje kvantitativne ekspresije gena i pružanje analize različitih profila ekspresije na razini cijelog transkriptoma (Zhao et al., 2018.). Uz prednosti visoke osjetljivosti i niske cijene, RNA-seq se široko koristi u studijama stoke i peradi (Teixeira i sur., 2019; Yuan i sur., 2020). Stoga je u ovoj studiji procijenjen učinak primjene b-glukana na titre inhibicije hemaglutinacije (HI) specifične za NDV, proliferaciju limfocita i subpopulacije T-limfocita u pilića oralno cijepljenih NDV cjepivom. Nadalje, analiza transkriptoma korištena je za procjenu učinka b-glukana na ekspresiju gena i temeljne putove prijenosa signala u slezeni pilića.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Životinje

Jednodnevni komercijalni pilići s crnim kostima (muški) nabavljeni su od Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (Anshun, Kina). Pilići su podijeljeni u žičane kaveze koji su omogućili slobodan pristup hrani i vodi. U prvih 7 dana sobna temperatura održavana je na 33 stupnja C do 35 stupnjeva Cand, a zatim se postupno smanjivala za 1 stupanj C svaka 2 dana do 27 stupnjeva C. Svi su pilići obrađeni prema standardima koje je uspostavilo Southwest University Animal Care i Povjerenstvo za korištenje (Broj etičkog certifikata: IAC-2021-0057). Sve su pokusne ptice eutanazirane CO2 na kraju istraživanja.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Cjepivo

Živo cjepivo protiv NDV (soj La Sota) osigurao je Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Qingdao, Kina).

Reagensi 

Produkt stanične stijenke kvasca (YP) G70 dobiven je iz stijenke stanice kvasca (Saccharomyces cerevisiae), koja sadrži b-glukan (više od ili jednako 70%) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, Kina). Serumi za antigen i pozitivnu kontrolu za mjerenje NDV-specifičnih HI titara kupljeni su od Qingdao Regen Diagnostics Development Center (Qingdao, Kina). Anti-chicken CD3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) i CD8- PE (L{{14 }}TH49T) u štakorima ponudio je Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Kina).

Eksperimentalni dizajn

Četrdeset osam pilića s crnim kostima starih 5 dana nasumično je raspoređeno u 3 skupine (Tablica 1) i dana im je ili bazalna prehrana (Tablica 2) ili bazalna prehrana s 0.1% G7{{10} } (b-glukan, 0,7 g/kg) dodatak za vrijeme trajanja ovog istraživanja. Skupina H (G70 + cjepivo) i C (cjepivo) oralno su imunizirane NDV cjepivom 14. odnosno 28. dana. Skupina S (Sailne) tretirana je jednakim volumenom fiziološke otopine. Uzorci krvi su sakupljeni putem venepunkcije krila u dobi od 5, 7, 14, 21, 28, 35 i 42 dana za testiranje HI titra. Sedam dana nakon docjepljivanja, 8 pilića u svakom stupcu nasumično je odabrano i žrtvovano gušenjem pomoću CO2. Limfociti su odvojeni iz periferne krvi i jejunuma kako bi se izvršila analiza proliferacije limfocita i protočne citometrije. U slučaju uzorkovanja iz jejunuma, suspenzorni ligament dvanaesnika bio je početna točka jejunuma, a 5 cm dugačak presjek uzet je s početne točke jejunuma. Slezena je brzo zamrznuta u tekućem dušiku i zatim pohranjena na -80 stupnjeva za RT-qPCR i profiliranje sekvence.

Tablica 1. Eksperimentalni dizajn

Tablica 2. 1. Sastav i sadržaj hranjivih tvari u eksperimentalnim bazalnim obrocima tovnih pilića.

HI Studija

Analiza za NDV-specifične HI titre u serumu provedena je prema prethodnom opisu (Ball et al., 2019.). Ukratko, serum je razrijeđen fosfatno puferiranom fiziološkom otopinom (PBS) od 1:2 do 1:1,024 u mikrotitarskoj ploči 96-jažice s V-dnom. Zatim je dodano 25 mL NDV razrjeđenja po jažici i inkubirano na 37 stupnjeva 30 minuta. Nakon toga je u svaku jažicu dodano 25 mL 1% suspenzije eritrocita pijetla i inkubirano na 37 stupnjeva 30 minuta. Svi su uzorci testirani dva puta, a na svakoj su ploči uključene i pozitivne i negativne kontrole. HI titri temeljeni su na najvećem razrjeđenju koje je rezultiralo potpunom inhibicijom hemaglutinacije. Prosječni HI titar i standardna greška (SE) izmjereni su po skupini.

Izolacija limfocita iz periferne krvi

Limfociti su izolirani i sakupljeni iz limfocita periferne krvi upotrebom Limphocyte Separation Medium Kit (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Tianjin, Kina). Zatim su limfociti pohranjeni u suspenziji s medijem RPMI 1640 (Solarbio, Peking, Kina) uključujući 5% fetalnog telećeg seruma i 25 mM HEPES (pH 7,0).

Izolacija limfocita iz jejunuma

Proces dodjele proveden je u skladu s prethodnim opisom, uz male izmjene (Yuan et al., 2020.). Ukratko, upotrijebite ćelijski filtar od 70 mm da podijelite crijevo u 4 mL hladnog PBS-a. Nakon toga, suspenzija stanica uzorka je centrifugirana na 4500 okretaja u minuti tijekom 12 minuta uz uklanjanje supernatanta. Zatim resuspendirajte crijevne stanice na punom mediju (Solarbio Co., Peking, Kina) koji se sastoji od 5% fetalnog goveđeg seruma (FBS) u RPMI 1640 (Sijiqing Co., Hangzhou, Kina). Na kraju, pribor za izolaciju pilećih limfocita (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) za odvajanje limfocita. crijevno tkivo je podijeljeno u 4 mL hladnog PBS-a korištenjem 70 mm ćelijskog filtera. Zatim je suspenzija stanica uzorka centrifugirana na 4500 okretaja u minuti tijekom 12 minuta, a supernatant je odbačen. Nakon toga, crijevne stanice su resuspendirane u RPMI 1640 (Solarbio Co.) koji sadrži 5% FBS (Sijiqing Co.). Konačno, limfociti su odvojeni korištenjem kompleta za izolaciju pilećih limfocita (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.).

Proliferacija limfocita 

Stanice su nasađene u 96-pločice s jažicama (5£105 po jažici), stimulirane antigenom inaktiviranog NDV-a za 4 hemaglutinacijske jedinice ili jednak volumen slane otopine. Svaki uzorak testiran je u 3 ponavljanja. Stanice i antigen su inkubirani 44 sata na 37 stupnjeva u 5% CO2, a zatim je u svaku jažicu dodano 50 mL metil tiazolil tetrazolija (MTT) (2 mg/mL) i inkubirano još 4 sata. Uzorci su centrifugirani na 1200 £g 8 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, supernatant je oprezno uklonjen i 100 mL DMSO je dodano u svaku jažicu. Ploče su mućkane 8 minuta kako bi se kristali potpuno otopili. Na kraju, prosječna optička gustoća (OD) je zabilježena na 570 nm. Indeks stimulacije (SI) dobiven je pomoću jednadžbe: OD vrijednosti stimuliranih jažica / OD vrijednosti nestimuliranih jažica (Cui et al., 2020.).

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Analiza subpopulacija T-limfocita protočnom citometrijom

Suspenzije limfoidnih stanica su izolirane i isprane dva puta s PBS. Koncentracija stanica je modificirana na 106 /mL i zatim držana na ledu. Svaki uzorak je obojen s 2 mL štakorskog anti-pilećeg CD3-APC, CD4- FITC i štakorskog anti-pilećeg CD8-PE pod uvjetima otpornim na svjetlo 30 minuta, nakon čega je 2 ispiranja s PBS-om. Stanice su analizirane analizom protočne citometrije na protočnom citometru (BD Bioscience, San Jose, CA).

RT-qPCR analiza

Ukupna RNA izvedena je iz slezene korištenjem TRIzol reagensa (Takara, Shiga, Japan) u skladu sa smjernicama proizvođača, a zatim pretvorena u cDNA korištenjem PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian, Kina) na termocikleru T100 (Bio-Rad, Hercules, CA). Pileći beta-aktin korišten je kao interni kontrolni gen. RT-qPCR odabranih gena proveden je na Multiple Real-Time PCR System (AB, Carlsbad, CA) sa SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Provedena je relativna kvantitativna metoda (244CT) za procjenu kvantitativne varijacije (Bi et al., 2022). Sekvencije početnica navedene su u tablici 3.

Ekstrakcija RNK

Svaki od 3 uzorka slezene iz skupine H (G70 +cjepivo) i skupine C (cjepivo) korišten je za RNA-seq s TRIzol reagensom (Takara). Nakon toga, RNA je testirana na kontaminaciju i razgradnju s 1% agaroznim gelom, a čistoća RNA je analizirana pomoću NanoPhotometer spektrofotometra (IMPLEN, Westlake Village, CA). Koncentracija RNA određena je pomoću Qubit RNA Assay Kita u Qubit 2.0 Fluorometru (Life Technologies, Carlsbad, CA). Integritet RNA mjeren je korištenjem RNA Nano 6000 Assay Kit sustava Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Rezultati su pokazali da je RNK potpuna i bez kontaminacije DNK.

Analiza transkriptoma

Sekvenciranje transkriptoma, sastavljanje sekvenci i analizu podataka osigurao je Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Peking, Kina). Glavni postupci za transkriptom navedeni su kako slijedi: 1) Pročišćavanje mRNA od ukupne RNA provedeno je korištenjem poli-T oligo-vezanih magnetskih kuglica. Fragmentacija je provedena s dvovalentnim kationima u NEB Next First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) na visokoj temperaturi. 2) Prvi lanac cDNA sintetiziran je korištenjem nasumičnog heksamernog primera i Moloney virusa mišje leukemije (M-MuLV) Reverse. Sinteza drugog lanca cDNA potom je sintetizirana korištenjem DNA polimeraze I i RNaze H. 3) Preostali izboci transformirani su u tupe krajeve kroz aktivnosti egzonukleaze/polimeraze. Struktura petlje ukosnice NEB Next Adapter zatim je vezana za pripremu za hibridizaciju nakon adenilacije 3' kraja fragmenata DNA. 4) Oko 250 do 300 bp cDNA fragmenata je dobiveno i biblioteka je pročišćena pomoću Beckman Coulterovog AMPure XP sustava (Beckman Coulter, Beverly, MA). Zatim je primijenjeno 3 mL NEBU SER enzima (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) s cDNA odabranom po veličini, vezanom s adapterom na 37 stupnjeva C tijekom 15 minuta, a nakon toga 5 minuta na 95 stupnjeva. PCR amplifikacija je provedena s Phusion High-Fidelity DNA polimerazom. Na kraju su PCR produkti pročišćeni (AMPure XP sustav), a kvaliteta biblioteke procijenjena je korištenjem Agilent Bioanalyzer 2100 sustava. Grupiranje uzoraka kodiranih indeksom izvedeno je na TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA). Zatim je sekvencioniranje izvedeno na platformi Illumina Novaseq i generirano je očitavanje uparenog kraja od 150 bp. Datoteke s bilješkama referentnog genoma i modela gena preuzete su s web stranice genoma (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ i ftp://ftp. ensembl.org/ pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Indeks referentnog genoma uspostavljen je korištenjem HISAT2 (v2.0.5) i upareni kraj čistih očitanja usklađen je s referentnim genomom. Broj čitanja mapiranih na svaki gen i fragmenata po kilobazi po milijunu (FPKM) za svaki gen na temelju duljine gena i broja čitanja mapiranih na genu izračunati su korištenjem značajke Counts v1.5.{{38} }p3. Diferencijalni izraz između skupine H (G70 + cjepivo) i skupine C (cjepivo) izveden je korištenjem DESeq2 R paketa (1.16.1). Geni s P < 0,05 i |log2 (fold change)| > 1 definirani su kao geni diferencijalne ekspresije (DEG).

Tablica 3. Sekvence početnica za RT-qPCR.

Kvantitativna PCR validacija u stvarnom vremenu 

Dva naviše regulirana DEG-a i 4 niže regulirana DEG-a u usporedbi skupine H (G70 + cjepivo) u odnosu na skupinu C (cjepivo) odabrana su za potvrdu rezultata sekvencioniranja transkriptoma pomoću RT-qPCR. RNA je pretvorena u cDNA korištenjem PrimeScript RT Master Mix (Takara) na T100 termalnom cikleru (Bio-Rad). Slijedovi primera navedeni su u tablici 3. Pileći b-aktin korišten je kao interni kontrolni gen. RT-qPCR odabranih gena proveden je na višestrukom PCR sustavu u stvarnom vremenu (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) sa SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Relativna kvantitativna metoda (244CT) primijenjena je za procjenu varijacije u kvantificiranju. Svi su uzorci uzeti u tri primjerka za analizu.

Statistička analiza

Jednosmjerna ANOVA s Duncanovim post hoc testom korištena je za višestruke usporedbe između skupina korištenjem SPSS softvera (verzija 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost § SE. Vrijednost P < 0.05 smatrana je statistički značajnom.

REZULTATI Učinak b-glukana na titar antitijela u serumu

Kao što je prikazano na slici 1, NDV-specifični HI titri su se smanjili u svim skupinama prije cijepljenja i porasli u H (G70+Vaccine) i C (Vaccine) skupinama nakon imunizacije. Zanimljivo, viši titri HI primijećeni su u skupini H (G70+cjepivo) na 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (P > 0,05) i 42 (P > 0,05) d starosti nego u skupini C (Cjepivo).

Učinak b-glukana na proliferaciju limfocita

Učinak G70 na proliferaciju limfocita periferne krvi prikazan je na slici 2A. SI u limfocitima u krvi bio je povećan u ptica koje su dobile dodatak G70 (G70 + cjepivo) nakon 7 dana (P <0,05) docjepljivanja, u usporedbi sa skupinom cjepivom. Nadalje, SI u limfocitima jejune značajno je povećan 7 dana (P <0,05) nakon docjepljivanja u usporedbi sa skupinom cijepljenom (Slika 2B).

Učinak b-glukana na omjer CD4 + / CD8 + T stanica u perifernoj krvi 

Slike 3A i 3B pokazuju prolaz limfocita i CD3 + stanica, a slike 3C do 3E pokazuju omjer CD4 + /CD8 + T stanica u G70, cjepivo, odnosno slane skupine. Kao što je prikazano na slici 3F, nije bilo značajne razlike između skupine cjepiva i skupine fiziološke otopine nakon docjepljivanja (P > 0.05), dok je udio CD4 + /CD{{12} } T stanica je očito bila viša u skupini G70 (G70 + cjepivo) nego u skupini cjepiva (P <0,05).

Slika 1. Učinak oralne primjene b-glukana na titar antitijela u serumu protiv NDV cjepiva. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost § SE.

Povezana ekspresija gena

Kao što je prikazano na slici 4, značajno je povećana ekspresija mRNA TGF-b (P < 0.05), IL-6 (P < 0.{{13} }5), a TLR5 (P < 0.05) otkriven je u slezeni pilića tretiranih s G70 (G70 + cjepivo), u usporedbi sa skupinom cjepiva. Nije pronađena značajna razlika u ekspresiji mRNA IFN-g (P > 0,05), TLR4 (P > 0,05) i TLR3 (P > 0,05) u slezeni između G70 (G70 + cjepiva) i cjepiva skupine.

Analiza podataka sekvenciranja RNA 

Sekvenciranje RNA iz 8 biblioteka slezene dalo je 24,1 G neobrađenih podataka kako je prikazano u tablici S1 dopunskog materijala. CN znači cjepivo skupine, a HN znači cjepivo skupine G70 +. Biblioteka C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 i H4 redom se sastoji od 45,591,492, 47,424,782, 46,193,492, 54,403,376, 47,118,476, 45,899,262, 45,841,884 i 45,504, 438 izvornih čitanja. Nakon aptamera uklonjene su dvosmislene sekvence i sekvence niske kvalitete, ostavljajući 44,050,198, 45,449,884, 44,261,112, 52,097,846, 45,542,404, 44,566,290, 44,113,172 i 44,026,960 čistih čitanja. Više od 96% čistih očitanja bilo je među izvornim očitanjima, a 8 biblioteka je upareno korištenjem HISAT2 za sekvencioniranje očitanja u odnosu na referentnu bazu podataka koja se sastoji od Gallusovog genoma. Nadalje, čista očitanja mapirana su u ovu bazu podataka u više od 95% slučajeva. Specifične biblioteke iz C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 i H4 bile su 40 921 384 (92,9%), 41 302 100 (90,87%), 40 771 075 (92,11%), 46 905 784 (90,03%), 42 444 112 (93 .2 %), 40 213 444 (90,23 %), 40 922 895 (92,77 %) i 40 971 972 (93,06 %) čitanja dodijeljena su jedinstveno referentnoj bazi podataka.

Diferencijalno izraženi geni

Kao što je prikazano na slici 5A, identificirano je ukupno 198 različito eksprimiranih gena, uključujući 47 gena s regulacijom na gore i 151 gen s nižom regulacijom. DEG-ovi su detaljno opisani u dodatnom materijalu Tablica S2. Slika 5B pokazuje da DEG imaju dobru ponovljivost tretmana.

Analiza ontološke klasifikacije gena i obogaćivanje Kyoto enciklopedije gena i genoma

Geni koji su različito izraženi geni klasificirani su u 3 glavne funkcionalne kategorije na temelju klasifikacijskog sustava genske ontologije (GO): biološki proces, stanična komponenta i molekularna funkcija. Prvih 10 pojmova GO u 3 kategorije predstavljeno je na slici 6. Postojala je dominacija gena uključenih u "odgovor na humoralni imunološki", "kemokinski odgovor", "odgovor na antimikrobni humoralni", "obrambeni odgovor protiv bakterije, " "imunološki odgovor na antimikrobni humor posredovan antimikrobnim peptidima", "obrambeni odgovor protiv gram-negativne bakterije" i "obrambeni odgovor protiv gram-pozitivne bakterije" u kategoriji bioloških procesa. Osim toga, u kategoriji molekularne funkcije, izvanredan omjer gena bio je povezan s "vezivanjem kemokinskog receptora CC motiva (CCR) za kemokinski receptor", "vezivanjem kemokinskog receptora" i "vezivanjem lipopolisaharida". Nadalje, "kompleks mitohondrijskog dišnog lanca I", "kompleks NADH dehidrogenaze" i "dišni lanac" bili su najdominantniji obogaćeni termini u kategoriji staničnih komponenti. Kyoto Encyclopedia of Genes and Analiza puta genoma također je provedena na različito izraženim genima. Rezultati su sugerirali da su geni uglavnom grupirani u 7 putova uključujući "neuroaktivnu interakciju ligand-receptor", "spoj spoja", "mitogenom aktiviranu protein kinazu (MAPK) signalni put", "ABC transportere," "biosintezu aminokiselina," "Metabolizam lijekova" i "Izvoz proteina".

Slika 2. Učinak oralne primjene b-glukana na indeks stimulacije limfocita (SI). (A) Limfociti periferne krvi; (B) crijevni limfociti. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost § SE.

Slika 3. Učinak oralne primjene b-glukana na omjer CD4+/CD8+ stanica periferne krvi. (A) Vrata na limfocitima; (B) vrata na CD3+ T stanicama; (C) učestalosti CD3+ CD4 + CD8 + T stanica u G70+skupini cjepiva; (D) učestalosti CD3+ CD4 + CD8 + T stanica u skupini cjepiva; (E) učestalosti CD3+ CD4 + CD8 + T stanica u skupini fiziološke otopine; (F) bardijagram koji predstavlja omjer CD4+/CD8+. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost § SE.

Slika 4. Učinak oralne primjene b-glukana na ekspresiju mRNA u kokošjoj slezeni. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost § SE.

Slika 5. Sažetak RNA-Seq podataka. (A) Popis različito izraženih gena, (B) mapa grupiranja DEG-ova.

Verifikacija gena izraženih diferencijalno pomoću RT-qPCR

6 DEG koji su bili regulirani na gore ili naniže potvrđeni su kvantitativnom PCR-om u stvarnom vremenu. Rezultat je sugerirao da su podaci RT-qPCR općenito u skladu s podacima RNA-seq općenito, što ukazuje na pouzdan rezultat sekvenciranja (Slika 7). Ekspresija mRNA gena povezanih s putem MAPK Kao što je prikazano na slici 8, značajno je smanjena ekspresija mRNA FAS (P < 0.05) i CACNA2 (P < 0.05) otkriven u slezeni pilića u skupini G70 (G70 + cjepivo) u usporedbi sa skupinom cjepiva. Osim toga, brojčano povećana ekspresija mRNA DUSP5 i DUSP4 i brojčano smanjena ekspresija mRNA p38, JNK i ERK otkrivena je u skupini G70 (G70 + cjepivo) u usporedbi sa skupinom cjepiva (P > 0,05) .

RASPRAVA

Živo ND cjepivo široko se inokulira na farmama pilića, a ipak još uvijek postoje sporadična izbijanja newcastleske bolesti u imuniziranim jatima peradi (Zhang i sur., 2022.). Optimalna cjepiva definirana su tako da stimuliraju staničnu i mukoznu imunost, kao i učinkovitu humoralnu imunost (Shan et al., 2019.). Stoga se sve više pozornosti pridavalo adjuvansima koji bi mogli dati mukozne kao i stanične imunološke odgovore (Chen i sur., 2014.; Yu i sur., 2015.). U usporedbi s načinom ubrizgavanja, oralna primjena lakši je pristup koji smanjuje troškove i uzrokuje manje stresa za tovne piliće (Boyaka i sur., 2003.; Zhang i sur., 2008.). Rezultati ove studije pokazali su da je prehrana s dodatkom b-glukana značajno povećala razinu HI titara specifičnih za NDV u serumu pilića, što je u skladu s prethodnim izvješćima (Horst i sur., 2019.). Protutijela specifična za NDV ključna su za razvoj humoralnog imunološkog odgovora za zaštitu pilića od NDV infekcije (Martinez i sur., 2018; Li i sur., 2020). Limfociti B proizvode antitijela, a limfociti T se šire kao odgovor na mitogen (Bohacova i sur., 2021.). U ovoj studiji, indeks stimulacije limfocita periferne krvi pilića na NDV skupine G70 bio je očito viši od indeksa skupine cjepiva, što ukazuje da je aktivirano više T limfocita. Dominantne subpopulacije limfocita T su CD4 + i CD8 + T stanice (Cui et al., 2020.). CD4 + T stanice uglavnom proizvode citokine i potiču sazrijevanje B stanica, dok su CD8 + T stanice povezane s ubijanjem ciljnih stanica (Zhang et al., 2021b). U ovom istraživanju, omjer CD4 +/CD8 + T stanica otkrivenih u skupini G70 jasno se povećavao, sugerirajući da bi G70 mogao aktivirati više CD4 + T stanica iz periferne krvi. Osim toga, primijetili smo značajno viši indeks stimulacije intestinalnih limfocita u skupini G70 nego u skupini cjepiva, što je potvrdilo da b-glukan također može stimulirati intestinalne limfocite. Naši prethodni eksperimenti potvrdili su da ekstrakt stanične stijenke kvasca PW220 značajno povećava intestinalne specifične sIgA i IgA + stanice (Bi et al., 2020.). Drugim riječima, i b-glukan G70 i PW220 učinkoviti su u promicanju imuniteta crijevne sluznice.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Prethodno je zabilježen poboljšani imunitet životinja davanjem b-glukana. Guo i sur. (2003.) potvrdili su da je primjena b-glukana poboljšala indeks burze i NDV-specifičnih protutijela kod pilića. Levine i sur. (2018.) su sugerirali da suplementacija b-glukanom može poboljšati intestinalni MHC Ⅱ i povećati broj CD45 + stanica kako bi se ublažile ozljede crijeva.

Li et al. (2005.) otkrili su da b-glukan iz hrane može povećati razine ekspresije mRNA IL-8 i TGF-b u crijevnom traktu svinja. Mehanizam imunomodulatornog učinka b-glukana nije jasan. Kim i sur. (2010.) pokazali su da b-glukan potiče sazrijevanje dendritičnih stanica pojačavanjem ekspresije CD40, CD80 i CD86. Osim toga, Lee i Kim (2014.) i Su et al. (2020.) izvijestili su da b-glukan aktivira receptore za prepoznavanje uzoraka kao što su Dectin-1 receptor, Toll-like receptor i CR3 (Baert et al., 2015.). Slezena je ključni organ za pokretanje imunološkog odgovora i igra bitnu ulogu u urođenom i stečenom imunitetu (Bronte i Pittet, 2013.). Međutim, postoji samo malo istraživanja temeljenih na RNA-seq analizi ekspresije mRNA u slezeni nakon oralne primjene polisaharida kvasca. U ovoj studiji, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analiza putova sugerira da su ti geni primarno grupirani u 2 puta, uključujući "neuroaktivnu interakciju ligand-receptor" i "MAPK signalni put". Receptori za prepoznavanje uzoraka koji ciljaju b-glukan bili su obogaćeni na površini imunoloških stanica (Goodridge et al., 2009). Nakon prepoznavanja b-glukana, ti su receptori stimulirali tirozin kinazu i nuklearni faktor kappaB (NF-kappaB), što je rezultiralo indukcijom proupalnog izlučivanja citokina i aktivacijom imunoloških odgovora (Kankkunen i sur., 2010.; Masuda i sur. ., 2012.; Xu i sur., 2016.; Bode i sur., 2019.). MAPK, kao obitelj serin-treonin protein kinaza, igra ključnu ulogu u upali i proizvodnji citokina kod pilića. Byun i sur. (2016.) pokazali su da b-glukan povećava proizvodnju interferona-g i interleukina-2 i pokreće značajno veće razine fosforilacije MAPK p38 u peritonealnim makrofagima. Wang i sur. (2014.) izvijestili su da b-glukan smanjuje upalne odgovore u THP-1 stanicama inhibiranjem aktivacije p38 MAPK. U ovoj studiji, 13 DEG uključujući DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB i EGFR identificirano je u MAPK signalnom putu, što sugerira da bi b-glukan mogao regulirati imunološki odgovor slezene putem MAPK u pilića. MAPK je očuvana klasa Ser/Thr kinaza u stanicama koje su uglavnom uključene u stanične odgovore kao što su imunološki odgovor, apoptoza i proliferacija. Obitelj MAPK uključuje najmanje 3 podfamilije: c-Jun N-terminalnu kinazu (JNK), p38 MAPK i kinazu reguliranu izvanstaničnim signalom (ERK) (Hong i sur., 2020; Zhang i sur., 2021a). DUSP4 i DUSP5 su fosfataze dvojne specifičnosti koje specifično inhibiraju aktivnost članova obitelji MAPK kao što su p38, JNK i ERK, igrajući važnu regulatornu ulogu u sprječavanju pretjerane upalne reakcije i promicanju regresije upale u tijelu (Imasato et al. ., 2002; Talreja i sur., 2021). Osim toga, mala nekodirajuća RNA nazvana gga-miR-200a-3p navodno suzbija ekspresiju proupalnih čimbenika i tako regulira autoimuni odgovor domaćina negativnom regulacijom MAPK puta i njegove nizvodne signalne molekule (Pham et al., 2017.). U ovoj studiji, RT-qPCR analiza pokazala je da se ekspresija mRNA P38, JNK i ERK smanjila, a ekspresija mRNA DUSP4 i DUSP5 povećala kod pilića hranjenih b-glukanom (G70). Ovi rezultati sugeriraju da učinak b-glukana (G70) na jačanje imuniteta na cjepivo protiv newcastleske bolesti može biti povezan s regulacijom negativne povratne sprege proupalnih čimbenika posredovanih MAPK-om. Osim toga, FAS je bitna tvar koja posreduje u apoptozi i ključna je za imunološku homeostazu (Krueger i sur., 2003.; Guegan i Legembre, 2018.). U međuvremenu, CACNA2 je podjedinica kalcijevog kanala ovisna o naponu, koja ima promotivni učinak na staničnu proliferaciju, migraciju i invaziju (Sun et al., 2020.). U ovoj studiji, FAS i CACNA2 bili su značajno smanjeni kod pilića kojima je davan b-glukan (G70), što ukazuje da b-glukan (G70) ima učinak jačanja imuniteta uglavnom inhibicijom apoptoze imunoloških stanica i balansiranjem autoimunosti. Ovi nalazi daju teoretsku referencu za korištenje b-glukana (G70) kao pojačivača imuniteta u kliničkim uvjetima. Međutim, mehanizam b-glukana koji pojačava imunološki odgovor kroz učinak negativne povratne sprege MAPK puta treba dodatno dokazati. Zanimljivo je primijetiti da su geni koji kodiraju katelicidin koji se sastoji od CATH3, CATH1, CATH2 i geni koji kodiraju b-defensin uključujući AvBD6, AvBD7, AvBD1 i AvBD4 bili značajno smanjeni u usporedbi H (cjepivo skupine G70 +) u odnosu na kontrolu (skupno cjepivo). Obrambeni peptidi domaćina (HDP) su efektorske molekule koje imaju ključnu ulogu u urođenom imunološkom sustavu (Cuperus et al., 2013.). Ovi peptidi su otkriveni u raznim životinjskim vrstama od sisavaca do ptica. Postoje 4 katelicidina u pilićima, koji se sastoje od CATH1, CATH2, CATH3 i CATHB1, koji učinkovito ubijaju različite bakterije (Hamad i sur., 2017.). Ptičji beta-defenzini (AvBD), alternativno nazvani gallinacean, mali su kationski peptidi s 3 cistein disulfidne veze između njihovih cisteinskih ostataka i imaju važnu ulogu u urođenom imunološkom sustavu (Yoshimura, 2015.). Smanjenje ekspresije katelicidina i beta-defenzina moguće je objasniti povratnom regulacijom, gdje su bakterijske i parabakterijske populacije smanjene polisaharidima stanične stijenke kvasca (Bi et al., 2020.). Slični rezultati otkriveni su iu drugim studijama. Shao i sur. (2016.) su kvantitativnom PCR analizom u stvarnom vremenu pokazali da dodatak b-glukana kvasca kod tovnih pilića suzbija infekciju salmonelom i smanjuje ekspresiju HDP-a. U ovoj studiji, proizvod G70 koji se uglavnom sastoji od b-glukana povećao je razinu NDV-specifičnih antitijela u serumu, povećao indeks NDV stimulacije limfocita periferne krvi i intestinalnih limfocita i pospješio diferencijaciju T limfocita periferne krvi u CD{{ 123}} T stanice. Uz to, RNA-seq analiza pokazala je da G70 pojačava ekspresiju mRNA koja se odnosi na G-protein spregnuti serotoninski receptor i MHC polipeptid klase I i smanjuje ekspresiju mRNA koja se odnosi na katelicidin i beta-defensin. Uzimajući u obzir pojačani učinak G70 na ND cjepivo kod piletine, može se dalje proučavati učinak G70 na druga cjepiva za perad, kao što je cjepivo protiv ptičje gripe.

Slika 6. Analiza KEGG puta.

Slika 7. RT-qPCR potvrda odabranih DEG kandidata. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost § SE.

Slika 8. Relativna ekspresija mRNA u slezeni. Ukupna RNA ekstrahirana je iz slezene. Pileći b-aktin poslužio je kao interni kontrolni gen. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost § SE.

REFERENCE

Baert, K., E. Sonck, BM Goddeeris, B. Devriendt i E. Cox. 2015. Razlike specifične za tip stanice u prepoznavanju i signalizaciji b-glukana u svinjskim urođenim imunološkim stanicama. Dev. Comp. Immunol. 48: 192-203.

Ball, C., A. Forrester, A. Herrmann, S. Lemiere i K. Ganapathy. 2019. Usporedna zaštitna imunost koju pružaju živa cjepiva protiv virusa newcastleske bolesti ili metapneumovirusa ptica kada se istodobno primjenjuju uz klasične i varijante virusa infektivnog bronhitisa u jednodnevnih pilića brojlera. Cjepivo. 37:7566-7575.

Bi, S., J. Zhang, Y. Qu, B. Zhou, X. He i J. Ni. 2020. Produkt stanične stijenke kvasca pojačao je intestinalni IgA odgovor i promijenio vrstu mikroflore cekuma nakon oralnog cijepljenja kod pilića. perad. Sci. 99:6576-6585.

Bi, S., J. Zhang, L. Zhang, K. Huang, J. Li i L. Cao. 2022. Stanična stijenka kvasca pojačala je stanično posredovane imunološke odgovore na cjepivo protiv virusa newcastleske bolesti. perad. Sci. 101:101712-101721.

Bode, K., F. Bujupi, C. Link, T. Hein, S. Zimmermann, D. Peiris, V. Jaquet, B. Lepenies, H. Weyd i PH Krammer. 2019. Dektin-1 koji se veže za aneksine na apoptotskim stanicama izaziva perifernu imunološku toleranciju putem NADPH oksidaze-2. Ćelija. Rep. 29:4435-4446.

Bohacova, P., J. Kossl, M. Hajkova, B. Hermankova, V. Holan i E. Javorkova. 2021. Razlika između mitogenom stimuliranih B i T stanica u nespecifičnom vezanju antitijela konjugiranih s R-fikoeritrinom. J. Immunol. Metode. 493:113013-113023.

Boyaka, PN, A. Tafaro, R. Fischer, K. Fujihashi, E. Jirillo i JR McGhee. 2003. Terapeutska manipulacija imunološkog sustava: poboljšanje urođene i adaptivne mukozne imunosti. Curr. Pharm. Oblikovati. 9: 1965-1972.

Bronte, V. i MJ Pittet. 2013. Slezena u lokalnoj i sustavnoj regulaciji imuniteta. Imunitet. 39: 806-818.

Byun, E., S. Park, B. Jang, N. Sung i E. Byun. 2016. Gama-ozračeni b-glukan izaziva imunomodulaciju i antikancerogeno djelovanje putem MAPK i NF-kB puteva. J. Sci. Hrana. Agr. 96: 695-702.

Chen, X., X. Chen, S. Qiu, Y. Hu, C. Jiang, D. Wang, Q. Fan, C. Zhang, Y. Huang, Y. Yu, H. Yang, C. Liu, Z Gao, R. Hou i X. Li. 2014. Učinci oralne tekućine epimedium polisaharid-propolis flavon na imunitet sluznice u pilića. Int. J. Biol. Macromol. 64:6-10.

Cui, X., Y. Wang, R. Guan, M. Lu, L. Yuan, W. Xu i S. Hu. 2020. Poboljšani imunološki odgovori proteomskom analizom seruma hu ovaca na cjepivo protiv slinavke i šapa emulgirano u adjuvansu biljnog ulja. Cjepiva. 8: 180-197

Cuperus, T., M. Coorens, A. van Dijk i HP Haagsman. 2013. Obrambeni peptidi ptičjeg domaćina. Dev. Comp. Immunol. 41: 352-369.

Goodridge, HS, AJ Wolf i DM Underhill. 2009. Prepoznavanje beta-glukana od strane urođenog imunološkog sustava. Immunol. Otkr. 230:38–50.

Guegan, J. i P. Legembre. 2018. Nenapoptotičke funkcije Fas/CD95 u imunološkom odgovoru. FEBS J 285:809–827.

Guo, Y., RA Ali i MA Qureshi. 2003. Utjecaj beta-glukana na imunološki odgovor u tovnih pilića. Immunopharm. Immunol. 25: 461-472.

Hamad, SK, S. Kim, SW El-Kadi, EA Wong i RA Dalloul. 2017. Usporedna ekspresija obrambenih peptida domaćina u purana. perad. Sci. 96: 2083-2090.

Hasted, T., S. Sharif, P. Boerlin i MS Diarra. 2021. Imunostimulacijski potencijal voća i njegovih ekstrakata u peradi. Ispred. Immunol. 12:641696.

Hong, Y., J. Lee, TH Vu, S. Lee, HS Lillehoj i YH Hong. 2020. Kokošji ptičji b-defensin 8 modulira imunološki odgovor putem signalnih putova protein kinaze aktiviranih mitogenom u staničnoj liniji kokošjih makrofaga. perad. Sci. 99:4174-4182.

Horst, G., R. Levine, R. Chick i C. Hofacre. 2019. Učinci beta- 1,3-glukana (AletaTM) na odgovor na cijepljenje kod tovnih pilića. perad. Sci. 98: 1643-1647.

Imasato, A., C. Desbois-Mouthon, J. Han, H. Kai, ACB Cato, S. Akira i J. Li. 2002. Inhibicija p38 MAPK glukokortikoidima putem indukcije MAPK fosfataze-1 pojačava netipizirajući Haemophilus utjecajem induciranu ekspresiju toll-like receptora 2. J. Biol. Chem. 277: 47444-47450.

Kankkunen, P., L. Teiril€a, J. Rintahaka, H. Alenius, H. Wolff i S. Matikainen. 2010. (1,3)-beta-glukani aktiviraju i dektin-1 i NLRP3 upalu u ljudskim makrofagima. J. Immunol. 184:6335-6342.

Kim, HS, JY Kim, HK Lee, MS Kim, SR Lee, JS Kang, HM Kim, K. Lee, JT Hong, Y. Kim i S. Han. 2010. Aktivacija dendritičnih stanica glukanom izoliranim iz umbilicaria esculenta. Imun. Netw. 10:188-197.

Krueger, A., SC Fas, S. Baumann i PH Krammer. 2003. Uloga CD95 u regulaciji apoptoze perifernih T-stanica. Immunol. Otkr. 193:58–69.