Učinci Xiaoyaosana na CAMP signalni put u cerebralnom korteksu depresivnih štakora

 

Sažetak

Cilj:Procijeniti promjene u serumskom prostaglandinu E2 (PGE2) i supstanci P (SP) i ekspresiju mRNA cikličkog adenozin monofosfata (cAMP) i cAMP odgovornog proteina 1 (CREB1) u cerebralnom korteksu depresivnih štakora, te istražiti molekularni mehanizam kojim Xiaoyaosan ispoljava antidepresivne učinke.

Metode: Četrdeset osam muških SD štakora nasumično je raspoređeno u četiri skupine (svaka po n=12): normalni, model, Xiaoyaosan i fluoksetin. Model depresije uspostavljen je pomoću kroničnog imobilizacijskog stresa (CIS). Xiaoyaosan je primijenjen sondom 30 minuta prije dnevnog modeliranja tijekom 21 dana. Učinci slični antidepresivima procijenjeni su makroskopskim promatranjem ponašanja, testom preferiranja saharoze, testom otvorenog polja i testom prisilnog plivanja. Razine kortikalne cAMP i CREB1 mRNA kvantificirane su qPCR-om fluorescencije u stvarnom vremenu. PGE2 i SP u serumu mjereni su enzimski imunoanalizom (ELISA).

Rezultati: U usporedbi s modelnom skupinom, i Xiaoyaosan i fluoksetin značajno su ublažili ponašanje slično depresiji; povećana potrošnja saharoze, brojanje okomitog uzgoja, horizontalno križanje i njegovanje u testu na otvorenom; i smanjeno kumulativno vrijeme nepokretnosti u testu prisilnog plivanja. Oba tretmana poboljšala su kortikalnu histopatologiju, povećala ekspresiju cAMP i CREB1 mRNA u cerebralnom korteksu i smanjila razine PGE2 i SP u serumu (P <0,01).

Zaključak:Xiaoyaosan pokazuje jasne antidepresivne učinke kod depresivnih štakora, potencijalno preko regulacije kortikalnog cAMP signalnog puta.

Ključne riječi: Xiaoyaosan; Depresija; kamp; CREB1; Prostaglandin E2 (PGE2); Supstanca P (SP)

 

Uvod

Depresija je vodeći uzrok morbiditeta i invaliditeta diljem svijeta, duboko narušavajući kvalitetu života. Xiaoyaosan, klasična formula tradicionalne kineske medicine (TCM) koja sadrži više biljaka, pokazala je kliničku korisnost kod uobičajenih oblika depresije, podupirući njegov kontinuirani razvoj kao botaničke terapije.

Mehanički gledano, signalna kaskada cAMP–protein kinaza A (PKA)–CREB ključna je za regulaciju raspoloženja i afektivnog ponašanja. Smanjena regulacija ovog puta može precipitirati depresivne fenotipove. CREB je uključen u patofiziologiju depresije, a aktivacija cAMP-om pojačava transkripciju nizvodnih gena; polimorfizmi i funkcionalna smanjenja u ovoj osi smatraju se faktorima osjetljivosti na depresiju.

Upalni medijatori također doprinose depresiji. Prostaglandin E2 (PGE2) posreduje u upalnim odgovorima, a povišeni PGE2 može potaknuti depresivno ponašanje. Supstanca P (SP), neuropeptid povezan sa stresom i afektom, često je povišen u serumu pacijenata s depresijom. Stoga, promijenjena kortikalna ekspresija cAMP i CREB1 mRNA zajedno s povišenim serumskim PGE2 i SP može predstavljati molekularni mehanizam koji leži u osnovi kortikalne ozljede kod depresije.

Iako su brojne formule spojeva TCM-a istražene na antidepresivne mehanizme, utjecaj većine formula na cAMP put ostaje nejasan. Koristeći paradigmu kroničnog imobilizacijskog stresa (CIS) za induciranje ponašanja sličnog depresiji kod štakora, ova studija dalje istražuje antidepresivni mehanizam Xiaoyaosana i uspoređuje ga s fluoksetinom, s ciljem informiranja budućeg razvoja botaničke terapije i pružanja korisnih uvida za ljude koji traže pomoć za depresiju.

KAKO TCM BILJNI DODACI OLAKŠAVAJU SIMPTOME PROSTATITISA

Materijali

 

Životinje

Četrdeset osam zdravih odraslih mužjaka Sprague–Dawley štakora SPF stupnja (starih 8 tjedana, 200–220 g) kupljeno je od Beijing Viton Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd. [Br. licence: SCXK (Peking) 2016-0006]. Štakori su bili smješteni u barijernom objektu za životinje Sveučilišta tradicionalne kineske medicine Guizhou na 22 ± 2 stupnja, relativnoj vlažnosti 35%–55%, 12 h svjetla/12 h mraka (7:00–19:00), četiri štakora po kavezu, sa 7 dana aklimatizacije. Etičko odobrenje: Sveučilište Guizhou of TCM (br. 20210142).

KAKO TCM BILJNI DODACI OLAKŠAVAJU SIMPTOME PROSTATITISA

 

 

 

 

TCM BILJNI DODACI NA PRODAJU

Detalji popisa

 

 

 

Droge

Formula Xiaoyaosan slijedila je proporcije Taiping Huimin Heji Ju Fang. Sirovo bilje kupljeno je od Beijing Tongrentang (Bozhou) Decoction Pieces Co., Ltd.: Bupleurum (Chaihu), bijeli božur (Baishao), Angelica sinensis (Danggui), prženi Atractylodes (Baizhu), Poria (Fuling), sladić pržen u medu (Zhigancao), Mentha (Bohe) i svježi đumbir (Shengjiang), u kombinaciji u omjeru 5:5:5:5:5:4:1:5. Uvarak i koncentracija pripremljeni su u skladu s izdanjem Farmakopeje Narodne Republike Kine iz 2020. Hunan Jiuzhitanga, koja služi kao TCM intervencija. Doze su preračunate za štakore, otopljene u deioniziranoj vodi i pripremljene kao suspenzija.

Kao referentni antidepresiv korištene su kapsule fluoksetin hidroklorida (Patheon France; pakira Eli Lilly Suzhou Pharmaceutical Co., Ltd.; serija br. . 6663B; 20 mg/kapsuli).

Reagensi

ExTaq (TAKARA, kat. DRR100A); SYBR Green/Fluorescein qPCR glavna mješavina (2×) (Fermentas, kat. #K0242); primeri (Qingke Bio); Štakorski PGE2 i SP ELISA kompleti (Shanghai Yuanju Biotechnology Center, kat. CK-E30697 i CK-E30122).

 

instrumenti

7900 fluorescentni qPCR sustav u stvarnom vremenu (Applied Biosystems, SAD); mikropipete (Eppendorf); parafinski mikrotom (HY1508, Jinhua Huiyou); Aquapro sustav ultračiste vode (AJY-0501, Aikepu).

Metode

 

Grupiranje i modeliranje
Štakori su nasumično raspoređeni u normalne, modelne, Xiaoyaosan i fluoksetin skupine (n=12 svaka). Osim normalne skupine, sve su skupine bile podvrgnute CIS-u tijekom 3 h/dan u randomiziranim vremenima tijekom 21 dana. Normalni štakori nisu bili sputani, ali im je uskraćivana hrana i voda tijekom istih vremenskih okvira kako bi odgovaralo rukovanju.

 

Primjena lijekova

Na temelju prethodnih studija, Xiaoyaosan je davan gavažom u dozi od 2,22 g sirovog lijeka·kg−1·dan−1; fluoksetin u dozi od 2,0 mg·kg−1·dan−1. Lijekovi su otopljeni u deioniziranoj vodi. Doze su izračunate pretvorbom tjelesne površine; volumen sonde bio je 10 mL/kg, dan 30 minuta prije svake dnevne sesije obuzdavanja. Normalne i modelne skupine dobile su jednake količine deionizirane vode.

 

Mjere ishoda i postupci

 

3.1 Makroskopska promatranja

Dnevna promatranja bilježila su mentalni status, kretanje i opći izgled.

 

3.2 Test preferiranja saharoze

Štakori su trenirani 3 dana. Dan 1: dvije boce 1% saharoze po kavezu. 2. dan: jedna boca zamijenjena dvostruko destiliranom vodom jednakog volumena. Nakon 24 sata uskraćivanja hrane i vode, svaki je štakor dobio jednu bočicu 1% saharoze i jednu bočicu dvostruko destilirane vode tijekom 1 sata. Boce su izvagane da se izračuna prednost saharoze (%): unos saharoze / (saharoza + unos vode) × 100%.

 

3.3 Ispitivanje na otvorenom terenu

Otvoreno polje s crnim zidovima (125 cm × 125 cm × 50 cm) korišteno je u tihoj sobi. Štakori su postavljeni u središte; tijekom 5 minuta, zabilježeni su brojevi okomitog uzgoja, križanja vodoravne mreže i događaji njegovanja. Arena je očišćena 75%-tnim etanolom i vodom između pokusa.

 

3.4 Test prisilnog plivanja

Štakori su pojedinačno stavljeni u staklene cilindre s 35 cm vode na 20 ± 2 stupnja. Nakon uranjanja, ponašanje je zabilježeno 5 minuta kamerom visoke rezolucije. Mjereno je kumulativno vrijeme nepokretnosti tijekom 5 minuta (nepokretnost definirana kao minimalno kretanje da bi se nos zadržao iznad vode, lagana fleksija tijela radi ravnoteže). Voda se mijenjala između životinja.

3.5 Histopatologija

Štakori su anestezirani s 3% natrijevim pentobarbitalom (0,15 mL/100 g). Šest štakora po skupini podvrgnuto je transkardijalnoj perfuziji s 4% paraformaldehidom nakon čega je slijedila 0,9% fiziološka otopina za fiksaciju, dekapitaciju i ekstrakciju mozga. Mozgovi su uronjeni u 4% paraformaldehid (4 stupnja) na 72 sata, uklopljeni u parafin, podrezani i presječeni na ~5 μm. Sekcije su plutale na 48 stupnjeva, montirane, pečene na 60 stupnjeva 4 sata, deparafinizirane i rehidrirane, obojene hematoksilinom, diferencirane, isprane, obojene eozinom, dehidrirane, pročišćene i pokrivene za mikroskopsko ispitivanje. Preostalih šest štakora po skupini je eutanazirano; cerebralni korteks je brzo seciran na ledu i pohranjen na -80 stupnjeva za ekstrakciju RNK.

 

3.6 Kvantifikacija mRNA

Ciljne sekvence su preuzete iz NCBI-a i početnice dizajnirane s Primerom 6.0.

cAMP: naprijed 5′-CCGTGCTGTGGATGACTTCAACC-3′; Reverzni 5′-AGTCTCCTTCACTCGGAACCTCA-3′; 133 bp.

CREB1: Naprijed 5′-GGAGCAGACAACCAGCAGAGTG-3′; Revers 5'-GGATACCTGGGCTAATGTGGCA-3'; 105 bp.

GAPDH: Naprijed 5′-AAGGGCTCATGACCACAGTC-3′; Revers 5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3′; 116 bp.

qPCR uvjeti: preddenaturacija od 90 stupnjeva tijekom 30 s; 45 ciklusa od 95 stupnjeva 10 s, 60 stupnjeva 30 s, 72 stupnja 30 s. Analiza krivulje taljenja: 95 stupnjeva 1 min, 55 stupnjeva 1 min, 95 stupnjeva 1 min.

 

3.7 Serumski upalni čimbenici

Za ELISA: (i) postavite standarde i uzorke; dodati 50 μL standarda u stupnjevanim koncentracijama u standardne jažice; (ii) dodajte 40 μL razrjeđivača uzorka u jažice za slijepu probu i uzorak, zatim 10 μL uzorka i promiješajte; (iii) dodajte 100 μL enzimskog konjugata svim osim slijepim probama; (iv) zatvoriti i inkubirati na 37 stupnjeva 1 h; (v) razrijediti koncentrirani pufer za ispiranje 1:20; (vi) operite 5 puta i osušite; (vii) dodajte 50 μL supstrata A zatim 50 μL supstrata B, inkubirajte na 37 stupnjeva zaštićeno od svjetlosti 15 minuta; (viii) dodati stop otopinu; (ix) očitajte apsorbanciju na 450 nm sa slijepim probama postavljenim na nulu.

 

Statistička analiza

Podaci su analizirani u SPSS 26.0 i izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Nakon potvrde normalnosti i homogenosti varijance, korištena je jednosmjerna ANOVA. P < 0,05 smatra se statistički značajnim.

Napomena čitatelja za praktičare i ljude koji traže pomoć

Za programere botaničkih/TCM antidepresiva: Studija povezuje klasičnu formulu sa specifičnim neurobiološkim putem (cAMP–CREB) i upalnim medijatorima (PGE2, SP). Takvo dvojno signaliziranje modulacije i neuroplastičnosti plus upala – usklađuje se sa suvremenom biologijom depresije i može usmjeriti optimizaciju formule, odabir biomarkera i strategije kombiniranja sa SSRI-ima poput fluoksetina.

Za pojedince koji traže pomoć za depresiju: ​​Pretklinički rezultati ne mogu zamijeniti medicinsku skrb, ali sugeriraju da Xiaoyaosan može poboljšati depresivno ponašanje normaliziranjem moždanih signala i smanjenjem upalnih signala. Ako razmišljate o biljnim opcijama, posavjetujte se s kvalificiranim kliničarom, osobito ako ste na antidepresivima, kako biste izbjegli interakcije i osigurali doziranje i kontrolu kvalitete.

 

Prijelazni unos

Xiaoyaosan je poboljšao ponašanje, histologiju mozga i molekularne markere kod CIS-induciranih depresivnih štakora, vjerojatno preko regulacije kortikalne cAMP/CREB signalizacije uz istovremeno snižavanje perifernih PGE2 i SP. Nadovezujući se na ovo, sljedeća studija će secirati uzvodne regulatore cAMP-a (npr. izoforme adenilil ciklaze i fosfodiesteraze) i odrediti modulira li Xiaoyaosan izravno te mete ili djeluje primarno putem protuupalnih putova koji konvergiraju na CREB.