Cistanche glikozidi ublažavaju fibrozu prostate kod benigne hiperplazije prostate reguliranjem MiRNA‑483‑3p

 

SAŽETAK

Cilj:Istražiti poboljšanje učinaka glikozida cistanhe na fibrozu prostate kod benigne hiperplazije prostate (BPH) i mehanizam koji uključuje regulaciju mikroRNA (miRNA)-483-3p.

Metode:Muški miševi nasumično su raspoređeni u pet skupina: normalna kontrola, kontrola modela BPH, finasterid, cistanhe glikozidi i cistanhe glikozidi + antagonist miRNA-483-3p. Model BHP je uspostavljen bilateralnom orhiektomijom praćenom svakodnevnom supkutanom injekcijom testosteron propionata. Nakon 30 dana taloženje kolagena u prostati procijenjeno je bojanjem Massonovim trikromom i Sirius crvenim te je izmjeren sadržaj hidroksiprolina (Hyp). Razine mRNA prostate transformirajućeg faktora rasta-1 (TGF-1), mitogenom aktivirane protein kinaze 2 (MK2) i mitogenom aktivirane protein kinaze kinaze 6 (MKK6), kao i razine miRNA-483-3p, određene su kvantitativnom PCR-om u stvarnom vremenu (qPCR). Razine proteina prostate TGF-1, MK2, fosforiliranog MK2 (p-MK2), MKK6 i fosforiliranog MKK6 (p-MKK6) procijenjene su Western blottingom. Izravno vezanje miRNA-483-3p na MK2 ispitano je pomoću testa reportera luciferaze.

Rezultati:U odnosu na normalnu kontrolnu skupinu, kontrolna skupina s modelom BPH pokazala je značajno povećano taloženje kolagena u prostati; povišene razine mRNA TGF‑ 1, MK2 i MKK6; i više razine proteina TGF-1, p-MK2 i p-MKK6 (svi P < 0,01), dok su razine miRNA-483-3p značajno smanjene (P < 0,01). U usporedbi s kontrolnom skupinom modela BPH, glikozidi cistanhe regulirali su miRNA-483-3p, smanjili razine mRNA TGF-1, MK2 i MKK6, snizili razine proteina TGF-1, p-MK2 i p-MKK6 i ublažili taloženje kolagena u prostati. Naime, istodobna primjena miRNA-483-3p antagomira s glikozidima cistanhe značajno je smanjila miRNA-483-3p, povećalo taloženje kolagena i povišene razine mRNA TGF-1, MK2 i MKK6, kao i razine proteina TGF-1, p-MK2 i p‑MKK6 u usporedbi sa samim glikozidima cistanhe (svi P <0,01). Analiza luciferaze pokazala je da miRNA-483-3p izravno cilja na MK2.

Zaključak: Cistanche glikozidi ublažavaju fibrozu prostate kod BPH reguliranjem miRNA-483-3p i inhibicijom MK2 signalizacije.

Ključne riječi: Cistanche glikozidi; miRNA-483-3p; prostata;fibroza; benigna hiperplazija prostate

 

 

 

Cistanche Deserticola vrhunske kvalitete

Više znanja o biljci za liječenje BPH

 

Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
 

 

Uvod

Benigna hiperplazija prostate (BPH)je uobičajeno stanje kod sredovječnih i starijih muškaraca, a prevalencija raste s godinama. Izvješća pokazuju da prevalencija BPH prelazi 50% među muškarcima starijim od 50 godina. BHP i pridruženi simptomi donjeg urinarnog trakta (LUTS) predstavljaju značajno opterećenje za kvalitetu života i dugoročne troškove zdravstvene skrbi. Klinički se kao farmakoterapija preporučuju 5 -inhibitori reduktaze i blokatori ‑adrenergičkih receptora. Međutim, ‑blokatori ne smanjuju volumen prostate, a 25-30% pacijenata ne pokazuje poboljšanje LUTS-a s 5 -inhibitorima reduktaze; štoviše, 5–7% se može čak i pogoršati. Iako se kirurške inovacije kao što je prostatektomija s tulij laserom sve više koriste u usporedbi s transuretralnom resekcijom prostate, postoperativni LUTS i dalje se javljaju u stopama većim od 23%.

Sadašnji dokazi upućuju na tri glavna patobiološka procesa u BHP: hiperplazija žlijezda, kontrakcija glatkih mišića i fibroza prostate. Ovi procesi djeluju neovisno ili sinergistički kako bi potaknuli kliničko napredovanje. BPH obično (iako ne uvijek) koegzistira s LUTS-om; fibroza, karakterizirana prekomjernim taloženjem izvanstaničnog matriksa, ugrožava fleksibilnost uretre unutar prostate i doprinosi urinarnoj opstrukciji. Ipak, terapijske mogućnosti usmjerene na fibrozu organa ostaju ograničene.

Cistanche (Cistanche spp.) tradicionalna je ljekovita i prehrambena biljka. Njegovi karakteristični feniletanoidni glikozidi (ovdje se zajedno nazivaju cistanche glikozidi, kao što su ehinakozid i akteozid) pokazuju široku bioaktivnost, uključujući antimikrobne, hipolipidemijske, antialergijske, kardiotoničke, antidijabetičke, antitumorske, neuroprotektivne, antioksidativne i imunomodulatorne učinke. Nagomilani dokazi ukazuju na antifibrotičko djelovanje ovih glikozida u organima kao što su bubrezi, pluća, srce i jetra. Međutim, njihovi učinci na fibrozu prostate nisu zabilježeni. Ova studija ispitala je utjecaj glikozida cistanhe na fibrozu prostate i istražila temeljne mehanizme, usredotočujući se na os miRNA-483-3p/MK2 relevantnu za remodeliranje izvanstaničnog matriksa.

Cistanche Deserticola vrhunske kvalitete

 

Materijali i metode

Materijali

 

miRNA‑483‑3p antagomir (kemijski modificiran): kupljen od Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Broj serije: 12953).

Testosteron propionat injekcija: Tianjin Jinyao Pharmaceutical Co., Ltd. (Broj serije: 150822).

Cistanche glikozidi: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (čistoća veća ili jednaka 98%, serija br.: M14062). Napomena za razvijače nutraceutika: materijal odgovara standardiziranoj frakciji feniletanoidnih glikozida; osigurati specifikaciju HPLC sadržaja (npr. ukupni PEGL, ehinakozid/akteozid).

Finasterid tablete: MSD (Hangzhou) Pharmaceutical Co., Ltd. (Broj serije: U011856; 5 mg/tableta).

Kit za analizu reportera luciferaze (Broj serije: E2920) i vektor psiCHECK‑2 (Broj serije: C8021): Promega (SAD).

Komplet za detekciju qPCR: KAPA Biosystems (Broj serije: KM4101).

Komplet za analizu hidroksiprolina (Hyp): Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Broj serije: 20190626).

Primere za TGF‑ 1, MK2 i MKK6 sintetizirao je Wuhan Tianyi Huiyuan Biotechnology Co., Ltd.

Cistanche Deserticola vrhunske kvalitete

 

Životinje

Sedam tjedana stari miševi C57BL/6 bez specifičnih patogena (SPF) (22-24 g) dobiveni su s Poljoprivrednog sveučilišta Huazhong (dozvola za proizvodnju br.: SCXK Hubei 2015-0019). Životinje su bile smještene na 23 ± 2 stupnja, 50 ± 5% vlažnosti, pod ciklusom 12 h svjetlo/12 h tama.

 

Oprema

 

StepOnePlus PCR sustav u stvarnom vremenu (Applied Biosystems, SAD).

Luminoskan 5200110 mikropločni luminometar (Thermo Fisher Scientific, SAD).

Eksperimentalni dizajn i BPH model
Nakon 1 tjedna aklimatizacije, miševi su nasumično raspoređeni (tablica nasumičnog broja) u pet skupina (n=6 po skupini): normalna kontrola, kontrola modela BHP, finasterid, glikozidi cistanhe i glikozidi cistanhe + miRNA-483-3p antagomir. Model BHP izazvan je kirurškom kastracijom plus dnevnom potkožnom injekcijom testosteron propionata u dozi od 7,5 mg·kg⁻¹ tijekom 30 dana. Skupina s finasteridom primala je oralni finasterid 1 mg·kg⁻¹ dnevno (otopljen u 0,5% CMC-Na). Skupina koja je primala cistanhe glikozide oralno je primala cistanhe glikozide od 100 mg·kg⁻¹ dnevno. Kombinirana skupina primala je oralne glikozide cistanhe 100 mg·kg⁻¹ dnevno plus injekciju miRNA-483-3p antagomira u dozi od 10 mg·kg⁻¹ svakih 5 dana u skladu s uputama proizvođača. Kontrolne skupine s normalnim i BHP modelom primile su jednak volumen od 0,5% CMC‑Na oralno.

Nakon 30 dana, miševi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom natrijevog pentobarbitala (80 mg·kg⁻¹) i eutanazirani dislokacijom cerviksa. Prostata je izrezana; dijelovi su fiksirani i ugrađeni za bojanje Massonovim trikromom i Sirius crvenim, a svježa tkiva obrađena su za qPCR, Western blotting i biokemijske testove. Postupci sa životinjama bili su u skladu s propisima provincije Hubei o upravljanju laboratorijskim životinjama (Kvalifikacija operatera br.: TY20190784).

Cistanche Deserticola vrhunske kvalitete

 

Procjena fibroze prostate

Taloženje kolagena procijenjeno je Sirius Red i Massonovim trikromnim bojenjem. Hyp sadržaj u tkivu prostate kvantificiran je prema uputama za komplet. Za svaki slajd analizirana su tri nasumična polja pomoću programa Image‑Pro Plus 6.0 kako bi se izračunao postotak pozitivno obojenog područja.

Evaluacija aktivnosti puta MK2

qPCR: izmjerene su razine mRNA prostate MK2, TGF‑ 1 i MKK6. Prajmer sekvence:

MK2 (264 bp) naprijed 5'-GGAAGTGCCTGCTGAT-3', obrnuto 5'-AGTTGTGACTGGTGGTTT-3';

TGF‑ 1 (153 bp) naprijed 5'-AGGAGACGGAATACAGGG-3', obrnuto 5'-ATGAGGAGCAGGAAGGG-3';

MKK6 (146 bp) naprijed 5'-CCTCAGACCAGTTCCAC-3', obrnuto 5'-CGCATCTTCTCCACCA-3'.

Western blot: razine proteina TGF‑1, MK2, p‑MK2, MKK6 i p‑MKK6 određene su prema prethodno utvrđenim protokolima.

Mjerenje miRNA‑483‑3p
miRNA‑483‑3p početnice: naprijed 5'-GGGTCACTCCTCCCCT-3', obrnuto 5'-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'; RT primer 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAGACGGG-3'. qPCR je izveden prema uputama za komplet.

 

Luciferaza reporter test

MK2 3'UTR je kloniran u psiCHECK-2 vektor za konstruiranje reporterskih plazmida divljeg tipa (WT) i mutantnih (MUT). Stanice HEK-293T kotransficirane su s miRNA-483-3p i reporterskim plazmidima pomoću Lipofectamine 3000; kontrolne stanice primile su prazan vektor. Nakon 24 sata izmjerena je aktivnost luciferaze prema protokolu kita.

Statistička analiza
Podaci su analizirani pomoću SPSS 17.0. Nakon potvrde normalnosti i homogenosti varijance primijenjena je jednosmjerna ANOVA. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. LSD post hoc testovi korišteni su za višestruke usporedbe. Razlike su smatrane statistički značajnim pri P < 0,05.

 

Rezultati

U usporedbi s normalnom kontrolnom skupinom, kontrolna skupina s modelom BPH pokazala je značajno povećanje taloženja kolagena u prostati; povećana ekspresija mRNA TGF‑ 1, MK2 i MKK6; i više razine proteina TGF‑ 1, p‑MK2 i p‑MKK6 (svi P < 0,01). razine miRNA-483-3p bile su značajno smanjene (P <0,01).

U odnosu na kontrolu modela BPH, glikozidi cistanhe značajno su regulirali miRNA-483-3p, smanjili razine mRNA TGF-1, MK2 i MKK6, snizili razine proteina TGF-1, p-MK2 i p-MKK6 i ublažili taloženje kolagena u prostati.

U usporedbi sa samim glikozidima cistanhe, kombinacija glikozida cistanhe s miRNA-483-3p antagomirom značajno je smanjila miRNA-483-3p i povećalo taloženje kolagena, plus razine mRNA TGF-1, MK2 i MKK6, kao i razine proteina TGF-1, p-MK2 i p-MKK6 (svi P < 0,01).

Test luciferaze reporter potvrdio je da miRNA-483-3p izravno cilja na MK2.

 

Rasprava (kratka, usmjerena na nutraceutike)

Ova studija pokazuje da glikozidi cistanhe ublažavaju fibrozu prostate u modelu BHP izazvanog kastracijom/testosteronom tako što reguliraju miRNA-483-3p i potiskuju aktivnost MK2 puta nizvodno od TGF-signalizacije. S obzirom na ograničenja trenutnih farmakoterapija za BHP u rješavanju fibroznog preoblikovanja, cistanche glikozidi mogu predstavljati komplementarnu nutraceutsku strategiju usmjerenu na ravnotežu izvanstaničnog matriksa.

Za razvoj dodataka prehrani razmatranja uključuju:

Standardizacija: definirati ukupne feniletanoidne glikozide i markerske spojeve (npr. ehinakozid veći ili jednak 20%, akteozid veći ili jednak 10% pomoću HPLC).

Prijevod doze: 100 mg·kg⁻¹ kod miševa približno je 8-12 mg·kg⁻¹ ekvivalentne doze za čovjeka (HED) korištenjem skaliranja površine tijela, otprilike 500-800 mg/dan za odraslu osobu od 60-70 kg; potrebna je klinička validacija.

Kvaliteta i sigurnost: osigurajte identitet (botanički izvor, kontaminanti, teški metali, pesticidi) i procijenite potencijalne interakcije s ‑blokatorima ili inhibitorima 5-reduktaze.

Tvrdnje: tvrdnje o strukturi/funkciji trebaju se usredotočiti na "podržavanje protoka mokraće i ravnoteže tkiva prostate" i izbjegavati jezik liječenja bolesti bez kliničkih dokaza.

 

Zaključci

Cistanche glikozidiublažiti fibrozu prostate kod BPH reguliranjem miRNA-483-3p i inhibicijom MK2 signalizacije. Ovi nalazi podupiru daljnja translacijska istraživanja standardiziranih ekstrakata cistanke kao pomoćnih nutraceutika za zdravlje prostate.

 

Priznanja

Ovaj je rad podržala Nacionalna zaklada za prirodne znanosti Kine (grant br. . 81703594).

Podaci o autoru
Yang Chuhao (1991–), žena, Wuhan, Hubei, klinički farmaceut, MS; glavno znanstveno područje: klinička farmacija. ORCID: 0000-0002-8921-5758; Tel: +86-27-82440854.