Ciljanje mitohondrija putem biljnih sekundarnih metabolita: strategija koja obećava u borbi protiv Parkinsonove bolesti

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Sažetak

Parkinsonova bolestbolest(PD) jedan je od najraširenijih i najoslabljujućihneurodegenerativniuvjetima i trenutno je u porastu. Iza patogeneze PD-a stoji nekoliko nereguliranih putova; međutim, kritični ciljevi ostaju nejasni. Sukladno tome, hitno je potrebno otkriti ključne neregulirane putove u PD-u. Prevladavajuća izvješća naglašavaju važnost mitohondrijskih i unakrsnih medijatora u neurološkim poremećajima, genetskim promjenama i povezanim komplikacijama PD-a. Višestruki patofiziološki mehanizmi PD-a, kao i niska učinkovitost i nuspojave konvencionalnih neuroprotektivnih terapija, pokreću potrebu za pronalaskom novih alternativnih sredstava. Nedavno je mnogo pažnje posvećeno korištenju biljnih sekundarnih metabolita (npr. flavonoida/fenolnih spojeva, alkaloida i terpenoida) u modulaciji manifestacija povezanih s PD-om ciljanjem mitohondrija. U tom smislu, biljni sekundarni metaboliti pokazali su obećavajući potencijal za istovremenu modulaciju mitohondrijske apoptoze i reaktivnih kisikovih vrsta. Ovaj je pregled imao za cilj pozabaviti se mitohondrijima i višestrukim disreguliranim putovima u PD-u sekundarnim metabolitima biljnog podrijetla.

Ključne riječi:neurodegenerativnibolest;Parkinsonova bolestbolest; sekundarni metaboliti; fitokemikalije; mitohondriji; signalni put

cistanche bienfaits

1. Uvod

Ljudi su oduvijek bili pogođeni raznim neurološkim komplikacijama [1,2].Neurodegenerativnibolesti uvelike utječu na središnji i periferni živčani sustav i dovode do gubitka fizičkih i mentalnih funkcija [3,4]. Nekoliko mehanizama stoji iza neurodegeneracije, uključujući neuronsku upalu, oksidativni stres, apoptozu, autofagiju koji uzrokuju staničnu smrt [1,3,5].

Uzimajući u obzir uključenost višestrukih disreguliranih putova u patogenezi neurodegenerativnih bolesti, otkrivanje kritičnih signalnih putova u takvim poremećajima čini se da utire put za razvoj alternativnih terapija. U skladu s tim, čini se da su poremećaji povezani s mitohondrijima, kao i međusobno povezani oksidativni stres i reaktivne kisikove vrste (ROS) uobičajeni posrednici uključeni u neurodegeneraciju [1,5]. U tom smislu, ciljanje signalnih putova povezanih s mitohondrijima moglo bi otvoriti nove puteve u borbi protivParkinsonova bolestbolest(PD), ishemijska ozljeda mozga (IBI), ozljeda leđne moždine (SCI), Alzheimerova bolest (AD), Huntingtonova bolest (HD), multipla skleroza (MS) i amiotrofična lateralna bolest (ALS) [6-8].

Sajad Fakhri 1,†, Sadaf Abdian 2,† , Seyede Nazanin Zarneshan 2, Esra Küpeli Akkol 3 , Mohammad Hosein Farzaei 1,* i Eduardo Sobarzo-Sánchez 4,5,*

1 Istraživački centar za farmaceutske znanosti, Zdravstveni institut, Sveučilište medicinskih znanosti Kermanshah, Kermanshah 6734667149, Iran;

2 Studentski istraživački odbor, Sveučilište medicinskih znanosti Kermanshah, Kermanshah 6734667149, Iran; abdian.ph@gmail.com (SA);

3 Zavod za farmakognoziju, Farmaceutski fakultet, Sveučilište Gazi, 06330 Ankara, Turska;

4 Zavod za organsku kemiju, Farmaceutski fakultet, Sveučilište Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Španjolska

5 Instituto de Investigación y Postgrado, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Central de Chile, Santiago 8330507, Čile

Mitohondriji su vitalne komponente eukariotskih stanica i odgovorni su za proizvodnju stanične energije [7,8], posebno za aktivnije stanice u tijelu [9]. Mitohondriji opskrbljuju ovu energiju putem mehanizama oksidativne fosforilacije pomoću povezanih kompleksa [10]. Osim zadaće proizvodnje energije, mitohondriji su također uključeni u procese vezane uz preživljavanje/smrt stanice, kao i održavanje ravnoteže iona i staničnih metala [5]. Te različite funkcije u mitohondrijima obavljaju sastavni elementi u normalnim uvjetima stanične ravnoteže [8]. Pod neuronskim disfunkcionalnostima, gore spomenuta stanična ravnoteža je izgubljena, a mitohondrijska funkcija u neuronskim stanicama je oštećena [8,11]. U takvoj situaciji oštećenja neurona, mitohondriji se susreću s disregulacijom u proizvodnji ROS i osjetljivosti na oksidativni stres, što dovodi do oštećenja stanica [12,13]. Funkcionalne i morfološke promjene u mitohondrijima i abnormalnosti u njihovim enzimima dovode do oštećenja živaca i posljedičnih neurodegenerativnih bolesti [8]. Sukladno tome, mitohondrijska disfunkcija jedan je od uzroka neurodegenerativnih bolesti [5,8,12].

Cistancheimaneuroprotektivniučinci

U neurodegenerativnim bolestima mitohondriji igraju ključnu ulogu u opskrbi energijom i stabilnosti živčanih stanica kako bi se spriječilo uništavanje dopaminergičkih neurona u PD-u. Osim toga, uloga mitohondrijskih toksina također je neporeciva. Na primjer, 1- metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) blokirao je aktivnost kompleksa I u mitohondrijima, povećao proizvodnju ROS-a i povećao oslobađanje apoptogenih proteina, što u konačnici uzrokuje smrt stanice [14,15]. Osim toga, mitohondriji su blisko povezani s nekoliko nereguliranih putova u PD-u.

Dakle, simultano ciljanje mitohondrija i bliskih posrednika u međusobnom razgovoru moglo bi otvoriti put za borbu protiv PD-a. Ne postoji siguran lijek za PD i druge NDD-ove, ali su korištene različite strategije za kontrolu povezanih simptoma utjecanjem na neregulirane mehanizme [16]. S obzirom na višu razinu nuspojava i nižu učinkovitost sintetskih terapija u borbi protiv neuronskih komplikacija, prirodni proizvodi su privukli pozornost prema novim alternativnim terapijama [17-19]. Posljedično, sekundarni metaboliti biljnog porijekla od velike su važnosti u modulaciji mitohondrijskih poremećaja i međusobno povezanih upalnih/oksidativnih putova kod neuronskih poremećaja [8,19]. Ovi sekundarni metaboliti istovremeno smanjuju funkciju mitohondrija putem nekoliko mehanizama, uključujući inhibiciju mitohondrijskih kompleksa i putova povezanih s ROS-om, supresiju apoptotičkih putova i sprječavanje proizvodnje pogrešno savijenih agregata -sinukleina [20,21].

Prethodna studija je pregledala ulogu flavonoida u usmjeravanju mitohondrija prema citoprotekciji [22]. Uključenost fosfoinozitid 3-kinaza (PI3K)/protein kinaze B (Akt) i faktora 2 povezanog s nuklearnim faktorom eritroid-2- (Nrf2) također je naglašena u modulaciji mitohondrijske aktivnosti tijekom PD [23,24]. Međutim, malo je potencijalnih alternativnih terapija uvedeno u modulaciju mitohondrijskih aktivnosti. Ovo je prvi pregled o ciljanju mitohondrijskih putova sekundarnim metabolitima biljaka i modulaciji patoloških stanja u PD-u.

2. Mitohondriji u PD

PB je jedna od najčešćih neuroloških bolesti sa specifičnim simptomima, uključujući tremor u mirovanju, rigiditet i bradikineziju [8,25]. Povećanjem prosječne dobi ljudi očekuje se povećanje broja oboljelih [11,26]. Prosječna dob bolesnika s PD-om je preko 50 godina, ali s obzirom na utjecaj različitih okolišnih i genetskih čimbenika, PD se može pojaviti iu mlađoj dobi s različitim simptomima [26]. Simptomi uključuju oslabljenu bradikineziju, nevoljne pokrete, ukočenost i probleme povezane s mentalnim poremećajima [3,26]. Iako su brojni molekularni mehanizmi uključeni u patogenezu neurodegeneracije, sinaptička destrukcija dopamina i mitohondrijska disfunkcija glavni su igrači [8]. Temeljnu neuropatologiju PB karakterizira postupno smanjenje dopaminergičkih neurona u substantia nigra pars compacta (SNc), kao i postojanje Lewyjevih tjelešaca (LB) i Lewyjevih neurita (LN) [26]. Ovi proteini potječu iz -sinukleina, presinaptičkog proteina u neuronskim stanicama, i razaranja dopaminergičkih neurona [25], uključenih u obiteljsku i intermitentnu PD. Da bi obavljali svoju funkciju, neuroni trebaju opskrbu energijom koju osiguravaju mitohondriji [8,27]. Osim toga, mitohondriji također igraju vitalnu ulogu u održavanju stabilnosti živčanih stanica. Dakle, poremećajem mehanizama povezanih s mitohondrijima, živčane stanice nailaze na oštećenje, praćeno pojavom neurodegenerativnih bolesti, posebice PB [8,12].

Detaljno, tijekom PD-a, disregulacija mitohondrijskog lanca prijenosa elektrona (ETC) i kompleksa I, II, III, IV, V dovodi do promjena u staničnoj energiji, povećava oksidativni stres, uzrokuje mutacije u mitohondrijskom genomu, uzrokuje deformitete DNA i mijenja gene uključene u PD [28]. Što se tiče uloge mitohondrijskih kompleksa, pet enzimskih podskupova uključeno je u proizvodnju energije sustava oksidativne fosforilacije u mitohondrijima migracijom elektrona. Kompleksi se nazivaju kompleks I (ubikinon oksidoreduktaza ili NADH dehidrogenaza), kompleks II (sukcinat dehidrogenaza), kompleks III (citokrom c-oksidoreduktaza ili citokrom bc1), kompleks IV (citokrom c oksidaza) i kompleks V (ATP sintaza) [25]. ]. Mitohondriji imaju tri enzimska kompleksa koji proizvode različite količine ROS [12]. Kompleks I, ili NADH CoQ reduktaza, jedan je od najvažnijih primarnih proizvođača ROS u mitohondrijima. Promjene u strukturi ovog kompleksa i oksidacijskih medijatora uključeni su u razvoj PD [29]. Blokatori mitohondrijskog kompleksa I ETC uzrokuju PD kod ljudi i životinja, a nokauti parkina ili DJ-1, koji su povezani s nasljednim PD-om, pokazuju oslabljenu aktivnost mitohondrija [30]. Inhibitori koji ometaju funkciju kompleksa I, kao što su rotenon i MPTP, dovode do PD-a. MPTP je značajno smanjio dopamin i njegove metabolite, koji uključuju 3,4-dihidroksifeniloctenu kiselinu (DOPAC) i homovanilinsku kiselinu (HVA) u striatumu [15]. Stvaranje MPTP-a u PD-u uzrokovano je abnormalnostima mitohondrija. Uključuje slijed incidenata kao što je depolarizacija unutarnje mitohondrijske membrane (IMM), oštećena oksidativna fosforilacija, povećana proizvodnja ROS-a, oticanje matriksa mitohondrija, odvijanje IMM krista, gubitak Ca2 plus homeostaze i otpuštanje apoptogenih proteina preko vanjske mitohondrijske membrane ( OMM), što konačno rezultira smrću stanice [14]. Kompleks III, slično kompleksu I, izvor je ROS u mitohondrijima [12,13]. U tom smislu, toksini MPTP, rotenon, piridaben, trikloroetilen i fenpiroksimat povezani s PD-om ometaju normalno funkcioniranje enzima/kompleksa mitohondrija i uzrokuju oštećenje neuronskih stanica [25]. Tijekom procesa proizvodnje mitohondrijske energije stvaraju se i ROS, što utječe na normalnu funkciju neuronskih stanica [25].

cistanche bodybuilding

Osim toga, mutacija u genomima mitohondrija i živčanih stanica još je jedan povezani mehanizam poremećaja. Sukladno tome, mutacije 12SrRNA i G11778A u mitohondrijskoj DNA praćene promjenama u genima koji su uključeni u PD u neuronskim stanicama kao što su PINK1 (PTEN-inducirana kinaza 1), PARK2 (parkin), DJ-1 i LRRKS (bogati leucinom ponavljanje kinaze) dovode do proizvodnje ROS. Taj je proces posljedica neravnoteže između mitohondrija i ROS-a, kao i gubitka stanične zaštite od oksidativnog stresa, autofagije mitohondrija i povećanja stope -sinukleina [8,25].

Među ostalim mehanizmima, abnormalnosti u fisiji i fuziji mitohondrija igraju značajnu ulogu u PD-u. Dok je mitohondrijska disfunkcija dobro poznata u PD-u, uloge mitohondrijske fisije, Drp1 i fuzijske neravnoteže ostaju nepoznate. Nepravilne mitohondrijske interakcije s proteinom Drp1 (fisijski protein uključen u fragmentaciju mitohondrija) odgovorne su za fisiju mitohondrija i povezane neregulirane proteine ​​uključene u PD [8].

Pojačana proizvodnja Drp1, s druge strane, sprječava disfunkciju mišića. Osim toga, mutacije PINK1 povezane su s naslijeđenom PD. Mitohondrijska fisija je stimulirana putem PINK1/parkin, a povezani mutanti disreguliraju mitohondrijsku i stabilnost tkiva kroz smanjenje mitohondrijske fisije. Mutacije u proteinima -sinuklein, Parkin, PINK1 i DJ1 koreliraju s mitohondrijskom neispravnošću neurona u PD [8]. U stanicama SH-SY5Y, rušenje PINK1 ravnoteže uzrokovalo je poremećaje u mitohondrijskoj aktivnosti i autofagiji, koji su svi poništeni kada je ponovno uveden plazmid otporan na RNA interferenciju (RNAi) za PINK1. Osim toga, mitohondrijske morfološke promjene uzrokovane su mutacijama PINK1 i promotorima fuzije mitohondrija, mitofuzinom 2 (Opa1) i fuzijom 1 (Mfn2) [8]. LRRK2, EIF4G1, VPS35 i PARK7 drugi su čimbenici povezani s genetikom koji igraju kritičnu ulogu u PD-u. A30P, E46K i A53T missense mutacije u –sinukleinu povećavaju sklonost proteina -sinukleina da konstruira -listove, koji se kombiniraju i tvore LB-ove. Nekoliko primjera ovog mutantnog gena pronađeno je u različitim nasljednim slučajevima PD [26]. Osim toga, drugi čimbenici koji predisponiraju osobu za PD uključuju toksine i nedostatak željeza u obrocima [26].

Nrf2 je ključni modulator detoksikacijskih gena koji pomažu tijelu da izdrži oksidativni stres [15]. Iznenađujuće, nova istraživanja sugeriraju da proizvodnja polo-like kinaze 2 (PLK2) potiče antioksidativno signaliziranje fosforilacijom glikogen sintaze kinaze 3 (GSK-3), pospješujući nuklearni prijenos Nrf2, čime se aktiviraju elementi antioksidativnog odgovora (ARE). . Ovaj PLK2 mogao bi igrati bitnu ulogu u modulaciji mitohondrijske funkcije [15].

Levodopa je jedan od primarnih lijekova koji se koriste u PD-u, a djeluje na opskrbu dopaminom kao svojim metaboličkim prekursorom [31]. Uz levodopu i druge konvencionalne terapije, povećan je fokus na prirodne proizvode i sekundarne metabolite [19,25,31]. Konvencionalni tretmani PD-a temelje se na mehanizmu poremećaja, opskrbe i skladištenja dopamina u neuronima [31]. U posljednjih nekoliko godina, biljni sekundarni metaboliti su kritične alternativne terapije u borbi protiv neurodegenerativnih bolesti, s fokusom na PB.

3. Biljni sekundarni metaboliti i mitohondriji

Kao što je već spomenuto, biljni sekundarni metaboliti imaju različita svojstva u kontroli i liječenju raznih neuroloških bolesti [19]. Korištenje sekundarnih metabolita moglo bi utjecati na mehanizme modulacije disfunkcije živčanih stanica [13]. S mehaničkog gledišta, ti su metaboliti pokazali različite antioksidativne, protuupalne i antiapoptotičke učinke povezane s mitohondrijskim događajima u kontroli i prevenciji neurodegenerativnih bolesti [26]. Također postoji značajan odnos između konzumacije ovih metabolita i poboljšanja neurodegenerativnih bolesti ciljanjem mitohondrija [21].

Napore da se zaštite mitohondrije i spriječi rizik od apoptoze i oksidativnog stresa utječu putevi fitokemikalija povezani s ROS [18,32] (Slika 1). Sekundarni biljni metaboliti također imaju antioksidativne i modulatorne učinke na mitohondrijski kompleks/enzime živčanih stanica stimulacijom mitohondrijske biosinteze putem sirtuina1 (SIRT1), gama koaktivatora receptora 1-alfa (PGC-1) ​​aktiviranog proliferatorom peroksisoma. , transkripcijski faktor A, mitohondrijske (TFAM) i Nrf1 staze koje blokiraju fisiju mitohondrija [33] i održavaju stabilnost njezine membrane [32].

4. Modulacija PD fitokemikalijama kroz ciljanje mitohondrija

Sekundarni metaboliti pokazali su obećavajuće učinke na neurodegenerativne bolesti, posebno na PD, ciljanjem na mitohondrije [19,25,34]. PB je složena neurodegenerativna bolest karakterizirana mitohondrijskom disfunkcijom, oksidativnim stresom i neuroinflamacijom. U ovom redu, učinci polifenola, terpena/terpenoida i alkaloida istaknuti su na mitohondrije u PD kroz različite mehanizme.

4.1. Učinci polifenola na mitohondrije u PD

Polifenoli su ključni sekundarni metaboliti u modulaciji mitohondrija tijekom PD-a. Ovi sekundarni metaboliti imaju strukturu koja se temelji na fenilnim prstenovima, uključujući četiri glavne kategorije flavonoida, lignana, stilbena i fenolnih kiselina [6,13,25]. Flavonoidi pak imaju sedam podjedinica koje uključuju flavonol, flavon, flavanon, flavanonol, flavanol, antocijanin i izoflavon [13,35]. Polifenoli sprječavaju proizvodnju pogrešno savijene agregacije -sinukleina, kao i ublažavaju oksidativni stres, apoptotske i upalne procese uzrokovane kvarom mitohondrija [21].

Baicalein je vodeći aktivni flavonski element korijena Scutellaria baicalensis i smanjuje kvar mitohondrija u in vivo i in vitro eksperimentima izazvan 6-hidroksidopaminom (6-OHDA) [36,37]. U izoliranom mitohondriju mozga, liječenje baicaleinom smanjilo je stvaranje ROS-a izazvano rotenonom, nedostatak ATP-a i oticanje mitohondrija. Zanimljivo, baicalein je povećao mitohondrijsko respiratorno djelovanje u izoliranim mitohondrijima. Ova otkrića upućuju na to da je baicalein pravi antioksidans s mitohondrijskim ciljanjem s preventivnim svojstvima protiv neurotoksičnosti izazvane rotenonom [38].

Puerarin, izoflavon dobiven iz Pueraria thomsonii, pokazao je terapeutske učinke na mitohondrije smanjenjem toksičnosti 1-metil-4-fenilpiridinija (MPP plus) - induciranog in vitro modela PD [36]. U stanicama PC12 i primarnim neuronima srednjeg mozga štakora, puerarin je smanjio neurotoksičnost posredovanu dušikovim oksidom (NO) u PD-u putem regulacije mitohondrijskog enzima arginaze-2 za selektivnu regulaciju mitohondrijske disfunkcije [39]. Dodatno, neispravnost ubikvitin-proteasomskog sustava u neuronu opsežno je utvrđena kao pogoršanje PD-a. Puerarin je također spriječio apoptozu u MPP plus-induciranim SH-SY5Y stanicama povećanjem preživljavanja stanica, povećanjem morfoloških promjena i smanjenjem stope apoptoze modulacijom ubikvitin-proteasomskog sustava [40]. U drugoj studiji, flavonoidi su ukazali na terapijski potencijal mitohondrijskog enzimskog kompleksa I (npr. luteolin, fisetin, robinet, miricetin, ramnetin i baikalein) i III (npr. hispidulin i eupafolin) [13]. Osim toga, flavonoidi su se branili od smanjenja dopamina i inicijacije ROS-a u PD [25].

Polifenolne tvari kao što su kvercetin i resveratrol u crnom vinu također su pokazale terapeutski potencijal na mitohondrije inhibicijom apoptoze [13,20]. Tretman resveratrolom također je obnovio potencijal mitohondrijske membrane izazvan rotenonom, izmijenio dinamiku mitohondrija i izdužio fragmentirane mitohondrije u stanicama SH-SY5Y [41]. Kvercetin je također igrao bitnu ulogu u promicanju mitohondrijske biogeneze [42]. U stanicama SH-SY5Y izloženim MPP plus ili lipopolisaharidima (LPS), predtretman kvercetinom znatno je smanjio oštećenja mitohondrija. Tirozin hidroksilaza i proteini koji kontroliraju mitohondrije bili su regulirani kvercetinom [43]. Kao što je prethodno opisano, PD je uzrokovan kvarom mitohondrija i lošom mitofagijom. U stanicama PC12 tretiranim 6-OHDA, primjena kvercetina poboljšala je kontrolu kvalitete mitohondrija, smanjila oksidativni stres i podigla razine markera mitofagije. Nadalje, u štakora s PD-om, kvercetin je ublažio 6-OHDA-induciranu progresiju motoričkih abnormalnosti sličnih PD-u, smanjio smrt neurona i smanjio disfunkciju mitohondrija [44]. Daljnja istraživanja pokazala su da se pretpostavlja da analiza kvercetina popravlja mitohondrijske ETC abnormalnosti i da ih regulira na gore. Ova aktivnost je temelj neuroprotekcije koja se pokazuje kod parkinsonizma uzrokovanog mitohondrijskim neurotoksinom [45]. Hiperozid, kvercetin 3-o-galaktozid, flavonolni je glikozid koji je smanjio mitohondrijsko apoptotsko signaliziranje u PC12 stanicama u in vitro eksperimentu [46].

Silibinin, flavonolignani ekstrahirani iz Silybum marianum, pokazao je modulatornu ulogu na potencijale mitohondrijske membrane (MMP) u in vivo eksperimentu na MPTP-induciranom PD modelu kod miševa [47]. Neuroprotektivni mehanizam silibinina uključuje smanjenje oštećenja mitohondrija i jačanje oksidativnog obrambenog sustava. Dopaminergička zaštita živaca postiže se poticanjem mitofagije, čime se uklanjaju štetne posljedice oštećenih mitohondrija. Ovi podaci upućuju na to da silibinin ima potencijal za daljnje istraživanje kao opcija liječenja PB [48]. U drugoj studiji, silibinin je značajno smanjio motoričko oštećenje i dopaminergičku degeneraciju neurona izazvanu MPTP-om. Nalazi sugeriraju da silibinin ima takve prednosti u MPTP-induciranim modelima PD-a koji se postižu povećanjem stabilnosti potencijala mitohondrijske membrane [49]. Drugi član obitelji lignana, schisandrin, smanjio je razine ROS-a, smanjio utjecaj Ca2 plus i obnovio kapacitet propusnosti mitohondrijske membrane [25].

Naringenin, flavanon, pokazao je regulatorni učinak na neurone i ublažio funkciju mitohondrija. Taj je učinak postignut povećanjem MMP-a i smanjenjem ROS-a utjecajem na put Nrf2/ARE u in vitro eksperimentu na neuronima mozga Sprague Dawley štakora [50]. Osim toga, naringenin je inhibirao bioenergetiku povezanu s mitohondrijima i redoks disfunkcije uzrokovane metilglioksalom u stanicama ljudskog neuroblastoma SH-SY5Y putem puteva Nrf2/GSH [51]. Naringin, glikolizirani naringenin, dokazano štiti od PD-a u životinjskim modelima. U striatumu i substantia nigra pars compacta (SNpc) štakora, naringin je smanjio dopaminergičku toksičnost izazvanu rotenonom. Subcelularno, naringin je smanjio rotenonom izazvano smanjenje mitohondrijske funkcije, stabilnosti i bioenergetike u SNpc životinja, putem Nrf2-posredovanog puta [52].

Izolikviritigenin je halkon flavonoid dobiven iz Glycyrrhizae uralensis. Predtretman izolikviritigeninom u potpunosti je inhibirao proizvodnju ROS-a kao i disipaciju MMP-a i prisutnost citokroma c u citoplazmi [53]. Induktori puta Nrf2/ARE, kao što je izolikviritigenin iz sladića, pokazali su potencijalno očuvanje mitohondrijske funkcije u modelima oksidativnog stresa i neurodegenerativnih bolesti, a također su pružili jedinstvenu strategiju za prevenciju i liječenje neurodegenerativnih poremećaja povezanih sa starenjem, posebno PD [23] .

Fenolne kiseline, podskup fenola, uključujući elaginsku kiselinu i ferulinsku kiselinu, utječu na mitohondrije i time ih štite od puteva povezanih s ROS [32]. Protocatechuic aldehid je još jedna fenolna kiselina dobivena iz korijena Salvia miltiorrhiza, koja ima zaštitni učinak na mitohondrije blokiranjem proizvodnje ROS i zadržavanjem aktivnosti kompleksa I u MPP plus -inkubiranim SH-SY5Y stanicama procijenjenim u in vitro eksperimentu [15] . U ovoj liniji, druga fenolna kiselina, kafeinska kiselina, dobivena iz čaja, vina, kave itd., blokirala je proizvodnju ROS i normalizirala aktivnost mitohondrija u 6-OHDA-induciranom SH-SY5Y staničnom modelu PD-a [54]. U MPTP životinjskom modelu PD-a, fenetil ester kafeinske kiseline smanjio je dopaminergičku neurodegeneraciju i gubitak dopamina. Nadalje, smanjio je neurotoksičnost izazvanu MPP plus in vitro i učinkovito spriječio mitohondrijski citokrom c i apoptozu izazvan MPP plus. Kao rezultat toga, kavena kiselina bi mogla biti od pomoći u odgađanju ili zaustavljanju progresije PB [55].

Glavni antioksidansi sadržani u djevičanskom maslinovom ulju su fenolni produkti, a količinski je klasa sekoiridoida najzastupljenija u maslinovom ulju [6]. Oleuropein i ligstrozid su dva glavna sekoiridoida koja se nalaze u maslinovom ulju i mogu se proizvoditi protiv hidroksitirozola i tirozola. Oleuropein je smanjio količinu superoksidnog aniona u mitohondrijima [56]. U otopljenim stanicama mozga miševa hidroksitirozol je spriječio depolarizaciju potencijala mitohondrijske membrane i smanjio funkcije mitohondrijskih kompleksa I, II i IV. Tyrosol je pokazao obrambenu funkciju protiv MPP plus u dopaminergičkim neuronima [6]. U skladu s tim, polifenoli zelenog i crnog čaja imaju nevjerojatno snažne antioksidativne učinke uklanjanja radikala na fragmente membrane mitohondrija u mozgu [18]. Polifenoli čaja mogli bi očuvati dopaminske neurone dramatičnim suzbijanjem oštećenja uzrokovanih DA, inhibicijom oksidacije DA, konjugacijom s DA kinonima, čišćenjem ROS-a i moduliranjem antioksidativnih signalnih putova Nrf2-Keap1 i PGC-1 [57 ]. U skladu s modulacijom Nrf2, pinocembrin, flavonoid u propolisu, osigurao je sigurnost mitohondrija i stanica supresijom ERK1/2 i atenuacijom Nrf2 [58].

Kurkumin, polifenol dobiven iz Curcuma longa, zaštitio je funkciju mitohondrija u PD-u blokiranjem aktivnosti MPP plus i proizvodnje ROS-a u in vivo i in vitro eksperimentima [36,42,59] i sprječavanjem oštećenja mitohondrijske membrane u PD-u [18,19]. ,34]. Usmjeravajući se na točan mehanizam, vanilin, fenolni aldehid, smanjio je proizvodnju ROS-a izazvanu rotenonom i kvar mitohondrija u stanicama SH-SY5Y [54]. Kao još jedan fenolni spoj, luteolin, dobiven iz zrelog sjemena Perilla frutescens, također je imao preventivnu ulogu u proizvodnji ROS-a i održavao je aktivnost mitohondrija na normalnoj razini [46,60]. Drugi fenolni spoj, epigalokatehin galat (EGCG), vrsta katehina dobivena iz zelenog čaja, inhibirao je kvar mitohondrija putem stimulacije puta AMP-aktivirane protein kinaze (AMPK) [61].

Hesperidin, flavonoidni glikozid koji se često opaža u agrumima, pokazao je zaštitni učinak na mitohondrije modulirajući mitohondrijski kompleks I, IV i V u in vivo eksperimentu na miševima [62]. Kemijske strukture flavonoida/fenolnih spojeva prikazane su na slici 2.

Stoga je nekoliko studija potvrdilo da bi flavonoidi i fenolni spojevi mogli biti korisni u prevenciji/liječenju PD-a ciljanjem na mitohondrije i srodne apoptotičke/oksidativne medijatore, uključujući MMP, ROS, Nrf2/ARE, NO, JNK, p38MAPK, Bcl{{2} }/Bax omjer, PI3K/Akt, nuklearni faktor Kappa-B (NF-κB), PGC-1 i aktivnost kompleksa I, II i IV.

4.2. Alkaloidi i mitohondriji u PD

Alkaloidi su primarne fitokemikalije s atomima dušika, obično kao dio cikličkog sustava ili u kombinaciji. Ova klasa fitokemikalija utječe na društveni život, ekonomski status i zdravstvene aspekte ljudskog života u raznim bolestima, posebno PB [63,64]. Nikotin je prirodni alkaloid koji se nalazi u korijenu i lišću Nicotiana tabacum. Također je pretežno prisutan u manjim količinama u raznim vrstama obitelji Solanaceae, kao što su krumpir, rajčica, patlidžan i paprika čili. Nikotin inhibira ETC od NADH do kompleksa I, blokira djelovanje NADH-ubikinon reduktaze, što rezultira mjerljivim smanjenjem unosa kisika u mitohondrijima. Potiskivanjem kompleksa I, nikotin je rezultirao manjim smanjenjem elektrona i, kao rezultat toga, manjim stvaranjem ROS [65]. U drugoj studiji, nikotin je ometao mitohondrijski apoptotski put i zaštitio neurone od apoptoze uzrokovane oksidativnim stresom [32]. Kao što navode Xie i sur., nikotin je povezan s manjim izgledima za dobivanje PB-a. Nikotin je potisnuo MPP plus i oticanje mitohondrija visoke amplitude izazvano kalcijem, kao i otpuštanje citokroma c iz netaknutih mitohondrija u SH-SY5Y stanicama. Njihovi rezultati pokazuju da je nikotin pokazao neuroprotektivni učinak neovisan o receptorima tijekom PD-a slabljenjem MPP plus, mitohondrija izazvanog kalcijem i citokroma c [66]. Drugo izvješće pokazalo je da nikotin posreduje u dinamici mitohondrija i utječe na povezanost mitohondrija iz mikrotubula, uvelike povećava grupiranje IP3 receptora i modulira komunikaciju mitohondrija i endoplazmatskog retikuluma, kao i povećava biogenezu mitohondrija u kultiviranim neuronima hipokampusa [67]. Nikotin je također pokazao mitohondrijske učinke u malim dozama in vivo i in vitro, održavajući funkciju mitohondrija u CNS-u štakora [68]. Prema tim nalazima, nikotinom inhibirana H2O2-inducirana apoptoza astrocita, mitohondrijskim putem stimuliranjem 7 nikotinskih acetilkolinskih receptora (7-nAChRs), a astrociti koji su povezani s imunološkim odgovorima povezani su s PD-om. Osim toga, uzimajući u obzir sposobnost 7-nAChRs izraženih u astrocitima, to bi mogao biti potencijalni terapijski pristup za neurodegenerativne bolesti [69].

Kofein (1,3,7-trimetil ksantin) je prirodni alkaloid koji se nalazi u biljkama kave, čaja i kakaovca [70]. Kofein može blokirati proizvodnju ROS-a i pojačati aktivnost mitohondrija. Također povećava stvaranje mitohondrija stimuliranjem Nrf2-keap1 i PGC-1 koji su uključeni u biogenezu mitohondrija, kao i zbog međusobno povezanih antioksidativnih i protuupalnih mehanizama. Osim toga, kofein ponovno uspostavlja transkripcijske gene uključene u razne aktivnosti kao što su stanična smrt, kontrola staničnog ciklusa, oksidativni stres i ekspresija gena povezanih s funkcijom mitohondrija [70].

Berberin je izokinolinski alkaloid koji se nalazi u raznim ljekovitim biljkama, posebno onima koje pripadaju rodu Berberis [71]. U životinjskim modelima PD-a berberin je pokazao neuroprotektivna svojstva. U tu svrhu, istraživači su istraživali subcelularnu lokalizaciju i propusnost krvno-moždane barijere (BBB) ​​berberina u staničnom modelu PD-a i modelu PD-a zebrice koristeći fluorescentno obilježeni derivat berberina [72,73]. U njihovoj studiji, derivat berberina pokazao je svoje anti-PD djelovanje lako prolazeći kroz BBB. Također se brzo i precizno akumulirao u mitohondrijima stanica PC12, prema analizi subcelularne lokalizacije. Nadalje, štitio je od 6-stanične smrti izazvane OHDA, ublažava ponašanje slično PD-u izazvano MPTP-om i povećava gubitak dopaminergičkih neurona u mozgu zebrica zahvaćenih PD-om [72].

Embelin je prirodni biljni proizvod otkriven u plodovima Lysimachia punctata (Primulaceae) i Embelia ribes Burm (Myrsinaceae) [74]. Nalazi pokazuju da očuvane N27 dopaminergičke stanice počinju od MPP plus-induciranog oksidativnog stresa i apoptoze. Stanice tretirane embelinom imale su više razine pAMPK, SIRT1 i PGC1, što ukazuje na poboljšanu biogenezu mitohondrija. Osim toga, embelin je in vivo pružio zaštitu od MPTP-induciranog smanjenja dopamina u strijatu i putu mitohondrijske biogeneze [75].

Izorinkofilin je značajan tetraciklički oksindol alkaloid identificiran iz kineskog biljnog lijeka Uncaria rhynchophylla, koji se generacijama koristi u istočnoj Aziji za ublažavanje neuroloških poremećaja [76]. Istraživanje je pokazalo da je izorinhofilin značajno smanjio MPP plus-induciranu apoptotičku staničnu smrt u PC12 stanicama i masivno smanjio MPP plus-induciran stresni odgovor endoplazmatskog retikuluma, a oba su uključena u dopaminergičku neuronalnu smrt u PD [77]. U drugoj studiji, jedinstveni alkaloid leonin, dobiven iz Herba Leonuri (tradicionalni kineski lijek) pokazao je zaštitni učinak na mitohondrije u PD-u i blokirao oksidativni stres [78].

Prethodno spomenute studije su implicirale moguću primjenu alkaloida u ciljanju mitohondrija prema prevenciji i liječenju PD-a. Sukladno tome, alkaloidi moduliraju nekoliko signalnih/medijatora, uključujući ROS, Nrf2-keap1, PGC-1, pAMPK, 7-nAChRs i SIRT1.

4.3. Terpeni i mitohondriji u PD

Terpeni su klasa biljnih sekundarnih metabolita koji imaju neuroprotektivne učinke reguliranjem putova povezanih s mitohondrijima. Terpeni/terpenoidi su izgrađeni od izoprenskih jedinica ili modificiranih struktura. Na temelju broja izoprenskih jedinica u strukturi njihove molekule, terpeni/terpenoidi se klasificiraju u monoterpene, seskviterpene, diterpene, triterpene i tetraterpene [79].

Karotenoida ima u izobilju u fotosintetskim pigmentima biljaka, a njihov molekularni sastav čine tetraterpeni (8-izopren polimer). Likopen, prirodni karotenoid, poboljšao je strukturnu sposobnost mitohondrijske membrane i omjere ATP-a dok je inhibirao Bax, a povezani pad razina Bcl-2 pružio je zaštitu od upale i oksidativnog stresa u neuronskim stanicama [32]. U drugoj studiji, liječenje likopenom smanjilo je depolarizaciju mitohondrija i oslobađanje citokroma c u neuronima, sugerirajući da je očuvan integritet mitohondrijske membrane [80]. Osim toga, likopen je smanjio mitohondrijsko stvaranje ROS-a izazvano MPP-om, kao i mitohondrijske morfološke promjene. U njihovoj studiji, likopen je potisnuo otvaranje pora mitohondrijske permeabilnosti (MPT) izazvano MPP plus. Preventivne prednosti likopena prema citotoksičnosti izazvanoj MPP plusom mogle bi biti posljedica njegove uključenosti u pojačavanje aktivnosti mitohondrija. Ovi nalazi upućuju na to da bi likopen mogao biti koristan terapijski pristup za PB [81].

Kaur i sur. također je izvijestio da likopen inhibira otpuštanje citokroma c iz mitohondrija. Nalazi podupiru terapijski potencijal dodataka likopena u PD-u izazvanom rotenonom, koji je pokazao korisne učinke u neurodegenerativnim bolestima modulacijom oksidativnog stresa [82]. Astaksantin, karotenoid keto-strukture u mikroalgi Haematococcus Pluvialis, spriječio je kvar mitohondrija i modulirao proizvodnju ROS-a u in vivo i in vitro eksperimentu [83]. Astaksantin ester aciliran dokozaheksaenskom kiselinom značajno je inhibirao progresiju PD-a u mišjem modelu izazvanom MPTP-om. Pokazao je potencijalnu ulogu u regulaciji smrti dopaminergičkih neurona u mozgu kroz put posredovan mitohondrijima, kao i putem JNK i p38MAPK [84].

U stanicama SH-SY5Y, pentaciklički triterpenoid nazvan azijska kiselina brani od staničnih oštećenja i kvara mitohondrija uzrokovanih H2O2 ili rotenonom. Rotenonom izazvano povećanje disperzije potencijala anionskog kanala ovisnog o naponu i mitohondrijske membrane blokirala je azijska kiselina. Dodatno, za stabilnost membrane mitohondrija, azijska kiselina je smanjila proizvodnju Bax i povećala razinu Bcl-xL [85]. U staničnom modelu izazvanom rotenonom, azijska kiselina je spasila mitohondrije od oksidativnog oštećenja i apoptoze. Azijska kiselina je također povećala MMP u modelu izoliranih mitohondrija, čuvajući integritet membrane i stvaranje ATP-a. Nalazi pokazuju da su mitohondriji neophodni u PD-u, a azijska kiselina je obećavajuća opcija za prevenciju i liječenje PD-a [86].

Andrografolid, diterpenoidni lakton, pokazao je zaštitni učinak na mitohondrije blokirajući proizvodnju ROS-a i modulirajući kvar mitohondrija balansirajući razinu ATP-a u in vivo i in vitro modelima. Andrografolid je također pojačao brisanje depolariziranih mitohondrija putem puta koji ovisi o parkinu [87]. Kod miševa izloženih MPTP-u, liječenje andrografolidom ublažilo je poremećaje u ponašanju i smanjilo gubitak dopaminergičkih neurona, kao i rotenonom izazvanu staničnu smrt in vitro. Tijekom PD-a, andrografolid je spriječio pretjeranu fisiju mitohondrija i oštećenje neurona [88].

Karnozna kiselina, diterpen u ružmarinu, stimulirala je fuzijski protein mitohondrija, mitofusin 1 i 2 (MFN1 i MFN2) i optičku atrofiju 1 (OPA1). Također je blokirao fisijski protein dynamin-related protein 1 (DRP1). Dodatno, parkin je aktivirao put IKK/NF-κB i povećao proizvodnju proteina OPA1 pomoću karnozne kiseline [89]. U tom smislu, karnozna kiselina smanjila je negativan utjecaj parakvatnog modela PD-a na aktivnost mitohondrija, dok je smanjila stvaranje ROS/reaktivnih dušikovih vrsta (RNS). Posljedično, karnozna kiselina stimulirala je Nrf2 u SH-SY5Y stanicama modulirajući put PI3K/Akt, što je rezultiralo višim antioksidativnim enzimima [90]. MMP je bio poremećen, protein anionskog kanala 1 (VDAC1) ovisan o naponu bio je blokiran, a citosolni citokrom c povećan je u stanicama SH-SY5Y nakon tretmana 6-OHDA; međutim, karnozinska kiselina spriječila je takve učinke. Stimulirajući mitofagiju posredovanu PINK1/parkinom, čini se da karnozna kiselina ublažava neurotoksičnost 6-OHDA [91]. Kao rezultat toga, karnozna kiselina se može smatrati neuroprotektivnim lijekom za liječenje PD-a putem putova povezanih s mitohondrijima.

Bosvelijske kiseline, skupina pentacikličkih triterpena, iz roda Boswellia, pokazalo se da smanjuju mitohondrijske kvarove izazvane rotenonom inhibicijom interleukina (IL)-6/prijenosnika signala i aktivatora transkripcije-3 (STAT3 )/NF-κB signalni putovi [92]. Tormentova kiselina je triterpen koji se nalazi u ljekovitim biljkama, uključujući Rosa rugosa i Potentilla Chinensis, koje su značajno potisnule unutarstaničnu agregaciju ROS-a i omjer Bax/Bcl-2 induciran MPP plusom u stanicama SH-SY5Y. Taj je učinak primarno ostvaren putem stimulacije signalnog puta PI3K/Akt/GSK-3. Njihovi rezultati pokazuju da bi kiselinska kiselina mogla biti mogući kandidat za dodatna pretklinička istraživanja u vezi s prevencijom i liječenjem PB [93].

Catalpol, iridoidni glukozid ekstrahiran iz korijena Rehmannia glutinosa Libosch, smanjio je kvar mitohondrija smanjenjem proizvodnje ATP-a i povećanjem razine MPP plus. Također je smanjio unos kalcija u neuronske stanice, nakupljanje ROS-a i MPT pore [94,95].

Među ostalim terpenoidima, ginsenosides-Rg1, triterpenoid s vodećom ulogom u djelotvornosti ginsenga, može imati preventivni učinak na oksidativni stres protiv kvara mitohondrija u pokusu in vivo [96,97]. Ginseng, korijen vrste Panax (Araliaceae), tradicionalni je kineski biljni lijek te uobičajen i vrlo korišten prirodni lijek u suvremeno doba. Ginsenozidi su glavne farmakološki aktivne komponente ginsenga i povezani su s većinom djelovanja ginsenga [98]. Pokazalo se da ginsenozidi-Rg1 (G-Rg1) imaju terapijske prednosti s nižom in vitro i in vivo toksičnošću. Također pomaže kod raznih neuroloških poremećaja, osobito progresivnih neurodegenerativnih bolesti kao što je PB [99]. Takvi učinci ginsenozida-Rg1 uključuju pojačavanje protuupalne, antioksidacijske i antiapoptotičke uloge. Također je pokazao potencijal za suzbijanje ekscitotoksičnosti i prekomjernog priljeva Ca2 plus u neurone, održavanje stanične koncentracije ATP-a i zaštitu strukturnog integriteta neurona. Višak vodikovog peroksida i drugih ROS-a proizvedenih visoko reaktivnim koncentracijama željeza može rezultirati kvarom mitohondrija i pojačanim metabolizmom dopamina. Ginsenosides-Rg1 (G-Rg1) smanjili su broj stanica obojenih željezom u SN miševa tretiranih MPTP-om [96]. Također je otkriveno da je ginsenosid Rb1 (na 10 M) znatno poboljšao preživljavanje stanica u usporedbi s kontrolama obnavljanjem MMP i smanjenjem Ca2 plus prekomjernog dotoka u mitohondrije, što je rezultiralo povećanjem energije koju proizvode mitohondriji u primarno uzgojenim dopaminergičkim neuronima miša. Osim toga, utvrđeno je da ginsenoside Re popravlja i nadoknađuje određene nedostatke mitohondrijskog kompleksa IV u PINK1-nultim dopaminergičkim staničnim linijama povećanjem razine ekspresije šaperona LRPPRC, Hsp90 i Hsp60 kroz obnovu optimalnog NO signaliziranja. Notoginsenoside R2 (NGR2), notoginsenoside izoliran iz P. notoginseng, smanjio je smrt mitohondrija u SH-SY5Y stanicama putem MEK1/2–ERK1/2 puteva i suzbijajući 6-OHDA-inducirani oksidativni stres. Vodeni ekstrakt korijena P. ginsenga također je inhibirao staničnu smrt u stanicama SH-SY5Y tretiranim MPP plus-om smanjujući pretjeranu sintezu ROS-a i inhibirajući apoptotski put ovisan o mitohondrijima, na što ukazuje smanjeni omjer Bax/Bcl-2, citokrom c oslobađanje i aktivnost kaspaze-3 [100]. Kemijske strukture alkaloida/terpenoida prikazane su na slici 3.

Sveukupno, terpen/terpenoidi pokazali su povoljne anti-PD učinke ciljajući mitohondrije, čime su suzbijali aktivnost kompleksa I–III, PINK1/parkin, ROS, Bax, JNK/p38MAPK, IKK/NF-κB, VDAC1, PI3K/Akt/GSK{{ 6}} i IL-6/STAT3/NF-κB. Tablica 1 prikazuje modulatorne učinke biljnih sekundarnih metabolita na mitohondrije i međusobno povezane medijatore prema prevenciji/liječenju PD-a.

5. Zaključci

Mitohondriji su obećavajuće mete u borbi protiv nekoliko neurodegenerativnih bolesti, posebice PB-a. Budući da kompleksi/enzimi mitohondrija i međusobno povezani oksidativni/apoptotski medijatori igraju ključnu ulogu u PD-u, pružanje višeciljnih terapija protiv ove bolesti moglo bi otvoriti nove putove prema pronalaženju obećavajućih tretmana. Sekundarni biljni metaboliti su višeciljani agensi u borbi protiv neurodegeneracije, koji imaju protuupalne, antiapoptotičke i antioksidativne učinke. Potencijal fitokemikalija u istovremenom ciljanju mitohondrija i međusobno povezanih medijatora mogao bi utrti put u liječenju PD-a. U ovoj liniji, aktivnost kompleksa IV, MIMP. ROZA1/parkin, ROS. NEMA omjera Bc-2/Bax, PGC-1, pAMPK, -nAChRs i SIRT1, Nrf2/ARE, INK/p38MAPK, IKK/NF-KB, PI3K/Akt/GSK-3 , VDACl i STAT3/NF-kB moduliraju se fitokemikalijama koje prolaze kroz mitohondrije prema liječenju/prevenciji PD-a (Slika 4).

Unatoč njihovoj učinkovitosti, fitokemikalije pate od slabe bioraspoloživosti, nestabilnosti/topivosti/selektivnosti, brzog metabolizma i uklanjanja koji ograničavaju njihovu koncentraciju u plazmi i terapijsku primjenu u PD-u. Dakle, istraživanje odgovarajućih sustava dostave (npr. nanočestica, micela, liposoma i čvrstih lipidnih nanočestica) za fitokemikalije moglo bi se suprotstaviti ograničenjima u njihovoj primjeni u borbi protiv PD povećanjem staničnog unosa, bioraspoloživosti, učinkovitosti i specifičnosti neuroprotektivnih biljnih izvedeni sekundarni metaboliti [79].

Slika 4. Fitokemikalije koriste nekoliko mehanizama u liječenju PD-a koji prolazi kroz mitohondrije. Unatoč njihovoj učinkovitosti, fitokemikalije pate od slabe bioraspoloživosti, nestabilnosti/topivosti/selektivnosti, brzog metabolizma i uklanjanja koji ograničavaju njihovu koncentraciju u plazmi i terapijsku primjenu u PD-u. Dakle, istraživanje odgovarajućih sustava dostave (npr. nanočestica, micela, liposoma i čvrstih lipidnih nanočestica) za fitokemikalije moglo bi se suprotstaviti ograničenjima u njihovoj primjeni u borbi protiv PD-a povećanjem staničnog unosa, bioraspoloživosti, učinkovitosti i specifičnosti neuroprotektivnih biljnih podrijetla sekundarni metaboliti [79]. Ova studija naglašava potencijal fenolnih spojeva, alkaloida, terpenoida i raznih fitokemikalija u borbi protiv PD koja prolazi kroz puteve povezane s mitohondrijima. Buduća izvješća trebala bi uključivati ​​dodatne pretkliničke studije kako bi se otkrilo kritično ciljanje mitohondrija u PD-u nakon čega bi uslijedila dobro kontrolirana klinička ispitivanja za procjenu fitokemikalija kao učinkovitih tretmana. Osim toga, od velike bi važnosti bilo otkrivanje izravne uloge mitohondrija i povezanih korisnih učinaka biljnih sekundarnih metabolita na pretkliničke i kliničke znakove PD-a. Takva će izvješća dodatno istaknuti potencijal fitokemikalija u prevenciji, upravljanju i liječenju PD-a.