Studija o zaštitnoj funkciji Cistanche na bubrege: razlike ovisne o androgenu u količinama CYP MRNA u svinjskom bubregu
Mar 13, 2022
Androgen-ovisne razlike u količinama CYP mRNA u svinjskom bubregu
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Prethodno smo izvijestili o androgeno-ovisnim razlikama u spolu i pasmini u količinama mRNA izoformi CYP u svinjskoj jetri. Da pojasnimo postoje li takve spolne i pasminske razlike ububreg, ispitali smo količine nekoliko CYP mRNA u bubrezima koristeći oba spola 5-mjesečnih svinja Landrace, Meishan i/ili njihovih križanaca F1 (LM i ML). Pronađene su značajne spolne razlike u količinama nekoliko CYP mRNA: muški < ženski="" za="" cyp2a19="" i="" cyp3a29;="" i="" mužjak=""> ženka za CYP4A24/25 u svim pasminama. Spolne razlike u količini CYP2B22 mRNA (muški <ženski) i="" u="" cyp2c33="" i="" cyp2c49="" mrna="" (muški=""> ženski) također su primijećene kod svih pasmina osim Landrace svinja. Nadalje, značajna razlika u spolu (muški <ženski) u="" cyp3a46="" mrna="" pronađena="" je="" samo="" u="" lm="" i="" ml="" svinja.="" nisu="" pronađene="" značajne="" spolne="" razlike="" ni="" u="" landrace="" ni="" u="" meishan="" svinjama="" za="" cyp1a1,="" cyp1a2="" i="" cyp4b1="" mrna.="" količine="" cyp2c33="" i="" cyp4a24/25="" mrna="" u="" mužjaka="" bile="" su="" veće="" u="" meishan="" svinja="" nego="" u="" landrace="" svinja.="" dodatni="" pokusi="" na="" svinjama="" liječenim="" kastracijom="">testosteronapropionat je pokazao da spolne i pasminske razlike u količinama tih CYP mRNA barem djelomično ovise o razinama serumatestosterona. Nadalje, učinci androgena na količine CYP mRNA u bubrezima nisu nužno bili u korelaciji s onima u jetri, što sugerira da postoji tkivno selektivni čimbenik odgovoran za ekspresiju CYP gena povezanu s androgenom. Zaštita odCistanchenabubregaje sveobuhvatan, što se pripisuje elementima kao što su ehinakozid, verbaskozid, flavonoidi i glikozidi ukupnog fenetilnog alkohola sadržani uCistanche. Cistanchemože ne samo zaštititibubregaod veće štete ali i popraviti postojeću štetu nabubrega. Stoga,Cistancheje najčešće korištena biljka u receptima tradicionalne kineske medicine.Cistancheima izuzetno visoku ljekovitu vrijednost.
Ključne riječi:testosterona; CYP;bubreg; spolna razlika; razlika u pasmini; svinja;bubregstanica;Cistanche
Misaki Kojima i Masakuni Degawab
Jedinica za životinjski genom, Institut za znanost o stočarstvu i travnjacima, Nacionalna organizacija za istraživanje poljoprivrede i hrane (NARO); 2 Ikenodai, Tsukuba, Ibaraki 305–0901, Japan: i bLaboratorij za molekularnu toksikologiju, Fakultet farmaceutskih znanosti, Sveučilište Shizuoka; 52–1 Yada, Suruga-Ku, Shizuoka 422–8526, Japan. Primljeno 16. travnja 2021.; prihvaćeno 19. svibnja 2021
UVOD
Enzimi koji metaboliziraju lijek (DME), kao što su CYP, sulfotransferaze (SULT) i uridin 5'-difosfat (UDP)-glukuronoziltransferaze (UGT), igraju važnu ulogu u metabolizmu ksenobiotika, uključujući lijekove i endogene spojeve kao što su steroidni hormoni i lipidi.1,2) Domaće svinje (Sus scrofa domesticus), uključujući male svinje, važne su u farmakološkim i toksikološkim studijama zbog sličnosti funkcije DME-a kod ljudi i svinja, posebice CYP-a.3-7) Prethodno smo prijavili spol i pasminske razlike u količinama jetrenih DME mRNA, uključujući CYP izoforme, između Landrace i Meishan svinja, a dodatno smo pokazali da je razina androgena u serumu jedan od kritičnih čimbenika koji stvaraju te razlike.8)
Cistanchetubulozasprječavabolest bubrega,kliknite ovdje da biste dobili uzorak
Thebubregkao i jetra je važno tkivo odgovorno za metabolizam i izlučivanje ksenobiotika uključujući lijekove i endogene spojeve i jedna je od najčešćih meta za toksičnost izazvanu lijekovima.9,10) Zabilježeno je da CYP izoforme pripadaju Porodice CYP1, CYP2, CYP3 i CYP4 postoje u svinjabubreg.11–15) Većina tih izoformi CYP igra važnu ulogu u metabolizmu ksenobiotika i/ili lipida u pokusnih životinja i ljudi.9,10,16,17) Nadalje, ekspresija izoformi Cyp4a i Cyp4b u mišabubregreguliran je androgenom.18–21)
U ovoj studiji prvo smo ispitali razlike u spolu i pasmini u količinama CYP mRNA (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A46, CYP4A24/25 i CYP4B1) ububregMeishana, Landracea i njihovih križanih F1 svinja. Nadalje, ispitali smo je li androgen kritični čimbenik koji određuje razlike u spolu i pasmini u količinama tih CYP mRNA u svinjabubreg, pokusima s kastracijom i/ili primjenomtestosteronapropionat (TP).
MATERIJALI I METODE
Životinje
Korištene su svinje Landrace, Meishan i njihovi križanci F1 (LM, ženka Landrace × mužjak Meishan; ML, ženka Meishan × mužjak Landrace), iste kao one korištene u našim prethodnim studijama.22) Ukratko, svinje su držane u Nacionalnom institutu znanosti o stočarstvu i pašnjacima, Tsukuba, Japan. Sve su svinje hranjene komercijalnom hranom od žitarica i dobivale su vodu ad libitum. Svinje su usmrćene električnim omamljivanjem nakon čega je uslijedilo iskrvavanje između 10:00 i 11:00 ujutro. Neki mužjaci prasadi Landrace i Meishan bili su kastrirani u dobi od 1 mjeseca i eutanazirani u dobi od 5 mjeseci. Dio bubrega ili jetre svake svinje brzo je uklonjen, zamrznut u tekućem dušiku i držan na -80 stupnjeva do sljedećih analiza.
Ovu studiju odobrio je Odbor za brigu o životinjama Nacionalnog instituta za znanost o stočarstvu i travnjacima (br. 1711B060, 1811B032, 1911B068, 20B005NILGS). Sa svim životinjama se postupalo humano prema smjernicama Povjerenstva.
Liječenje androgenom
Kao što je opisano u prethodnim izvješćima,23,24)testosteronapropionat (TP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, SAD) otopljen u kukuruznom ulju ubrizgan je intramuskularno pet puta u intervalima od 48- h u stražnju nogu svake svinje, u dozi od 10 mg/kg tjelesna težina; svinje su eutanazirane 24 sata nakon posljednje injekcije.
Količina serumaTestosteron
Količina serumatestosteronakod pojedinačnih muških svinja izmjereno je korištenjemTestosteronKomplet za imunoenzimski test (ELISA) (Enzo Life Sciences Inc., NY, SAD) prema uputama proizvođača, kao što je prethodno opisano.24) Dodatno, korišteni su i podaci dobiveni u našim prethodnim studijama.24,25)
Količine CYP mRNA
Ukupna RNA pripremljena je iz pojedinačnih tkiva korištenjem TRIzol reagensa (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, SAD) i korištena za određivanje količina CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A46, CYP4A24/25 i CYP4B1 mRNA. Količine ovih mRNA procijenjene su korištenjem RT-PCR-a u stvarnom vremenu korištenjem 7500 Real-Time PCR sustava i SYBR zelene glavne mješavine (PE Applied Systems, Tokyo, Japan), kao što je prethodno opisano,25), osim za CYP3A mRNA. Količine mRNA CYP3A22, CYP3A29 i CYP3A46 ispitivane su korištenjem Eagle Taq Master Mixa s ROX-om (Roche Molecular Systems, Inc., Branch burg, NJ, SAD) kao što je prethodno objavljeno.22) Setovi početnica i TaqMan sonde korištene u ovom trenutku studije bile su iste kao one u našim prethodnim studijama22,25) osim za CYP1A1, CYP1A2, CYP4A24/25 i CYP4B1, gdje su nizovi primera bili sljedeći: CYP1A1, 5′-ACT TCA TCC CTA TCC TCC GTT ACC{{53} }′ (naprijed) i 5′-GCA TTC TCG TCC ATC CTC TTG TC-3′ (nazad); CYP1A2, 5′-GCT ATC GGG ACT TTG ACA AGA ACT-3′ (naprijed) i 5′-CCA GGA GAT GGC TGT GGT AAT TG-3′ (nazad); CYP4A24/25, 5′-CAC CGT GCC GCC AGG ATA-3′ (naprijed) i 5′-CAA GGA GGA GGA TGT CCA GGA A-3′ (nazad); CYP4B1; 5′-GAG CAC CAG CAT CGT TGT CG-3′ (naprijed) i 5′-TCC CCA GAT CCT CCC CCT G-3′ (nazad). Ribosomski protein L7 (RPL7) korišten je kao interni standard. Količina svake cDNA procijenjena je metodom relativne standardne krivulje prema PE Applied Biosystems User Bulletin #2 (1997). Standardne krivulje za određivanje količina CYP mRNA generirane su korištenjem RT-reakcijske smjese s ukupnom RNA iz jetre 5-mjesečnih ženki svinja Landrace ili iz bubrega 5-mjesečnih ženke svinja Landrace ili Meishan, ovisno o namjeni
Statističke analize
Statistički značajne razlike procijenjene su Tukeyjevim post hoc testom nakon ANOVA ili Studentovim t-testom. Korelacije između navedenih parametara utvrđene su regresijskom analizom.
REZULTATI
Količine CYP mRNA u bubrezima svinja Landrace i Meishan
Količine CYP mRNA prvo su izmjerene u bubrezima oba spola 5-mjesečnih svinja Landrace i Meishan. Za usporedbu količine svake CYP mRNA između bubrega i jetre, količina svake CYP mRNA u bubregu izražena je kao relativni omjer prema odgovarajućoj količini u jetri 5-mjesečnih ženki svinja Landrace, a rezultati su prikazani u tablici 1.
Kod svih ispitanih svinja količine CYP4A24/25 i CYP4B1 mRNA u bubrezima bile su znatno veće od onih u jetri, dok su ostale CYP bile suprotne (Tablica 1). Osim toga, iako su mRNA CYP2E1 i CYP3A22 otkrivene u bubrezima, te su količine bile ispod jedne tisućinke onih u jetri svake pasmine (podaci nisu prikazani).
U obje pasmine svinja, količine mRNA CYP2A19 i CYP3A29 bile su niže u mužjaka nego u ženki (Tablica 1, Slika 1). Suprotno tome, količina CYP4A24/25 mRNA u obje pasmine svinja bila je značajno viša u mužjaka nego u ženki. Nadalje, u Meishan svinja, količine CYP2C33 i CYP2C49 mRNA bile su značajno veće u mužjaka nego u ženki. Takve spolne razlike u količinama mRNA CYP2C33 i CYP2C49 nisu primijećene u svinja pasmine Landrace. Nisu primijećene značajne spolne razlike u količinama CYP1A1, CYP1A2, CYP2B22 i CYP4B1 mRNA ni u jednoj pasmini svinja, iako je spolna razlika u količini CYP2B22 mRNA u Meishan svinja bila značajna prema Studentovom t-testu. Nadalje, CYP3A46 mRNA detektirana je u oba spola svinja Landrace, dok je u oba spola svinja Meishan bila ispod granice detekcije.
Breed differences in the amounts of several CYP mRNAs were also found. The amounts of CYP2B22 and CYP4B1 mRNAs in Landrace pigs were signifificantly higher than those in sex-matched Meishan pigs, while those of CYP2C49 and CYP3A29 mRNAs were the opposite. A significant breed difference (Meishan > Landrace) in the amounts of CYP2C33 and CYP4A24/25 mRNA was also observed in males, but no such difference was found in females. Furthermore, the breed differences (Landrace >Meishan) u količinama mRNA CYP1A1, CYP1A2 i CYP2A19 između svinja Landrace i Meishan podudaranja po spolu.
Učinak androgena na ekspresiju gena reprezentativnih CYP-ova povezanih sa spolom Kako bi se razjasnila ovisnost ekspresije gena CYP-ova (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49 i CYP3A29) o androgenima u bubrezima, učinci kastracije i/ili TP liječenja su ispitana pomoću 5-mjesečnih svinja Meishan i Landrace (slika 1). U kastriranih mužjaka obje pasmine, količina CYP2A19 mRNA bila je veća od one u odgovarajućih intaktnih mužjaka. Nadalje, TP tretman kastriranih mužjaka i intaktnih ženki obje pasmine svinja rezultirao je smanjenjem količine mRNA. Količine mRNA CYP2B22 i CYP3A29 povećale su se u kastriranih Meishan svinja, ali ne i u kastriranih Landrace svinja, u usporedbi s odgovarajućim intaktnim mužjacima. Tretman TP-om kastriranih mužjaka i intaktnih ženki obje pasmine svinja rezultirao je smanjenjem količine tih mRNA, iako nisu primijećeni značajni učinci TP na CYP2B22 mRNA u kastriranih Meishan i CYP3A29 mRNA u kastriranih Landrace svinja zbog velikih inter- individualna razlika.
Tablica 1. Relativne količine mRNA bubrežnih izoformi CYP u 5-mjesečnih svinja Landrace i Meishan
Slika 1. Učinci kastracije i/ili primjene TP na količine CYP mRNA u bubregu 5-mjesečne svinje
TP je injiciran intramuskularno u {{0}}mjesečne kastrirane mužjake i intaktne ženke Landrace i Meishan svinja, kao što je opisano u Materijalima i metodama. Količina svake CYP mRNA u bubregu određena je RT-PCR-om u stvarnom vremenu i normalizirana na RPL7 kao interni standard. Standardne krivulje generirane su korištenjem RT-reakcijske smjese s ukupnom RNA iz bubrega 5-mjesečnih ženki svinja Landrace, osim za određivanje količine CYP2C49 mRNA, gdje su standardne krivulje generirane korištenjem RT-reakcijske smjese s ukupnom RNK iz bubrega 5-mjesečnih ženki svinje Meishan. Svaki stupac predstavlja srednju vrijednost svake pokusne skupine, a svaka traka predstavlja standardnu devijaciju (SD) srednje vrijednosti (n= 6 za netaknute muške i ženske svinje Landrace i Meishan; n= 3 za ostale). a,b Značajne razlike u odnosu na odgovarajuće netaknute muške svinje procijenjene su Tukeyjevim post hoc testom: ap < 0.{{20}}5,="" bp="">< 0,01.="" c,d="" značajne="" razlike="" u="" odnosu="" na="" odgovarajuće="" tp="" netretirane="" svinje,="" prema="" procjeni="" studentovim="" t-testom:="" cp="">< 0,05,="" dp="">< 0,01.="" kvadratići="" u="" cyp2b22="" i="" cyp3a29="" označavaju="" meishan="" i="" landrace="" svinje,="" redom,="" s="">
Količina CYP2C33 mRNA smanjila se u kastriranih Meishan svinja, ali ne i u kastriranih Landrace svinja, u usporedbi s odgovarajućim intaktnim mužjacima, a TP tretman kastriranih mužjaka i intaktnih ženki obje pasmine svinja rezultirao je povećanjem količine mRNA. U Meishan svinja, količina CYP2C49 mRNA također je smanjena kastracijom, a TP tretman kastriranih mužjaka i intaktnih ženki doveo je do povećanja njezine količine. Takvi učinci kastracije ili tretmana TP-om nisu uočeni kod svinja pasmine Landrace.
Slika 2. Učinci kastracije i/ili primjene TP na količine CYP4A24/25 i CYP4B1 mRNA u bubrezima i jetri 5-mjesečnih svinja
TP je injiciran intramuskularno u {{{{10}}}}mjesečne kastrirane mužjake i netaknute ženke svinja Landrace i Meishan, kao što je opisano u Materijalima i metodama. Količina svake CYP mRNA u bubregu i jetri određena je RT-PCR-om u stvarnom vremenu i normalizirana na RPL7 kao interni standard. Standardne krivulje generirane su korištenjem RT-reakcijske smjese s ukupnom RNA iz bubrega 5-mjesečnih ženki svinja Landrace. Svaki stupac predstavlja srednju vrijednost u svakoj eksperimentalnoj skupini, a svaka traka predstavlja SD srednje vrijednosti (n= 6 za netaknute muške i ženske svinje Landrace i Meishan; n= 3 za ostale). Značajne razlike u odnosu na odgovarajuće intaktne muške svinje procijenjene su Tukeyjevim post hoc testom: ap < 0.01.="" b,c="" značajne="" razlike="" u="" odnosu="" na="" odgovarajuće="" tp="" netretirane="" svinje,="" prema="" procjeni="" studentovim="" t-testom:="" bp="">< 0,05,="" cp=""><>
To date, there are no reports concerning the constitutive amounts of CYP4A24/25 and CYP4B1 mRNAs and sex differences in their amounts in the pig liver, although a clear sex difference (male >ženka) u količini CYP4A24/25 mRNA uočena je ovdje u svinjskom bubregu (Tablica 1). Stoga, kako bismo razjasnili učinke androgena na ekspresiju tih mRNA u bubrezima i jetri i Landrace i Meishan svinja, ispitali smo ne samo učinke kastracije, već i učinke TP tretmana kastriranih mužjaka i netaknutih ženki ( Slika 2). Količina CYP4A24/25 mRNA u bubrezima smanjena je kastracijom i kod Landrace i Meishan svinja, a TP tretman kastriranih mužjaka i intaktnih ženki obje pasmine svinja rezultirao je povećanjem njezine količine. Međutim, u jetri obiju pasmina svinja nisu primijećeni takvi učinci kastracije, a također nije primijećena spolna razlika u količini CYP4A24/25 mRNA. Isto tako, u obje pasmine svinja nije primijećen značajan učinak liječenja TP-om na količinu jetrene CYP4A24/25 mRNA, iako je povećanje njegove količine liječenjem TP-om primijećeno samo kod kastriranih mužjaka svinja Landrace. Nadalje, CYP4B1 mRNA nije pokazala razliku u spolu ni u bubrezima (Slika 2 i Tablica 1) ni u jetri za svaku pasminu svinja. U obje pasmine svinja, količina CYP4B1 mRNA nije značajno promijenjena kastracijom i/ili TP tretmanom (slika 2).
Prethodno smo otkrili da je liječenje TP-om rezultiralo povećanjem količine mRNA CYP3A46 u jetri svinja rase Landrace.22) Stoga su učinci liječenja TP-om i kastracije na količinu mRNA u bubregu dodatno ispitani pomoću {{3} }mjesečne svinje Landrace (slika 1). Iako kastracija mužjaka nije imala značajan učinak na količinu CYP3A46 mRNA u bubrezima, TP tretman kastriranih mužjaka i netaknutih ženki rezultirao je smanjenjem količine CYP3A46 mRNA. Nadalje, CYP3A46 mRNA bila je ispod granice detekcije i u bubrezima i u jetri svih Meishan svinja liječenih kastracijom i/ili TP.22)
Genetski čimbenici odgovorni za ekspresiju CYP mRNA vezanu uz spol
We have previously reported that sex-related expression of CYP mRNAs in the pig liver is, at least in part, dependent on the amount of serum testosterone,8) and that the amount is determined by autosomal dominant inheritance.25) Therefore, using F1 progeny (LM and ML) of Landrace and Meishan pigs, the amounts of sex-related CYP mRNAs in the kidney were measured (Fig. 3). Incidentally, the amounts of serum testosterone in 5-month-old male LM and ML pigs, as well as Meishan pigs, were >40 ng/mL, a one kod 5-mjesečnih muških prasadi Landrace bile su<23 ng>
In both LM and ML pigs, the mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, and CYP3A29 in males were much lower than those in females, while the converse was observed for CYP2C33 and CYP4A24/25. For CYP2C49 mRNA, a significant sex difference (males >ženke) primijećena je u ML svinja, ali nije primijećena značajna razlika u LM svinja zbog značajnih međuindividualnih razlika među mužjacima LM svinja. CYP3A46 mRNA otkrivena je u svinja LM i ML, kao i svinja rase Landrace, a razlika u spolu (mužjaci< females)="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was observed in lm and ml pigs ="">
Slika 3. Spolne razlike u količini CYP mRNA u bubrezima 5-mjesečnih LM i ML svinja
Količina mRNA svakog CYP u bubregu određena je RT-PCR-om u stvarnom vremenu i normalizirana na RPL7 kao interni standard. Standardne krivulje generirane su pomoću RT-reakcijske mješavine s ukupnom RNA iz bubrega 5-mjesečnih ženki svinja rase Landrace, osim za određivanje količine CYP2C49 mRNA, gdje su standardne krivulje generirane pomoću RT-reakcije mješavina s ukupnom RNA iz bubrega 5-mjesečnih ženki svinje Meishan. Svaki krug prikazuje pojedinačnu svinju (n= 6 i 9 za muške i ženske LM svinje, redom; n= 7 i 10 za muške i ženske ML svinje, redom). Traka označava prosjek u svakoj skupini. a,b Značajne razlike između mužjaka i ženki u svakoj pasmini procijenjene su Studentovim t-testom: ap < 0.05,="" bp=""><>
Odnos između količine serumskog testosterona i ekspresije spolno povezanih CYP mRNA u bubrezima
Smatra se da je koncentracija androgena u serumu jedan od kritičnih čimbenika koji stvaraju razlike u spolu i pasmini u količinama nekoliko CYP mRNA u svinjskom bubregu. Stoga je odnos između koncentracije androgena u serumu i spolno povezane ekspresije CYP mRNA (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A29, CYP3A46 i CYP4A24/25) u bubregu dodatno ispitan korištenjem 1-, { {17}} i 5-mjesečne svinje. Neke od 1-mjesečnih svinja (nezrele,< 10 ng testosterone/ml ="" serum) ="" were ="" treated ="" with ="" tp="" and="" used="" as="" samples="" for="" the="" present="" experiments.="" the="" concentrations="" of="" serum="" testosterone="" in="" the="" tp-treated="" pigs="" were ="" 28–59 ng/ml. ="" in ="" addition, ="" serum ="" testosterone ="" amount ="" increased="" in="" an="" age-dependent="" manner="" in="" males25) ="" but ="" not ="" in ="" females="" of="" all="" the="" pigs=""><7 ng testosterone/ml ="" serum) ="" used. ="" therefore,="" as="" representative="" samples="" of="" females,="" 1-month-old="" and ="" 5-month-old ="" pigs ="" but ="" not ="" 3-month-old ="" pigs ="" were ="" used ="" for ="" the="" present="">
The mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29, and CYP3A46 in all the pigs with high concentrations (>cca. 30 ng/mL) serumskog testosterona bili su niski u usporedbi s onima kod svih svinja s niskim koncentracijama serumskog testosterona (<30 ng l). ="" in ="" particular, ="" the ="" amount ="" of ="" cyp3a29="" mrna="" decreased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent ="" manner ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig ="" examined ="" (fig. ="" 4). ="" furthermore,="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent="" decrease="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was also observed ="" in="" all="" the="" pigs="" except="" meishan="">
Međutim, količine mRNA CYP2C33 i CYP4A24/25 porasle su na način ovisan o koncentraciji testosterona u serumu kod svih ispitivanih pasmina svinja (Slika 5). Količina mRNA CYP2C49 porasla je ovisno o koncentraciji testosterona u serumu u Meishan, LM i ML svinja, ali ne i u Landrace svinja. Uz to, primijećeno je malo povećanje količine CYP2C49 mRNA u 1-mjesečnih svinja pasmine Landrace i Meishan tretiranih TP-om. To sugerira da ekspresija takvog učinka povezanog s TP-om ovisi o razini ekspresije transkripcijskih čimbenika koji reagiraju na TP za ekspresiju gena CYP2C49, koji je uključen u sazrijevanje.
RASPRAVA
U ovoj smo studiji inicijalno pronašli razlike u spolu i pasmini u količinama nekoliko CYP mRNA u bubrezima koristeći 5-mjesečne svinje Landrace i Meishan te njihovo F1 (LM i ML) potomstvo. Nakon toga, kako bismo razjasnili učinak androgena na količine bubrežnih CYP mRNA, ispitali smo učinke kastracije i/ili liječenja TP-om na te količine. Ovi su rezultati sažeti u tablici 2. Analizirajući takve razlike u spolu i pasmini u odnosu na koncentraciju serumskog testosterona, ovdje smo pokazali da je serumski testosteron barem jedan od kritičnih čimbenika koji stvara te razlike u količini svake CYP mRNA u bubreg.
Slika 4. Negativne korelacije između koncentracije testosterona u serumu i količine CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29 i CYP3A46 mRNA u svinjskom bubregu
Koncentracije testosterona u serumu i količine CYP mRNA mjerene su kako je opisano u Materijalima i metodama. Neke od koncentracija testosterona u serumu pojedinačnih svinja preuzete su iz prethodno dobivenih podataka.24,25) Svaki simbol predstavlja svaku pojedinačnu svinju. Otvoreni kvadrati i pastile, 1-mjesečni mužjaci i ženke, redom, Landrace i Meishan svinje (n= 3 za oba spola Landrace i Meishan svinje); sivi kvadrati, 3-mjesečni muški mužjaci svinja rasa Landrace i Meishan (n= 4 za svinje Landrace i n= 6 za svinje Meishan); zatvoreni kockice i pastile, 5-mjesečni mužjaci i ženke svinja Landrace i Meishan (n= 6 za oba spola svinja Landrace i Meishan); zatvoreni i otvoreni trokuti, 5-mjesečne muške i ženske LM svinje (n= 6 za mužjake i n= 9 za ženke); zatvoreni i otvoreni obrnuti trokuti, 5-mjesečne muške i ženske ML svinje (n= 7 za mužjake i n= 10 za ženke); zatvoreni i otvoreni krugovi, 1-mjesečne muške i ženske svinje Landrace i Meishan tretirane TP-om (n= 3 za oba spola svinja Landrace i Meishan). Korelacije su ispitane pomoću podataka svih testiranih životinja i utvrđene regresijskom analizom, gdje je r koeficijent korelacije.
Prethodno smo pronašli spolne razlike (muški< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp1a1="" and="" cyp1a2="" mrnas="" in="" the="" liver="" of="" meishan, lm, and ml pigs but not in landrace pigs.23–25) however, ="" no ="" such ="" sex ="" differences were ="" observed in the ="" kidney ="" of landrace="" and="" meishan="" pigs.="" on="" the="" contrary,="" there="" was="" a="" sex="" difference="" (male="" >="" female)="" in="" the="" amount="" of="" cyp4a24/25="" mrna="" in ="" the ="" kidney ="" but ="" not ="" in ="" the ="" liver. ="" sex ="" differences ="" in ="" the ="" amounts="" of="" cyp2a19,="" cyp2c33,="" and="" cyp2c49="" mrnas="" in="" the="" pig="" kidney,="" especially="" in="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs,="" correlated="" with="" the="" previous="" results="" in="" the="">< female="" for="" cyp2a19;="" male="" >="" female="" for="" cyp2c33="" and="" cyp2c49.="" interestingly, ="" sex ="" differences ="">< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp2b22,="" cyp3a29, and/or cyp3a46="" mrnas="" in="" the="" kidney="" of="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs="" were="" the="" opposite="" of="" that="" previously obtained in the liver.22) sex differences in the amount of ="" cyp2a19,="" cyp3a29,="" and="" cyp4a24/25 ="" mrnas ="" were ="" observed ="" in the kidney of all the breeds of pig examined. although ="" sex ="" differences ="" in cyp2b22,="" cyp2c33, ="" and/or cyp2c49 ="" were ="" observed in meishan, lm, ="" and ml ="" pigs, ="" no ="" such ="" sex ="" differences ="">
Tablica 2. Sažetak razlika o spolu i pasmini ovisnih o androgenu u ekspresiji gena CYP izoformi u svinjskom bubregu
These sex and breed differences can be explained by the differences in the concentration of serum testosterone in male pigs. Male 5-month-old Meishan, LM, and ML pigs had high concentrations of serum testosterone (>cca. 40 ng/mL), dok su svinje Landrace imale niske koncentracije (<23 ng l). ="" because ="" the ="" amount ="" of ="" cyp2a19="" and="" cyp3a29 ="" mrnas ="" considerably ="" decreased ="" in ="" pigs ="" with ="">cca. 20 ng/mL serumskog testosterona, spolne razlike (muški< female) in ="" their ="" amounts ="" were ="" observed ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig. ="" likewise, ="" since ="" the ="" amount ="" of ="" cyp4a24/25="" mrna="" increased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent manner up to 80 ng/ml, a sex difference (male =""> female) was observed in all the breeds of pig. However, because clear changes in the amount of CYP2B22, CYP2C33, and CYP2C49 mRNAs occurred at >30 ng/mL serumskog testosterona, spolne razlike u njihovim količinama primijećene su kod svinja Meishan, LM i ML, ali ne i kod svinja Landrace. Sukladno tome, smatra se da takve razlike u spolu i pasmini ovise o koncentraciji testosterona u serumu. Ovu hipotezu dodatno podupiru pokusi na kastriranim i/ili TP-tretiranim svinjama. Naime, količine tih mRNK u kastriranih mužjaka (<12 ng testosterone/ml ="" in ="" serum) ="" were ="" almost ="" the="" same="" as="" the="" corresponding="" females.="" serum="" concentrations="" of="" testosterone="" in="" 5-month-old="" castrated="" males="" and="" intact="" females="" rose="" to="">100 ng/mL na TP tretmanu. Posljedično, u svinja liječenih TP-om, količine CYP2C33 i CYP4A24/25 mRNA, CYP2C33 i CYP4A24/25 mRNA porasle su jednako ili više od onih u 5-mjesečnih mužjaka Meishan svinja, a količine CYP2B22, CYP3A29 i CYP3A46 mRNA su se smanjile jednako kao i one u odgovarajućih muških svinja.
Smatra se da razlika u profilu lučenja hormona rasta (GH) između mužjaka i ženki kod mnogih životinja, osobito kod glodavaca, rezultira spolnim razlikama u količinama nekoliko enzima koji metaboliziraju lijekove, uključujući CYP, u jetri.26) Na primjer, spolne razlike u količinama mRNA izoformi Ugh, Sult i Cyp4a u mišjoj jetri pod utjecajem su lučenja GH prema muškom uzorku i/ili androgena, dok su te spolne razlike prvenstveno regulirane androgenom u bubrezima.21,27 ,28) Štoviše, predloženo je da transakcijski lokus, nazvan represija ovisna o GH (GDR), regulira gen za specifičnu steroidnu 15 -hidroksilazu (Cyp2a4) u mišjoj jetri,29) ali ovaj gen je prijavljen biti recipročno reguliran androgenom u jetri i bubrezima muških miševa.30) Suprotno tome, prethodno smo otkrili da kod svinja vrste Landrace sa spolnom razlikom u profilu lučenja GH,31) nije bilo spolnih razlika u količinama jetrene mRNA nekoliko izoformi CYP, SULT i UGT koji pokazuju spolne razlike u Meishan svinja.22-25,32) Stoga se smatra da takve spolne razlike u svinja uglavnom ovise o razlikama u koncentraciji testosterona u serumu. Međutim, budući da je profil izlučivanja GH modificiran androgenom,33-35) mogućnost da se promjene u količinama mRNA uočene pri kastraciji i/ili primjeni TP dogode, barem djelomično, kroz androgenom posredovanu promjenu u GH. uzorak sekrecije ne može se isključiti.
Breed differences in amounts of the mRNAs of CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, and CYP4B1 between sex-matched Landrace and Meishan pigs were also observed in the kidney (Table 1), while no such clear breed differences were observed in the liver.22,25) Additionally, as for CYP2C49 mRNA, individual differences in each breed of pig were observed regardless of serum testosterone concentration, suggesting that these varieties have genetic diversity. Incidentally, pig breeds are not genetically homogeneous. Interestingly, CYP3A46 mRNA was clearly detected in both the kidney and the liver of Landrace pigs but was below the detection limit in both organs of Meishan pigs.22) Furthermore, CYP3A46 mRNA was clearly detected in both the kidney and the liver of LM and ML pigs, indicating that expression of CYP3A46 mRNA, as well as serum testosterone,25) is determined by autosomal dominant inheritance. Because 5-month-old male LM and ML pigs, but not Landrace pigs, had high concentrations of serum testosterone (>40 ng/mL), spolna razlika u količini CYP3A46 mRNA primijećena je u LM i ML svinja, ali ne i u Landrace svinja. Ovi nalazi snažno upućuju na to da su genetski (pasmina) i selektivni čimbenici tkiva, zajedno sa serumskim testosteronom, uključeni u razine ekspresije nekoliko CYP gena vezane uz spol i pasminu. Nažalost, ovi čimbenici ostaju nejasni.
Zaključno, ovdje pokazujemo da postoje spolne i pasminske razlike u količinama mRNA izoformi obitelji CYP2, CYP3 i CYP4 u svinjskom bubregu i snažno sugeriramo da te razlike ovise o genetskim čimbenicima domaćina, uključujući koncentraciju androgena u serumu . Nadalje, pokazujemo tkivne razlike između bubrega i jetre u ekspresiji CYP gena vezanoj uz spol/androgen i snažno sugeriramo da postoji selektivni čimbenik tkiva odgovoran za ekspresiju gena CYP vezanu uz androgene. U budućnosti je potrebno istraživanje za identifikaciju spolno vezanog genetskog faktora domaćina i tkivno selektivnog faktora odgovornog za regulaciju CYP gena. U svakom slučaju, budući da je androgen jedan od čimbenika domaćina koji određuju razine ekspresije nekoliko CYP odgovornih za metabolizam lijeka, smatra se da mjerenje koncentracije testosterona u serumu pridonosi razvoju odgovarajućeg individualnog liječenja lijekovima.
Priznanja
Ovaj rad je djelomično podržan od strane Grant-in-Aid za znanstvena istraživanja Japanskog društva za promicanje znanosti (br. 19K06463, MK). Autori zahvaljuju Tsukuba Operation Unit 7, Centru za tehničku podršku središnje regije, NARO, Tsukuba, Japan za brigu o životinjama i za prikupljanje tkiva.
REFERENCE
1) Almazroo OA, Miah MK, Venkataramanan R. Metabolizam lijekova u jetri. Clin. Liver Dis., 21, 1-20 (2017).
2) Nebert DW, Wikvall K, Miller WL. Ljudski citokromi P450 u zdravlju i bolesti. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 368, 20120431 (2013).
3) Burkina V, Rasmussen MK, Pilipenko N, Zamaratskaia G. Usporedba citokroma P450 ljudi, svinja, glodavaca i riba koji metaboliziraju ksenobiotike. Toksikologija, 375, 10–27 (2017).
4) Nielsen SD, Bauhaus Y, Zamaratskaia G, Junqueira MA, Blaabjreg K, Petrat-Melin B, Young JF, Rasmussen MK. Konstitutivna ekspresija i aktivnost citokroma P450 u konvencionalnih svinja. Res. Veterinar. Sci., 111, 75–80 (2017).
5) Puccinelli E, Gervasi PG, Longo V. Xenobitotic metabolizing cytochrome P450 in pig, obećavajući životinjski model. Curr. Drug Metab., 12, 507-525 (2011).
6) Schelstraete W, Clerck LD, Govaert E, Millecam J, Devreese M, Deforce D, Bocxlaer JV, Croubels S. Karakterizacija CYP450 koji metabolizira lijekove u svinjskoj jetri i crijevima: usporedba s ljudskim ortolozima iz kvantitativne perspektive, aktivnosti i selektivnosti. Sci. Rep., 9, 9233 (2019).
7) Skaanild MT. Svinjski citokrom P450 i metabolizam. Curr. Pharm. Des., 12, 1421–1427 (2006).
8) Kojima M. Razlike u spolu i pasmini u ekspresiji konstitutivnih gena jetrenih enzima koji metaboliziraju lijekove u svinja Meishan i Landrace: razlike posredovane testosteronom. Jpn. Agric. Res. Q., 54, 7–12 (2020).
9) Bajaj P, Chowdhury SK, Yucha R, Kelly EJ, Xiao G. Novi modeli bubrega za istraživanje metabolizma, transporta i toksičnosti lijekova i ksenobiotika. Lijek Metab. Dispos., 46, 1692–1702 (2018).
10) Knights KM, Rowland A, Miners JO. Bubrežni metabolizam lijekova u ljudi: potencijal za interakcije lijeka i endobiotika koje uključuju citokrom P450 (CYP) i UDP-glukuronoziltransferazu (UGT). Br. J. Clin. Pharmacol., 76, 587-602 (2013).
11) Kojima M, Morozumi T. Kloniranje šest cDNA pune duljine koje kodiraju enzime svinjskog citokroma P450 i ekspresija gena ovih enzima u jetri i bubrezima. J. Health Sci., 50, 518-529 (2004).
12) Lundell K. Kloniranje i ekspresija dviju novih hidroksilaza masnih kiselina svinjske jetre i bubrega [citokrom P450 (CYP)4A24 i CYP4A25]. Biochem. J., 363, 297–303 (2002).
13) Nannelli A, Chirulli V, Longo V, Gervasi PG. Ekspresija i indukcija rifampicinom CAR- i PXR-reguliranih CYP2B i CYP3A u jetri, bubrezima i dišnim putevima svinje. Toksikologija, 252, 105– 112 (2008).
14) Puccinelli E, Gervasi PG, La Marca M, Buffy P, Longo V. Ekspresija i inducibilnost fenobarbitalom CYP2C33, CYP2C42, CYP2C49, CYP2B22 i CYP3As u svinjskoj jetri, bubrezima, tankom crijevu i nazalnim tkivima. Xenobiotica, 40, 525–535 (2010).
15) Shang H, Guo K, Liu Y, Yang J, Wei H. Konstitutivna ekspresija CYP3A mRNA u tkivima minijaturne svinje Bama. Gene, 524, 261–267 (2013).
16) Imaoka S, Hiroi T, Tamura Y, Yamazaki H, Shimada T, Komori M, Degawa M, Funai Y. Mutagena aktivacija 3-metoksi-4-amino azobenzena mišjim bubrežnim citokromom P450 CYP4B1: kloniranje i karakterizacija mišjeg CYP4B1. Arh. Biochem. Biophys., 321, 255–262 (1995).
17) Jarrar YB, Lee SJ. Molekularna funkcionalnost genetskih polimorfizama citokroma P450 4 (CYP4) i njihove kliničke implikacije. Int. J. Mol. Sci., 20, 4274 (2019).
18) Hiratsuka M, Matsuura T, Watanabe E, Sato M, Suzuki Y. Spolne razlike u konstitutivnoj razini aktivnosti bubrežne hidroksilaze laurinske kiseline i proteina povezanih s CYP4A u miševa. Biol. Pharm. Bull., 19, 512–517 (1996).
19) Degawa M, Miura S, Hashimoto Y. Bubrežni mikrosomalni citokrom P-450 ovisan o androgenu odgovoran za N-hidroksilaciju i mutagenu aktivaciju 3-metoksi-4-amino azobenzena u BALB/c miš. Cancer Res., 50, 2729-2733 (1990).
20) Isern J, Meseguer A. Hormonska regulacija i karakterizacija 5'-bočne regije mišjeg Cyp4b1 gena. Biochem. Biophys. Res. Commun., 307, 139–147 (2003).
21) Zhang Y, Klaassen CD. Hormonska regulacija izoformi Cyp4a u jetri i bubregu miša. Xenobiotica, 43, 1055–1063 (2013).
22) Kojima M, Degawa M. Spolne razlike u konstitutivnim razinama mRNA CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29 i CYP3A46 u svinjskoj jetri: Usporedba između Meishan i Landrace svinja. Lijek Metab. Pharmacokinet., 31, 185–192 (2016).
23) Kojima M, Sekimoto M, Degawa M. Nova razlika vezana uz spol u konstitutivnoj ekspresiji jetrenih enzima potporodice citokroma P4501A u svinja Meishan. Biochem. Pharmacol., 75, 1076-1082 (2008).
24) Kojima M, Sekimoto M, Degawa M. Androgenom posredovana niža regulacija gena podfamilije CYP1A u svinjskoj jetri. J. Endocrinol., 207, 203-211 (2010).
25) Kojima M, Degawa M. Razina androgena u serumu određena je autosomno dominantnim nasljeđem i regulira spolno povezane CYP gene u svinja. Biochem. Biophys. Res. Commun., 430, 833–838 (2013).
26) Waxman DJ, Holloway MG. Spolne razlike u ekspresiji jetrenih enzima koji metaboliziraju lijekove. Mol. Pharmacol., 76, 215-228 (2009).
27) Buckley DB, Klaassen CD. Mehanizam spolno divergentne ekspresije mRNA UDP glukuronoziltransferaze u jetri i bubregu miša. Lijek Metab. Dispos., 37, 834–840 (2009).
28) Alnouti Y, Klaassen CD. Mehanizmi spolno specifične regulacije mišjih sulfotransferaza (Sults). Xenobiotica, 41, 187–197 (2011).
29) Aida K, Negishi M. Trans-djelujući lokus regulira transkripcijsku represiju gena steroidne 15 -hidroksilaze specifične za ženke u mužjaka miša. J. Mol. Endocrinol., 11, 213-222 (1993).
30) Squires EJ, Negishi M. Recipročna regulacija spolno ovisne represije testosteron 15 -hidroksilaze (P-45015) u jetri i bubrezima muških miševa pomoću androgena. Dokaz za jedan gen. J. Biol. Chem., 263, 4166-4171 (1988).
31) Arbona JR, Marple DN, Russell RW, Rahe CH, Mulvaney DR, Sartin JL. Sekretorni obrasci i brzina metaboličkog čišćenja svinjskog hormona rasta kod svinja odabranih za rast. J. Anim. Sci., 66, 3068-3072 (1988).
32) Kojima M, Degawa M. Spolne razlike u ekspresiji konstitutivnih gena sulfotransferaza i UDP-glukuronoziltransferaza u svinjskoj jetri: regulacija posredovana androgenima. Lijek Metab. Pharmacokinet., 29, 192–197 (2014).
33) Chowen JA, Frago LM, Argente J. Regulacija izlučivanja GH pomoću spolnih steroida. Eur. J. Endocrinol., 151 (Suppl. 3), U95-U100 (2004).
34) Dubreuil P, Pelletier P, Couture Y, Lapierre H, Petitclerc D, Moris set J, Gaudreau P, Brazeau P. Učinci kastracije i testosterona na endogeno i somatokrininom inducirano oslobađanje hormona rasta u netaknutih i kastriranih muških svinja. Domest. Anim. Endocrinol., 6, 15–24 (1989).
35) Giustina A, Veldhuis JD. Patofiziologija neuroregulacije lučenja hormona rasta u pokusnih životinja i ljudi. Endocr. Rev., 19, 717–797 (1998).
