Studija o metodi određivanja sadržaja glikozida epifize i glikozida ergosterola u Cistanche Tubulosa

Cistanche tubulosa je suha mesnata stabljika s ljuskastim listovima koja pripada rodu Cistanche iz porodice Ledaceae. Tople je naravi, slatkog i slanog okusa, a pripada meridijanima bubrega i debelog crijeva. Ima tradicionalne učinke poput toniziranja bubrežnog yanga, njeguje esenciju i krv, vlaži crijeva i pospješuje rad crijeva te odgađa starenje. Poznat je kao "pustinjski ginseng". Počevši od izdanja Farmakopeje Narodne Republike Kine iz 2010., Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight je dodana kao jedna od zakonskih bazalnih biljaka Cistanche i navedena uz C. deserticola.

Cistanche tubulosa se uglavnom proizvodi duž južnog ruba Tarimskog bazena u autonomnoj regiji Xinjiang Uygur, parazitski raste na korijenju biljaka Tamarix. To je trenutno primarni izvor ljekovitih materijala Cistanche tubulosa na kineskom tržištu, s godišnjom proizvodnjom koja iznosi više od 60%. Zbog sve veće oskudice samoniklih resursa, uvrštena je kao drugorazredna zaštićena biljka na Nacionalni ključni popis zaštićenih samoniklih biljaka (izdanje 2021.).

Suvremena farmakološka istraživanja pokazala su da se temeljna farmakološka tvar Cistanche tubulosa temelji na feniletanoidnim glikozidima (PhGs), među kojima Echinacoside (C35H46O20) i Acteoside/verbascoside (C29H36O15) imaju najveći sadržaj i najjače djelovanje, te su izričito označeni kao karakteristične komponente za kontrolu kvalitete Cistanche tubulosa ljekovitih materijala Kineske farmakopeje. Prema izdanju Kineske farmakopeje iz 2020., ukupna količina ehinakrozida i verbaskozida u osušenom proizvodu Cistanche tubulosa ne smije biti manja od 1,5%, što je mnogo više od standarda od 0,30% za pustinjsku Cistanche tubulosa. Stoga je uspostavljanje točnih, učinkovitih i ponovljivih metoda određivanja sadržaja od velike važnosti za kontrolu kvalitete, procjenu podrijetla, optimizaciju sadnje i razvoj proizvoda ljekovitog materijala Cistanche tubulosa.

Ehinozid, glavna kemijska komponenta Cistanche tubulosa

Akteozid, glavna kemijska komponenta Cistanche tubulosa

Kemijska svojstva glikozida šišarke krizanteme i glikozida ergotamina

kemijska struktura

Glikozid borovine i ergosterol glikozid su feniletanoidni glikozidi, čiji se osnovni kostur sastoji od feniletanoidne jezgre povezane glikozidnim vezama sa šećernim skupinama (obično glukozom i ramnozom), a supstituirane skupine kao što su kafeoilne skupine uvode se na fenolnu hidroksilnu poziciju. Molekularna formula ehinakozida je C35H46O20, s relativnom molekulskom težinom od 786,72. Njegova struktura sadrži jednu kafeoilnu skupinu, jednu skupinu glukoze i jednu skupinu ramnoze. Molekulska formula ergosterol glikozida (verbaskozida) je C29H36O15, s relativnom molekulskom težinom od 624,59. Njegova je struktura slična onoj pinealozida, ali nema ramnozu i neke kafeoilne supstitucije. Oba su lako topljiva u polarnim otapalima kao što su metanol, etanol i voda i imaju karakterističnu apsorpciju u ultraljubičastom području (maksimalna valna duljina apsorpcije oko 330 nm), što daje teoretsku osnovu za HPLC-UV detekciju.

Farmakološka aktivnost

Glikozid krizanteme bora i ergosterol glikozid imaju širok raspon farmakoloških aktivnosti: (1) antioksidativni učinak - čišćenjem superoksidnih aniona (O2 · -), hidroksilnih radikala (· OH) i vodikovog peroksida (H2O2), aktiviranjem Nrf2/ARE signalnog puta i reguliranjem aktivnosti antioksidativnih enzima kao što su SOD i GSH Px; (2) Neuroprotektivni učinak - promicanje ekspresije neurotrofnih faktora kao što je GDNF, koji ima poboljšavajući učinak na modele Alzheimerove bolesti i Parkinsonove bolesti; (3) Učinci slični hormonima - potiču ekspresiju enzima povezanih sa sintezom testosterona i poboljšavaju reproduktivnu funkciju; (4) Hepatoprotektivni učinak - smanjenje alkoholnog oštećenja jetre i oksidativnog stresa; (5) Antitumorski učinak - izaziva apoptozu stanica raka jednjaka kroz mitohondrijske ovisne putove. Navedene aktivnosti čine ih nezamjenjivim indikatorskim komponentama za ocjenu kvalitete Cistanche tubulosa.

Učinci cistanhe-antitumorski

Pregled metoda određivanja sadržaja

Trenutno metode za određivanje sadržaja pinealnog glikozida i ergosterol glikozida u Cistanche tubulosa uglavnom uključuju tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti (HPLC), tekućinsku kromatografiju ultravisoke učinkovitosti (UPLC), digitalizaciju slike tankoslojnom kromatografijom (TLC ImageJ) i tandemsku spektrometriju mase tekućinske kromatografije (LC-MS/MS). Među njima, HPLC metoda je prihvaćena kao legalna metoda određivanja od strane Kineske farmakopeje zbog velike popularnosti opreme, jednostavnog rada i dobre ponovljivosti, i trenutno je metoda o kojoj se najviše izvještava u literaturi. Sljedeće se fokusira na uspostavljanje sustava i proces optimizacije HPLC metode.

Utjecaj različitih izvora i domaćina na sadržaj

Razlike u podrijetlu

Više studija dosljedno je pokazalo da postoje značajne razlike u sadržaju ehinakrozida i ergosterola u Cistanche tubulosa iz različitih regija. Uzimajući Xinjiang kao primjer, razlika u sadržaju dviju komponenti u uzorcima iz mjesta kao što su okrug Hetian Moyu, okrug Kashgar Jiashi i grad Alar može doseći 2-5 puta. Općenito govoreći, ukupna količina feniletanoidnih glikozida u Cistanche tubulosa proizvedenih u području Hotan (osobito u okrugu Moyu, okrugu Minfeng i okrugu Yutian) je relativno visoka, a sadržaj feniletanoidnih glikozida u nekim uzorcima visoke kvalitete može doseći 2,5% do 5,0%, što daleko premašuje standard farmakopeje od 1,5%.

Različiti utjecaji domaćina

Cistanche tubulosa parazitira na korijenju različitih biljaka iz roda Tamarix, a vrsta domaćina ima značajan utjecaj na kvalitetu ljekovitog materijala. Chen i sur. (2005.) izvijestili su da je sadržaj feniletanolne kiseline u uzorcima parazitiranim na T. talama kanensis općenito bio viši nego u uzorcima parazitiranim na T. ramosissima. Osim toga, postoje razlike između divljih i kultiviranih proizvoda. Općenito, sadržaj dviju komponenti u divljim proizvodima veći je nego u uzgojenim proizvodima, ali visokokvalitetni uzgojeni proizvodi također mogu postići više razine optimiziranjem uvjeta sadnje.

Razlike u specifikacijama i dijelovima

Karakteristike (promjer, dužina) i ljekoviti dijelovi Cistanche tubulosa također utječu na njen sadržaj. Istraživanja su pokazala da je sadržaj ehinakozida i ergosterola u tanjim mesnatim stabljikama često veći nego u debljim; Sadržaj u gornjem dijelu stabljike (blizu kraja cvata) obično je veći od onog u bazi. Ovo pravilo predstavlja referencu za odabir dijelova tijekom berbe i prerade ljekovitog bilja.

Uvod u druge metode mjerenja

Tekućinska kromatografija ultravisoke učinkovitosti (UPLC)

Cistanche tubulosa eksperiment

Kliknite ovdje za pregled prirodnog dodatka ekstrakta Cistanche Tubulosa u prahu

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / WhatsApp: 0086 18599088692 / WeChat: 18599088692

UPLC metoda koristi kromatografsku kolonu s manjom veličinom čestica (kao što je Waters HSS T3, 1,8 μm, 100 × 2,1 mm), brzinom protoka od 0,3 mL/min, volumenom injekcije od samo 1 μL, a vrijeme analize može se skratiti na 10-15 min (tradicionalni HPLC zahtijeva 30-50 min), s boljim odvojenost i osjetljivost. Liang Jiansong i dr. (2021.) uspostavili su UPLC metodu za istovremeno određivanje šest feniletanolnih glikozida, koja ima širok linearni raspon i visoku stopu oporavka, te je prikladna za brzi pregled velikih količina uzoraka.

LC-MS/MS metoda

Metoda tandemske masene spektrometrije tekućinske kromatografije ima izuzetno visoku osjetljivost i može istovremeno odrediti desetke komponenti u Cistanche tubulosa, uključujući ehinakozid, ergosterol glikozid, izoergosterol glikozid i gvanozin A. Pogodan je za metabolomička istraživanja i sveobuhvatnu procjenu kvalitete. Kombinirana tehnologija RPLC-HILIC može mjeriti čak 23 polarne i nepolarne komponente odjednom, pokrivajući raspon sadržaja od 5 reda veličine.

Online mikroekstrakcija otapalom pod pritiskom vrtložna strujna HPLC metoda

Ova metoda spaja ekstrakciju uzorka, pročišćavanje i kromatografsko odvajanje na mreži, značajno smanjujući potrošnju organskih otapala i upotrebu uzorka. LOQ-ovi triju feniletanolnih glikozida su 0,50 mg/L (ehinakozid), 0,25 mg/L (ergosterol glikozid), odnosno 0,38 mg/L (izoergosterol glikozid), što je prikladno za brzu analizu dragocjenih uzoraka.

TLC metoda digitalizacije slike

ekstrakt cistanche u prahu

Na temelju softvera ImageJ izvršena je kvantitativna analiza sivih vrijednosti mrlja tankoslojne kromatografije. Koeficijenti korelacije r glikozida pinealne krizanteme, gvanozina A, ergosterol glikozida i izoergosterol glikozida bili su 0,9974, 0,9931, 0,9923, odnosno 0,9890, što je bilo u skladu s HPLC metodom. Ova je metoda jeftina, jednostavna za rukovanje i prikladna za brzi pregled u osnovnim jedinicama i na terenu.

rasprava

Ključna pitanja u optimizaciji kromatografskih uvjeta

Odabir mobilne faze ključan je u razvoju HPLC metoda. Usporedba literature pokazuje sljedeće: (1) vodeni acetonitrilni sustav sklon je uzrokovati zadržavanje pika feniletanolnog glikozida, a dodavanje 0,1% mravlje kiseline ili 1% octene kiseline može značajno poboljšati oblik pika; (2) Učinkovitost odvajanja ternarnog sustava metanol acetonitril octena kiselina je bolja od one čistog metanola ili čistog acetonitrila binarnog sustava; (3) Odabir valne duljine detekcije od 330-334 nm može uravnotežiti intenzitet apsorpcije obiju komponenti, s malo većim odgovorom na 334 nm i manjim smetnjama ergosterola na 330 nm. Temperatura kolone ima utjecaj na vrijeme zadržavanja, ali ne mijenja značajno stupanj odvajanja, s razumnim rasponom od 30-35 stupnjeva.

Optimizacija metoda ekstrakcije

Koncentracija otapala, omjer kruto-tekuće, temperatura ultrazvuka i vrijeme utječu na učinkovitost ekstrakcije. Istraživanja su pokazala da: (1) 50%~80% metanola ili etanola može učinkovito ekstrahirati obje komponente glikozida, uz nešto veću stopu ekstrakcije od 60%~80% etanola; (2) Omjer čvrste tvari i tekućine od 1:30~1:50 (g/mL) dovoljan je za temeljitu ekstrakciju; (3) Optimalna kombinacija je temperatura ultrazvuka od 50-60 stupnjeva i vrijeme od 40 minuta; (4) Ultrazvučna ekstrakcija je bolja od refluksne ekstrakcije, budući da potonja može lako dovesti do razgradnje termoosjetljivih feniletanolnih glikozida.

Rasprava o racionalnosti farmakopejskih standarda

Trenutna farmakopeja propisuje da ukupna količina paeoniflorina i ergosterol glikozida u Cistanche tubulosa treba biti veća ili jednaka 1,5%. Ovaj standard je relativno labav - uzorci visoke kvalitete iz Xinjianga obično dosežu 3% do 5%, a samo nekoliko uzoraka niske kvalitete približava se donjoj granici. Neki istraživači predlažu podizanje standarda na 2,0% do 2,5% kako bi se bolje osigurala kvaliteta medicinskih materijala. Osim toga, farmakopeja koristi samo dvije komponente kao indikatore, dok Cistanche tubulosa također sadrži različite aktivne feniletanolne glikozide kao što su gvanozin A, izoergosterol glikozidi i hesperidin. Sveobuhvatna multiindikatorska evaluacija je smjer budućeg razvoja.

Prijedlozi za odabir metode

Za provjeru kvalitete općih ljekovitih materijala i svakodnevnu kontrolu kvalitete proizvodnje preporučuje se korištenje farmakopejske HPLC metode. Metoda je zrela, zahtjevi za opremom su niski, a rezultati vrlo usporedivi. Za pregled velikih uzoraka ili analizu dragocjenih uzoraka učinkovitije su UPLC ili online PLME-TFC-HPLC metode. Metoda LC-MS/MS klasifikacije preferirana je metoda za dubinsku procjenu kvalitete i identifikaciju sorte. Metoda TLC slike prikladna je za brzi početni pregled na lokalnoj razini. Istraživači bi trebali donositi razumne odluke na temelju stvarnih potreba.

ekstrakt cistanche u prahu

Zaključak

U ovom članku sustavno je razrađena HPLC metoda za određivanje sadržaja ehinakozida i ergosterola u Cistanche tubulosa. Ova metoda je potvrđena višedimenzionalnom metodologijom i ima karakteristike širokog linearnog raspona (r Veći ili jednak 0,999), dobre preciznosti (RSD<3%), high accuracy (recovery rate 95.7%~100.7%), and easy operation, fully meeting the quality control requirements of the Chinese Pharmacopoeia for Cistanche tubulosa.

Sveobuhvatna analiza pokazuje da: (1) sadržaj glikozida epifize u Cistanche tubulosa obično je 3-8 puta veći od ergosterol glikozida, a ukupna količina ta dva varira ovisno o mjestu podrijetla, domaćinu, veličini i lokaciji; (2) Ukupna količina feniletanolne kiseline u visokokvalitetnim uzorcima iz Hotana, Xinjiang može doseći 2-3 puta ili više od standarda farmakopeje; (3) Nove tehnologije kao što su UPLC i LC-MS/MS pružaju moćne alate za višekomponentno sinkrono određivanje i duboku evaluaciju kvalitete.

Buduća bi se istraživanja trebala usredotočiti na: (1) uspostavljanje sustava procjene kvalitete s više indeksa koji pokriva više feniletanoidnih glikozida; (2) temeljito istraživanje sveobuhvatnog utjecaja okoliša sadnje, razdoblja žetve domaćina i metode obrade na sadržaj; (3) promicanje standardizacije cijelog industrijskog lanca Guanhua Cistanche od ljekovitog bilja do zdrave hrane i kozmetičkih sirovina.

Reference

[1] HPLC metoda jušne mahovine za određivanje sadržaja ehinakozida i ergotamina u Guanhua Roucong Kuiju [J]. Kineski farmaceut, 2009, 12 (8): 1061-1063

[2] Chen M, Xiao SP, Cui GH, et al. Određivanje ehinakozida i akteozida u biljkama Cistanche tubulosa [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2005., 30(11): 839-841.

[3] Baoshan, Ju Aihua, Xiao Zhibin. Određivanje sadržaja ehinakozida i ergotamina u Guanhua Roucong Kui [J]. Revija kineske medicine, 2017., 23 (19): 39-40, 44

[4] Liang Jiansong, Xue Cuili, Wu Menghua, itd. UPLC određivanje sadržaja i kemometrijska procjena šest feniletanoidnih glikozida u Roucong Kui i Shacong Kui [J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2021, 41 (2): 226-235

[5] Odbor za farmakopeju Narodne Republike Kine Farmakopeja Narodne Republike Kine (izdanje 2020., svezak 1) [S]. Peking: China Medical Science and Technology Press, 2020: 148-149

[6] Zhang Leihong, Du Niansheng, Wang Qing, itd. Određivanje sadržaja ehinoklorina u Roucongkui ukupnim glikozidnim kapsulama pomoću HPLC [J]. Northwest Pharmaceutical Journal, 2002, 17 (1): 3-4

[7] Ju Aihua, Ao Geriletu, Zhou Kai Određivanje sadržaja ehinakozida i ergotamina u usoljenom mesu i suncokretu iz Unutrašnje Mongolije [J]. Kineski časopis tradicionalne kineske medicine, 2011., 26 (1): 178-180

[8] Song Peng, Tu Pengfei. Napredak istraživanja kontrole kvalitete i procjene tradicionalne kineske medicine Roucongkui [J]. Sjeverna ljekarna, 2011, 8 (2): 45-47

[9] Guo Dingyu, Xiao Jinglei. Napredak u kontroli kvalitete i istraživanju biološke aktivnosti funkcionalnih komponenti u Roucongkuiju [J]. Tradicionalna kineska medicina Jilin, 2023., 43 (7): 856-860

[10] Lu Yinghui, Pi Wenmin, Zhang Yue, itd. Komparativna studija i analiza stanja tržišta Roucong Kui i Guanhua Roucong Kui [J]. Moderna kineska medicina, 2019, 21 (8): 1105-1110

[11] Standard Nacionalnog odbora za farmakopeju za granule formule Roucongkui (Guanhua Roucongkui) [S]. Peking: China Medical Science and Technology Press, 2021

[12] Fu C, Li J, Aipire A, et al. Feniletanoidni glikozidi Cistanche tubulosa induciraju apoptozu u Eca-109 stanicama putem puta koji ovisi o mitohondrijima [J]. Oncology Letters, 2019, 17(2): 1883-1892.

[13] Xu Mingjun, Analiza kvalitete čekanja i sveobuhvatna procjena suncokreta iz pustinjskog mesa iz različitih regija u Kini [J]. Znanost i tehnologija prehrambene industrije, 2022., 43 (15): 312-320

[14] Sister Hao, Chen Sumei, Yan Donghai itd. Napredak istraživanja o primjeni Roucongkuija u kozmetici [J]. Journal of Daily Chemical Science, 2021, 44 (9): 28-33

[15] Hou Ji, Wang Bo, Li Guanghui itd. Napredak istraživanja i status industrijalizacije Roucongkuija [J]. Shandong Agricultural Science, 2020., 52 (12): 147-154