Studija o neuroendokrino-imunološkoj funkciji Cistanche Deserticola i njezinih proizvoda za kuhanje rižinog vina na modelu štakora induciranom glukokortikoidima-Ⅱ

3.2.4. Imunohistokemija

Apoptozu neurona kontroliraju mnogi apoptotski i antiapoptotski geni, uglavnom gen Bax koji potiče apoptozu i antiapoptotski geni iz obitelji gena Bcl-2. Bcl-2 je lokaliziran u organelama koje proizvode reaktivni kisik kao što su mitohondriji, endoplazmatski retikulum i nuklearne membrane. Bcl-2 malo utječe na slobodne radikale kisika, ali možespriječiti oksidativno oštećenje stanica. Bax se prenosi iz citoplazme do mitohondrijske membrane, mijenja strukturu mitohondrijske membrane i potiče otpuštanje citokroma c i indukciju apoptoze.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Došlo je do ekspresije u nadbubrežnoj citoplazmi Bax i Bcl-2 proteina. Bojanje je pokazalo sve žute čestice. U usporedbi sa skupinom BC, prosječna optička gustoća proteina Bax u skupini MC značajno se povećala (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

Slika 5(b) pokazuje da se u usporedbi s onom u skupini BC, prosječna optička gustoća proteina Bcl-2 u skupini MC značajno smanjila (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

Protein kaspaza-3 lokaliziran je uglavnom u citoplazmi u svom izvornom obliku u normalnim tkivima i ima slabu ekspresiju. Pozitivni signali su blijedo žuti ili smeđe žuti. U usporedbi s skupinom BC, ekspresija kaspaze-3 u skupini MC značajno se povećala (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

U normalnim tkivima ekspresija Fas gena bila je smanjena, a pozitivan signal za in situ hibridizaciju bio je smeđežut. Kao što je prikazano na slici 5(d), u usporedbi s grupom BC, prosječna optička gustoća proteina Fas u skupini MC povećala se (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

Protein FasL nalazi se uglavnom u staničnoj membrani ili citoplazmi, a njegovi pozitivni signali su smeđi. U usporedbi sa skupinom BC, prosječna optička gustoća gena FasL u skupini MC značajno se povećala (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

Rezultati su pokazali da CD i WCD moguinduciraju apoptozu u upalnim stanicamai smanjiti oštećenje nadbubrežne žlijezde promicanjem ekspresije proteina FasL i vezanjem na protein Fas, aktiviranjem proteina kaspaze-3 i pokretanjem kaskade kaspaze. Učinak grupe WCD-HD bio je najbolji.

3.3. Određivanje imunološke funkcije

3.3.1. Indeks imunoloških organa

U usporedbi s onima iz skupine BC, koeficijent timusa i indeks slezene skupine MC značajno su se smanjili (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3.2. Detekcija podskupa T limfocita u perifernoj krvi

Postotak CD4+ stanica u gornjem lijevom kvadrantu i CD8+ stanica u desnom donjem kvadrantu u BC i svakoj skupini lijekova bio je viši od onog u MC skupini. U usporedbi sa skupinom BC, omjer CD4+ThCD8+ značajno se smanjio u skupini MC (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. Određivanje razine IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α i IFN-C u serumu

Slika 8 pokazuje da je u usporedbi s skupinom BC-a razina IL-6, TNF- i IFN-c značajno porasla (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. Rezultati eksperimenta promatranja Lymus tkiva mikroskopom

Slika 9 pokazuje da je u skupini BC-a bio prisutan veliki broj limfocita. Limfociti i retikulociti bili su labavo raspoređeni u središtu s raštrkanim okruglim ili ovalnim timocitima. Nije bilo nekroze, infiltracije upalnih stanica i abnormalnih promjena.

Skupina MC pokazala je veliku količinu tkiva limfne nekroze, s poremećenim rasporedom limfocita i retikulocita u središtu. Okrugli ili ovalni timociti su nestali, evidentna je masivna stanična degeneracija ili nekroza, te je došlo do upalne stanične infiltracije s abnormalnim patološkim promjenama.

U skupinama s CD-om morfološke karakteristike limfocita vratile su se na normalu, a raspored središnjih limfocita i retikulocita bio je gotovo normalan. Okrugli ili ovalni timociti su se oporavili, ali je ostao mali broj degenerativnih ili nekrotičnih limfocita i infiltrirajućih upalnih stanica.

U WCD skupinama i PC skupini morfološke karakteristike limfocita bile su bolje popravljene. Limfociti i retikulociti u centru bili su dobro poredani, okrugli ili ovalni timociti bili su gotovo normalni, ali ostao je mali broj infiltrirajućih i degenerativnih limfocita.

3.4. Ekspresija gena CaM proteina

RQ vrijednost (CaM mRNA - aktin mRNA) smatrana je za ispitivanje ekspresije CaM mRNA. RQ skupine BC bio je 1. Ekspresija CaM mRNA u hipotalamusu u skupini MC značajno se povećala (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. Rasprava

Kineska farmakopeja [2] bilježi da se CD i WCD mogu koristiti u klinici kao glavne vrste dekoktanata. Nakon kuhanja na pari s rižinim vinom,antiaging i tonificirajuće bubrežno-yang učinkebili poboljšani. Pomoću UPLC-QqQ-MS detektirali smo kvantitativne promjene u bazi kemijskog materijala tijekom procesa kuhanja rižinog vina na pari. Iridoidni glikozidi bili su nestabilni i sadržaj tih glikozida se smanjio, čak ih je postalo nemjerljivo. Promijenio se i sadržaj feniletanol glikozida, što je moglo izazvati promjene u farmakodinamici i kliničkom učinku.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Klasični model bubrežno-yang deficijencije repliciran je supkutanom injekcijom kortikosterona [19]. Predoziranje kortikosteronom moglo bi inhibirati izlučivanje CRH u hipotalamusu. U međuvremenu, tajna ACTH je također bila inhibirana. Snižena je razina hormona kore nadbubrežne žlijezde, a time i smanjena funkcija HPA osi. Hipofunkcija HPA osi uobičajena je karakteristika nedostatka bubrežnog janga [20]. Zatim štakori pokazuju fenomen "iscrpljenja" i simptomi su u skladu s onima nedostatka yanga bubrega u klinici.

U skupini MC, razina CRH, ACTH, T i CORT u serumu štakora značajno se smanjila (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

Moduliranje udjela članova obitelji Bcl-2 jedan je od temeljnih mehanizama kojima FasThFasL posreduje put receptora smrti, a obitelj Bcl-2 regulira mitohondrijski put [21]. Čimbenik koji inhibira apoptozu Bcl-2 i faktori koji induciraju apoptozu, kao što je Bax, svi pripadaju obitelji Bcl-2 [22]. Stanična apoptoza može se odrediti relativnim omjerom čimbenika koji inhibiraju apoptozu i čimbenika koji induciraju apoptozu [23]. Mitohondriji imaju funkciju središnjih kontrolnih točaka za mnoge oblike apoptoze [24]. Ova studija pokazala je da CD-MD i WCD mogu zaključiti o ekspresiji Baxa i povećati Bcl-2 napoboljšati nedostatak bubrežnog janga. Fas je glavni receptor smrti koji inducira apoptozu vezanjem s Fas ligandom (FasL) [25]. Ekspresija Fas i FasL u skupini MC je porasla, dok je ova ekspresija značajno porasla u skupini WCD-MD (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

Nedostatak imunološke funkcije jedna je od važnih manifestacija nedostatka bubrežnog janga [28]. U ovoj studiji otkrili smo da se indeks slezene i timusa WCD-MD skupine značajno oporavio (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

HPA os je najvažniji regulacijski sustav jer regulira lučenje glukokortikoida i endokrini sustav za održavanje sekretorne funkcije kore nadbubrežne žlijezde [32]. Prekomjerna ekspresija CaM mRNA u tkivu hipotalamusa bila je povezana s nedostatkom bubrežnog yanga. CD i WCD mogu blokirati kalcijeve kanale, inhibirati ekspresiju CaM mRNA u hipotalamusu i smanjiti priljev kalcija, čime se smanjuje aktivnost kompleksa Ca2+·CaM.

Formiranje nedostatka bubrega-yang je kronični proces razvoja bolesti. Bubreg više nije čisto anatomski pojam, već je opći pojam za neuroendokrini imunitet i genitourinarni sustav. Neuroendokrino-imuna (NEI) mreža je važan integrirani regulatorni sustav [33]. CD i WCD mogu regulirati funkciju HPAT osi i poboljšati oporavak nedostatka bubrežnog janga. Ovaj rezultat pruža eksperimentalnu osnovu za kliničku prevenciju i liječenje nedostatka yanga bubrega.