UW otopina nadopunjena natrijevim tiosulfatom štiti bubrežne presatke od produljene ozljede hladnom ishemijom-reperfuzijom u mišjem modelu singenične transplantacije bubrega

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang i sur

Cistanche tubulosa sprječavabubregbolest, kliknite ovdje da biste dobiliproizvodi i Cistanche Nz

SAŽETAK

Uvod:Hladna ishemijsko-reperfuzijska ozljeda (IRI) je neizbježan događaj koji povećava posttransplantacijske komplikacije. Prethodno smo pokazali da dodatak otopini Sveučilišta Wisconsin (UW) donorskim molekulama sumporovodika (H2S) koje nije odobrila FDA smanjuje hladni IRI i poboljšava funkciju bubrežnog presatka nakon transplantacije. Ova studija istražuje hoće li donorska molekula H2S, natrijev tiosulfat (STS), koju je odobrila FDA, imati isti ili bolji učinak u klinički relevantnom štakorskom modelu singeneičke ortotopnebubregtransplantacija.

metoda:Trideset Lewis štakora podvrgnuto je bilateralnoj nefrektomiji praćenoj singeničnom ortotopskom transplantacijom lijevebubregnakon 24-satnog čuvanja u UW ili UW plus STS otopini na 4 ◦C. Štakori su praćeni do 14. dana nakon transplantacije i žrtvovani da bi se procijenila bubrežna funkcija (izlučivanje urina, kreatinin u serumu i dušik uree u krvi).Bubregrezovi su obojeni s H&E, TUNEL, CD68 i mijeloperoksidazom (MPO) kako bi se otkrila akutna tubularna nekroza (ATN), apoptoza, infiltracija makrofaga i infiltracija neutrofila.

Proizlaziti:UW plus STS presaci pokazali su značajno poboljšanu funkciju presatka odmah nakon transplantacije, s poboljšanim preživljavanjem primatelja u usporedbi s UW presacima (p < {{0}}.05).="" histopatološki="" pregled="" otkrio="" je="" značajno="" smanjenu="" atn,="" apoptozu,="" infiltraciju="" makrofaga="" i="" neutrofila="" i="" nižu="" regulaciju="" proupalnih="" i="" proapoptotskih="" gena="" u="" uw="" plus="" sts="" presacima="" u="" usporedbi="" s="" uw="" presadcima="" (p=""><>

Zaključak:Po prvi put pokazujemo da očuvanje bubrežnih presatka u otopini UW s dodatkom STS-a štiti od produljenog hladnog IRI-a potiskivanjem apoptotičkih i upalnih putova, i time poboljšava funkciju presatka i produljuje preživljenje primatelja. Ovo bi moglo predstavljati novu klinički primjenjivu terapijsku strategiju za smanjenje štetnog kliničkog ishoda produljene hladne IRI ububregtransplantacija.

Ključne riječi:Natrijev tiosulfat (STS) Ishemijsko-reperfuzijska ozljeda (IRI) Statičko hladno skladištenje (SCS)Bubregtransplantacija Preživljavanje presatka i primatelja

1. Uvod

Bubregtransplantacija je optimalni tretman za krajnji stadijbubregbubrežnibolest (ESRD). U usporedbi s dijalizom,bubregtransplantacija je superiorna jer pruža bolju kvalitetu života i daje značajnu prednost u preživljavanju uz svoju isplativost [1-3]. Međutim, dobivanje bubrega davatelja inherentno je povezano s ishemijsko-reperfuzijskom ozljedom (IRI), neizbježnom posljedicom prestanka i naknadne obnove protoka krvi tijekom transplantacije [4]. Trenutna strategija za ublažavanje IRI izazvane transplantacijom je statično hladno skladištenje (SCS) bubrežnih presatka u standardnim otopinama za očuvanje kao što je otopina Sveučilišta Wisconsin (UW) na ledu na 4 ◦C tijekom razdoblja prije transplantacije [5]. Međutim, pokazalo se da je produženi SCS povezan s povećanom smrću stanica, upalom i drugim štetnim staničnim i molekularnim događajima, koji u konačnici rezultiraju povećanom incidencijom odgođene funkcije presatka (DGF), akutne tubularne nekroze (ATN) i smanjenja presatka preživljavanje [6-10]. Osim toga, kako bi išli u korak s globalno rastućom incidencijom ESRD-a i sve većim brojem pacijenata na listama čekanja za transplantaciju, mnogi transplantacijski centri prihvaćaju bubrežne presatke s produljenim razdobljima hladne ishemije, što dodatno pridonosi ukupnom oštećenju tkiva. Nakon SCS je reperfuzija, kada se topla oksigenirana krv vraća u hladni ishemijski graft. Reperfuziju, koja je efektorska faza ishemijske ozljede, karakterizira povećana ozljeda tkiva [11-13].

Potencijalna terapijska strategija za ograničavanje hladnog IRI tijekombubregtransplantacija uključuje nadopunjavanje standardne otopine za konzerviranje sumporovodikom (H2S), endogeno proizvedenim plinskim prijenosnikom za koji se pokazalo da ima važnu fiziološku ulogu u vazodilataciji i staničnoj signalizaciji [14-16]. Prethodno smo pokazali da produženi SCS u UW otopini s dodatkom H2S smanjuje hladni IRI izazvan transplantacijom i poboljšava preživljenje transplantata u mišjim modelima singeneičke i alogene transplantacije bubrega [17-19, 41, 42]. Međutim, molekule donora H2S korištene u ovim studijama nisu klinički održive. To je dovelo do razmatranja upotrebe natrijevog tiosulfata (STS), lijeka za doniranje H2S koji je odobrila Uprava za hranu i lijekove (FDA) za liječenje kalcifilaksije u pacijenata s ESRD-om, toksičnosti izazvane cisplatinom u terapiji raka i kao protuotrov za trovanje cijanidom [20-23]. Nedavne studije su pokazale da STS pokazuje zaštitne učinke u životinjskim modelima IRI [24-26]. Međutim, njegov učinak na hladni bubrežni IRI izazvan transplantacijom nije poznat. Stoga ova studija istražuje renoprotektivne učinke STS-a u in vitro modelu bubrežne IRI i štakorskom modelu singeneičke ortotopske transplantacije bubrega.

2. Materijali i metode

2.1. Eksperimentalni in vitro protokol

In vitro model hladne hipoksije i oštećenja toplom reoksigenacijom koji oponaša stanične uvjete tijekom in vivo hladnog IRI korišten je za procjenu zaštitnih učinaka STS tijekom bubrežnog IRI. Epitelne stanice bubrega štakora (NRK{{0}}E stanična linija; ATCC, SAD) korištene su u in vitro eksperimentima jer su te stanice osjetljive na ishemijsku ozljedu [27], a njihova je uporaba u skladu s štakorskom model transplantacije korišten za drugi cilj ove studije. Stanice su uzgajane u Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju (DMEM) koji sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS) inaktiviranog zagrijavanjem na 60 ◦C tijekom 20 minuta i 1 posto penicilina/streptomicina (P/S). Stanice su inkubirane pri normalnim uvjetima rasta od 37°C, 21 posto O2 i 5 posto CO2. Kontrolne stanice bile su u uvjetima identičnim onima za predeksperimentalne stanice. Eksperimentalne stanice tretirane su s medijem bez seruma (SF), SF plus 200 nM AP39 ili SF s različitim koncentracijama (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) natrijevog tiosulfata pentahidrata (STS), koji su dobiveni iz 250 mg/mL injekcijska otopina STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Kanada]). Upotrijebljena je koncentracija od 200 nM AP39 jer smo prethodno pokazali da je AP39 u ovoj koncentraciji citoprotektivan protiv iste stanične linije u sličnom modelu hladnog IRI [20]. Stanice su zatim inkubirane na 10 ◦C tijekom 24 sata pod hipoksičnim uvjetima (5 posto CO2, 0,5 posto O2, 95 posto N2) u hipoksijskoj komori HypOxystation H85 (HYPO2YGEN, SAD) kako bi se izazvala hladna ishemijska ozljeda. Korištena je hipotermijska temperatura od 10 ◦C jer je to bila najniža temperatura koja se tehnološki mogla postići uz održavanje razine hipoksije od 0,5 posto O2. Nakon hipoksije, medij koji je sadržavao eksperimentalne stanice zamijenjen je kontrolnim medijem, a stanice su reoksigenirane putem inkubacije pod normalnim uvjetima rasta (37 ◦C, 21 posto O2 i 5 posto CO2) tijekom 24 sata kako bi se simulirala reperfuzija i s njom povezana ozljeda. Nakon 24 sata reoksigenacije, stanična održivost procijenjena je bojenjem stanica s FITC-konjugiranim aneksinom-V (FITC-Annexin-V; BioLegend, SAD) i 7-Aminoaktinomicinom D (7-AAD; BioLegend, SAD ), koji mjeri staničnu apoptozu odnosno nekrozu. Stanice su analizirane protočnom citometrijom pomoću CytoFLEX S (Beckman Coulter, SAD). FlowJo verzija 11 (FlowJo LLC, SAD) korištena je za prikladno prikupljanje podataka za statističku analizu.

2.2. Pokusne životinje

Trideset mužjaka Lewis štakora težine 275-300 g i kupljenih od Charles Rivera (St. Constant, QC, Kanada) bili su smješteni u ustanovi za brigu o životinjama i veterinarske službe na Sveučilištu Western (London, ON) pod standardnim uvjetima. Studije na životinjama odobrio je Western University Council on Animal Care and Animal Care with ID protokola 2018–155.

2.3. Model transplantacije bubrega

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >gubitak težine od 20 posto) ili smrt. Humane krajnje točke provjeravane su dva puta dnevno i svi su štakori eutanazirani izlaganjem CO2 u komori pri protoku od 40 posto. U vrijeme eutanazije nije bilo kirurških komplikacija koje bi mogle rezultirati varijacijama u rezultatima.

2.4. Analiza bubrežne funkcije

Nakon transplantacije bubrega, štakori su praćeni u metaboličkim kavezima 14 dana i potom žrtvovani. Uzorci krvi i urina prikupljeni su na POD 3, 5, 7, 10 i 14 kako bi se odredili parametri bubrežne funkcije (kreatinin u serumu, dušik ureje u krvi [BUN], osmolalnost urina i izlučivanje urina). BUN i kreatinin u serumu bili su od primatelja transplantiranog bubrega, a lažno operirani štakori izmjereni su pomoću IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer stroja (Markham, ON). Razine osmolalnosti urina određene su osmometrijom na točki smrzavanja pomoću uređaja 3320 Osmometer (Advanced Instruments, Norwood, MA) i uspoređene sa standardima koje je dostavila tvrtka.

2.5. Histopatološka i morfometrijska analiza

Bubrežna tkiva uklopljena u parafin izrezana su na dijelove debljine 4 µm i postavljena na mikroskopska stakalca za histologiju. Sekcije su obojene hematoksilinom i eozinom (H&E), terminalnom deoksinukleotidil transferazom dUTP nick end označavanjem (TUNEL) kako bi se odredio stupanj ATN odnosno apoptoze. Zaslijepljeni bubrežni patolog dodijelio je H&E ocjenu za ATN prema sljedećoj shemi: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 posto grafta ATN. Dijelovi bubrega također su obojeni sljedećim primarnim antitijelima: marker ozljede bubrega (KIM-1), površinski marker makrofaga CD68 i neutrofil-specifični enzim mijeloperoksidaza (MPO; Abcam®, Toronto, Kanada) i vizualizirani sekundarnim antitijelima i Kromogen supstrata DAB pomoću sustava Dako Envision (Dako, Glostrup, Danska) u skladu s protokolom proizvođača, nakon čega se analizira pod digitalnim svjetlosnim mikroskopom Eclipse 90i (Nikon® Instruments, New York) pri povećanju od 10x i kvantificira softverom ImageJ v. 1.8 (National). Institute of Health, Bethesda, MD).

2.6. Kvantitativna PCR analiza

Ukupna RNA izolirana je iz tkiva bubrežnog presatka dobivenog na POD 3 pomoću RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Kanada) i obrnuto transkribirana u cDNA pomoću OneScript® Plus cDNA synthesis Kit (ABM, Kanada) u kombinaciji s oligo(dT)12– 18 primera prema protokolu proizvođača. Izolirana RNA i cDNA analizirane su pomoću nanokapljice (DeNovix DS-11 spektrofotometar, Kanada) prije upotrebe, s ocjenama A260/280 dosljedno > 1,95 odnosno > 1,8. Reakcijska smjesa svakog qPCR uzorka imala je volumen od 20 µL i napravljena je prema Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Kanada) protokolu i analizirana pomoću CFX Connect Real-Time PCR Detection System stroja (Bio-Rad, Kanada) . Slijedovi primera dizajnirani su korištenjem softvera Primer-BLAST (NCBI) protiv beta-aktina, poli (ADP-riboze) polimeraze (PARP), interferona-gama (IFN-), faktora nekroze tumora-alfa (TNF-), interleukina 6 (IL -6), B-stanični limfom 2 (Bcl-2), Bcl-2- povezani X protein (BAX), kaspaza 3, BH3 interakcijski domenski agonist smrti (BID), c-Jun N-terminalna kinaza 1/2 (JNK1/2), Pparg koaktivator 1 alfa (PGC-1), mitohondrijski kompleks I (NDUFB8), mitohondrijski kompleks II (SDHB), mitogenom aktivirana protein kinaza 1/2 (ERK1) /2), geni neutrofilne želatinaze lipokalina (NGAL) i molekule za oštećenje bubrega-1 (KIM-1). Svi geni od interesa su normalizirani u odnosu na beta-aktin. Višestruke promjene ekspresije gena uspoređene su sa lažno operiranim štakorima i izračunate su pomoću ΔΔCt metode.

2.7. Statistička analiza

Sve statističke analize provedene su korištenjem GraphPad (La Jolla, CA) Prism statističkog programskog paketa, verzija 9.0. Podaci o preživljenju analizirani su korištenjem Kaplan-Meierove analize preživljavanja i log rank testa, dok su podaci o ekspresiji gena qPCR analizirani korištenjem neuparenog jednosmjernog t-testa. Svi ostali podaci analizirani su korištenjem jednosmjerne analize varijance (ANOVA) praćene Tukeyjevim post-hoc testom za određivanje statističkih razlika između skupina. Statistička značajnost prihvaćena je na str<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Rezultati

3.1. Medij bez seruma nadopunjen STS-om poboljšava preživljavanje epitelnih stanica bubrežnih tubula tijekom hladne hipoksije/reoksigenacije

Analiza protočne citometrije nakon bojenja na apoptozu i nekrozu pokazala je da NRK{{0}}E stanice tretirane SF-om tijekom in vitro hladnog IRI pokazuju značajno smanjenu vitalnost stanica u usporedbi s kontrolnim (normoksičnim) stanicama (Slika 1A; p < 0.05).="" dok="" su="" svi="" eksperimentalni="" uzorci="" pokazali="" značajno="" nižu="" vitalnost="" epitelnih="" stanica="" bubrežnih="" tubula="" od="" stanica="" uzgojenih="" u="" normoksičnim="" uvjetima="" (p="">< 0.05),="" stanice="" tretirane="" sf-om="" nadopunjenim="" sa="" 150="" µm="" i="" 500="" µm="" sts="" pokazale="" su="" značajno="" veću="" vitalnost="" od="" onih="" tretiranih="" samo="" sa="" sf="" medijem="" (slika="" 1a;="" p="">< 0,05),="" što="" je="" odgovaralo="" izrazito="" smanjenoj="" apoptozi="" u="" usporedbi="" sa="" stanicama="" tretiranim="" samo="" sa="" sf="" medijem="" (slika="" 1b;="" p="">< 0,05).="" dodatno,="" čini="" se="" da="" povećanje="" vitalnosti="" stanica="" i="" smanjenje="" apoptoze="" doseže="" optimalne="" razine="" sa="" 150="" µm="" i="" 500="" µm="" sts,="" budući="" da="" je="" veća="" doza="" preokrenula="" ove="" trendove="" (slika="" 1a="" i="">

3.2. Nadopunjavanje UW otopine sa STS poboljšava rano preživljavanje i funkciju bubrežnog presatka

Očuvanje bubrežnih transplantata u otopini UW s dodatkom STS-a značajno je poboljšalo preživljavanje primatelja s 83 posto preživljenja do POD 14 (dan žrtvovanja) u usporedbi s kontrolnom skupinom bez dodatka STS-a, koja je pokazala 12,5 posto preživljenja, osobito u prva 3 dana (Slika. 2A; p < 0.05).="" osim="" toga,="" dodatak="" sts="" značajno="" je="" poboljšao="" funkciju="" presatka="" tijekom="" ranog="" razdoblja="" nakon="" transplantacije="" u="" usporedbi="" sa="" samim="" uw="" tretmanom.="" razine="" serumskog="" kreatinina="" i="" bun="" bile="" su="" značajno="" povećane="" iu="" uw="" i="" uw="" plus="" sts="" grupama="" na="" pod="" 3,="" što="" je="" koreliralo="" sa="" smanjenom="" osmolalnošću="" urina="" u="" usporedbi="" sa="" shamom="" (slike="" 2b,="" c="" i="" 3a;="" p="">< 0.{{25="" }}5).="" međutim,="" razine="" kreatinina="" i="" bun="" u="" serumu="" u="" skupini="" koja="" je="" primala="" uw="" plus="" sts="" značajno="" su="" se="" smanjile="" na="" pod="" 3="" s="" odgovarajućim="" povećanjem="" osmolalnosti="" urina="" u="" usporedbi="" sa="" skupinom="" koja="" je="" primala="" uw="" (slika="" 2b,="" c="" i="" 3a;="" p="">< 0,05).="" zanimljivo="" je="" da="" su="" se="" razine="" serumskog="" kreatinina="" i="" bun-a="" u="" skupini="" uw="" plus="" sts="" postojano="" smanjivale="" od="" pod="" 3="" do="" pod="" 14="" s="" povećanom="" osmolalnošću="" urina="" i="" bile="" su="" usporedive="" s="" onima="" u="" shamu="" (slike="" 2b,="" c="" i="" 3a).="" također,="" izlučivanje="" urina="" u="" uw="" plus="" sts="" grupi="" bilo="" je="" značajno="" veće="" tijekom="" prva="" četiri="" postoperativna="" dana="" u="" usporedbi="" s="" uw="" i="" sham="" grupama="" (slika="" 3b;="" p=""><0,05). međutim,="" postojano="" se="" smanjivao="" prema="" početnoj="" (sham)="" vrijednosti="" i="" bio="" je="" usporediv="" s="" onom="" za="" sham="" na="" pod="" 14,="" dok="" je="" količina="" urina="" u="" preživjelih="" štakora="" u="" uw="" skupini="" ostala="" viša="" od="" osnovne="" vrijednosti="" na="" pod="" 14="" (slika="">

3.3. Dodatak STS otopini UW ublažava transplantacijom izazvanu staničnu smrt nakon transplantacije bubrega

Sekcije bubrega dobivene na POD 3 i 14 obojene su s TUNEL kao mjerom apoptotičke stanične smrti i ocijenjene od strane zaslijepljenog bubrežnog patologa (Slika 4A). Bubrežni presaci iz UW skupine pokazali su značajno veću apoptotičku staničnu smrt na POD 3 kao što je naznačeno višim rezultatom TUNNEL u usporedbi s bubrezima iz UW plus STS i Sham grupa (Slika 5A i b; p < 0.{{11}="" }5).="" presadci="" iz="" skupine="" uw="" plus="" sts="" nisu="" se="" značajno="" razlikovali="" u="" usporedbi="" s="" onima="" iz="" shama="" u="" istoj="" vremenskoj="" točki="" i="" na="" pod="" 14="" (slika="" 4b).="" dodatno,="" dok="" su="" transplantati="" iz="" uw="" i="" uw="" plus="" sts="" grupa="" pokazali="" značajno="" povećane="" rezultate="" atn="" na="" pod="" 3="" u="" usporedbi="" sa="" skupinom="" sham="" (slika="" 5;="" p="">< 0.05),="" uw="" plus="" sts="" graftovi="" pokazali="" su="" smanjene="" rezultate="" atn="" na="" pod="" 3="" u="" usporedbi="" s="" uw="" (slika="" 5;="" p="">< 0,05).="" također,="" dok="" primatelji="" uw="" transplantata="" nisu="" preživjeli="" do="" pod="" 14,="" pa="" se="" stoga="" njihovi="" atn="" rezultati="" nisu="" mogli="" odrediti="" na="" pod="" 14,="" oni="" s="" uw="" plus="" sts="" transplantatima="" preživjeli="" su="" do="" pod="" 14,="" ali="" su="" pokazali="" značajno="" povećane="" atn="" rezultate="" u="" usporedbi="" sa="" skupinom="" sham="" (slika="" 5;="" p=""><>

3.4. Bubrežni presaci sačuvani u otopini UW s dodatkom STS-a pokazali su smanjene markere ozljede i upalni infiltrat nakon transplantacije bubrega

Presjeci bubrega dobiveni na POD 3 i 14 obojeni su KIM-1 kako bi se otkrila proksimalna tubularna ozljeda, kao i CD68 (makrofagni marker) i MPO (neutrofilni marker), a ocjenjivao ih je slijepi bubrežni patolog (Slike 6A, 7A, i C). Ekspresija KIM-1, CD68 i MPO u bubrežnom tkivu bila je značajno viša u skupini UW na POD 3 u usporedbi s onima u skupinama UW plus STS i Sham (slike 6B, 7B i D; p < {{11}="" }.05)="" dok="" se="" ekspresija="" ovih="" markera="" u="" uw="" plus="" sts="" presacima="" nije="" značajno="" razlikovala="" u="" usporedbi="" sa="" shamom="" na="" pod="" 14="" (slike="" 6b,="" 7b="" i="" d;="" p=""> 0,05).

3.5. STS-suplementacija UW otopini potisnula je bubrežnu ekspresiju proupalnih, proapoptotskih i mitohondrijskih gena

Ekspresija gena proupalnih, proapoptotskih, ciljanih na mitohondrije i markera oštećenja bubrega određena je putem qRT-PCR u transplantiranim bubrezima dobivenim na POD 3. Ekspresija proupalnih gena IFN-, TNF- i IL{{8 }} bili su značajno povećani u UW presacima u odnosu na UW plus STS presatke na POD 3 (Slika 8A; p < 0.05)="" i="" slijedili="" su="" isti="" obrazac="" s="" pro-apoptotskim="" genima="" parp,="" bax="" ,="" kaspaze-3,="" bid,="" jnk1="" i="" jnk2="" (slika="" 8a;="" p="">< 0.05)="" dok="" je="" ekspresija="" anti-apoptotičkog="" bcl-2="" bila="" blago="" povećana="" u="" uw="" plus="" sts="" grupa="" u="" usporedbi="" s="" uw="" grupom,="" iako="" ovo="" povećanje="" nije="" doseglo="" statistički="" značaj="" (slika="" 8a).="" osim="" toga,="" ekspresija="" mitohondrijskih="" gena="" pgc-1,="" ndufb8="" (kompleks="" i)="" i="" sdhb="" (kompleks="" ii)="" u="" uw="" presacima="" značajno="" je="" smanjena="" u="" usporedbi="" s="" uw="" plus="" sts="" presacima="" (slika="" 8b;="" p="">< 0="" .05)="" dok="" je="" obrnuto="" primijećeno="" s="" izrazima="" erk1="" i="" erk2="" (slika="" 8b;="" p="">< 0,05).="" nadalje,="" ekspresija="" gena="" kim-1="" u="" presacima="" uw="" bila="" je="" značajno="" povećana="" u="" usporedbi="" s="" transplantatima="" uw="" plus="" sts="" (slika="" 8c;="" p="">< 0,05),="" dok="" smanjena="" ekspresija="" ngal="" u="" transplantatima="" uw="" plus="" sts="" nije="" dosegla="" statističku="" značajnost="" u="" usporedbi="" s="" onom="" u="" uw="" presaci="" (slika="" 8c;="" p=""> 0,05).

4. Rasprava

Ova studija utvrđuje nadopunu standardne otopine za očuvanje sa STS, klinički održivim darivateljem H2S odobrenog od strane FDA, kako bi se ublažio hladni bubrežni IRI izazvan transplantacijom, poboljšala kvaliteta presatka i produžilo preživljavanje primatelja. Koristeći in vitro model bubrežnog IRI-ja i štakorski model singeneičke ortotopske transplantacije bubrega, po prvi put pokazujemo da suplementacija UW otopine sa STS-om tijekom produljenog SCS-a štiti organe i organe.

Primarni nalaz u našem in vitro modelu je da dodatak STS medijima bez seruma štiti epitelne stanice bubrega od hipoksije hladnom i apoptoze inducirane toplom reoksigenacijom i povećava vitalnost, što je u skladu s našom prethodnom studijom u kojoj smo pokazali zaštitne učinke mitohondrija -ciljani donorski lijek H2S, AP39, u in vitro modelu hladnog bubrežnog IRI [20]. Zanimljivo je da je viša koncentracija STS-a od 1 mM poništila korisne učinke, implicirajući da STS pokazuje dvofazni fenomen doze-odgovora koji se naziva hormeza, u kojem je niža koncentracija citoprotektivna, dok je viša koncentracija citotoksična. Oštećenje mitohondrija glavna je posljedica bubrežnog IRI-ja, budući da propusnost mitohondrija može inhibirati proizvodnju adenozin trifosfata (ATP) i povećati stvaranje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), destruktivnog posrednika ozljede tkiva [13]. Nedavno je sugerirano da su mitohondriji primarno mjesto aktivnosti OPS. Ne samo da je poznato da STS stvara H2S u mitohondrijima putem redukcije ovisne o glutationu i obrnuto kroz put oksidacije sulfida, već također čuva sintezu mitohondrijskog ATP-a, smanjuje proizvodnju ROS-a i poboljšava složene enzimske aktivnosti u lancu prijenosa elektrona (ETC) [24]. ,28–30]. Osim toga, nedavne studije su pokazale da je STS značajno povećao ekspresiju PGC-1, pozitivnog regulatora mitohondrijske biogeneze i proizvodnje ATP-a [26], što je u skladu s našim in vivo promatranjem. Ovi molekularni mehanizmi mogli bi objasniti značajno povećanu ekspresiju mitohondrijskih ETC kompleksa I i II (NDUFB8 odnosno SDHB) u našem modelu transplantacije bubrega s povećanim preživljavanjem i funkcijom kao što je uočeno u bubrežnim presacima sačuvanim u UW otopini s dodatkom STS-a.

Na temelju naših in vitro rezultata, odlučili smo istražiti je li zaštitni učinak STS primjenjiv in vivo korištenjem transplantacijskog modela gdje hladni IRI glavni doprinosi disfunkciji transplantacije i povećanim komplikacijama nakon transplantacije. Naša otkrića pokazuju da produženi (24 h) SCS bubrežnih presatka u otopini UW s dodatkom STS-a značajno poboljšava kvalitetu i funkciju presatka karakteriziranu sniženim razinama serumskog kreatinina i BUN-a, većom količinom urina i produljenim preživljavanjem primatelja u usporedbi s presadcima sačuvanim samo u otopini UW . Važno je napomenuti da je trenutno izlučivanje urina čak i nakon kliničke transplantacije bubrega kritičan ishod koji određuje je li potrebna dijaliza za rješavanje odgođene funkcije presatka (DGF). Stoga, naše opažanje da STS povećava izlučivanje urina odmah nakon transplantacije i usporedivo je sa skupinom Sham na POD 14 obećavajuće otkriće. Uočeno poboljšanje bubrežne funkcije nakon transplantacije transplantata sačuvanih u STS-dopunjenoj UW otopini također je donijelo značajnu prednost u preživljavanju. Kvantitativno, dodatak STS-a produžio je život transplantata tako da je 83 posto (5/6) štakora koji su primili UW plus STS transplantate preživjelo do POD 14 (dan žrtvovanja) u usporedbi sa samo 12,5 posto (1/8) štakora primatelja transplantati konzervirani u UW otopini bez dodatka STS. Ovaj nalaz iz ove studije također je u skladu s našom prethodnom studijom, u kojoj je samo 14 posto (1 od 7) štakora primatelja transplantata bilo sačuvano u UW otopini 24 sata bez dodatka H2S (GYY4137), preživjeli su do POD 14 [20] .

Uz pokazivanje poboljšanja parametara bubrežne funkcije, dodatak STS-a također je inhibirao apoptozu i upalu bubrežnog presatka tako što je smanjio tkivnu ekspresiju pro-apoptotskih i pro-upalnih gena, dok je istovremeno pojačao anti-apoptotičke gene i smanjio CD68-pozitivne makrofage i MPO-pozitivni neutrofili, što je sveukupno rezultiralo smanjenom ekspresijom KIM-1 i ATN-a i u konačnici očuvanom morfologijom bubrega. Poznato je da su ovi upalni citokini posrednici stanične smrti tijekom hladnog IRI [31], a njihovo smanjenje u UW plus STS presacima vjerojatno je posljedica dobro poznatih karakteristika STS da smanjuje endotelnu propusnost u vaskularnom endotelnom monosloju, atenuira proizvodnju citokina , i potaknuti proizvodnju protuupalnih citokina [32]. Također, naše otkriće da dodatak STS-a UW otopini smanjuje ekspresiju proupalnih gena podudara se s onom iz prethodne studije o protuupalnoj aktivnosti STS-a smanjenjem razina TNF-a i IL-6 u neurološkim bolestima [33]. ,34]. Mehanički gledano, STS inaktivira kaspazu-3 pričvršćivanjem za njezino aktivno mjesto putem jakih vodikovih veza i time sprječava pristup prirodnog supstrata aktivnom mjestu, u konačnici zaustavljajući apoptozu [35]. STS također blokira aktivaciju JNK, proteina koji ima ključnu ulogu u apoptotskoj signalizaciji [35], što podupire naše otkriće o smanjenom učinku STS-a na kaspazu3 i JNK. Međutim, nismo u mogućnosti utvrditi jesu li takvi mehanizmi operativni u ovoj studiji budući da nismo izvršili dodatne pokuse za istraživanje tih molekularnih mehanizama.

Glavno ograničenje našeg in vitro eksperimenta je naš tehnički izazov korištenja trenutne standardne temperature čuvanja od 4 ◦C [36], budući da je 10 ◦C koje smo koristili bila najniža temperatura koja se tehnološki mogla postići bez ugrožavanja hipoksičnog okoliša. Ovo je stvarna razlika u odnosu na stanične fiziološke procese i također u tehnikama očuvanja. Potencijalno rješenje je korištenje kemijski inducirane hipoksije u plastičnoj vrećici i stavljanje u hladnjak na 4 ◦C kako bi odražavala kliničke postavke SCS-a. Međutim, ove vreće za stvaranje anaerobne atmosfere dizajnirane su za korištenje na visokim temperaturama (21–37 ◦C) budući da kemijski spojevi koji induciraju hipoksičnu okolinu funkcioniraju pod tim uvjetima. Buduće studije trebale bi ciljati na optimizaciju temperature u hipoksijskoj komori kako bi oponašala kliničke postavke SCS-a. Postizanje konzistentne temperature od 4 ◦C bez ugrožavanja hipoksičnog okoliša omogućit će nam da odredimo jesu li promatrani fenotipovi u eksperimentalnom in vitro hladnom IRI modelu dosljedno izraženi. Osim in vitro eksperimenta, naš model transplantacije štakora također nije bez nedostataka. Izvršili smo singenu transplantaciju bubrega (genetski identični davatelji i primatelji s imunološkom kompatibilnošću), koja je primjenjiva samo na jednojajčane blizance u kliničkoj transplantaciji bubrega, dok je većina kliničkih transplantacija bubrega alogena (genetski različiti davatelji i primatelji). Alogena transplantacija prisiljava primatelje transplantata da se podvrgnu imunološkim testovima prije transplantacije kako bi se identificirali donorovi humani leukocitni antigeni (HLA; molekule koje induciraju i reguliraju imunološki odgovor), utvrdila imunološka kompatibilnost između donora i primatelja i izbjeglo odbacivanje organa [37,38]. Buduće studije koje koriste STS trebale bi razmotriti alogenu transplantaciju. Drugi ograničeni model transplantacije bubrega je činjenica da smo se usredotočili na žive darivatelje, sub-optimalni presaci od darivatelja nakon srčane smrti (DCD) postaju sve češći kao izvor bubrega darivatelja u mnogim transplantacijskim centrima diljem svijeta [39]. DCD izlaže donorske organe različitim razdobljima tople ishemije uz hladne ishemijske periode tijekom SCS-a, te je povezan s povećanim stopama DGF-a i smanjenim preživljavanjem presatka u usporedbi sa živim darivateljima [40]. Stoga bi buduće studije trebale razmotriti DCD model transplantacije bubrega kako bi se procijenio učinak STS-a na IRI u ovom modelu.

Zaključno, naša studija pokazuje da nadopuna standardne otopine za očuvanje klinički održivim lijekom za donore H2S tijekom produljenog SCS bubrežnih presatka štiti od hladnog bubrežnog IRI izazvanog transplantacijom, poboljšava ukupnu kvalitetu presatka i funkciju presatka i produljuje preživljenje primatelja transplantata. Uzimajući u obzir da se rizik od DGF-a povećava s produljenim hladnim ishemijskim vremenom u kliničkoj transplantaciji bubrega, što izaziva veliku kliničku zabrinutost, zapažanje da STS štiti bubrežne presatke tijekom produljenog SCS-a i sprječava DGF nakon transplantacije daje veliko kliničko obećanje koje bi moglo smanjiti ili spriječiti učestalost DGF-a u kliničkoj transplantaciji bubrega u bliskoj budućnosti. Stoga bi buduća korist od dodavanja STS-a rješenjima za očuvanje mogla predstavljati potencijalno rješenje za ovaj tekući problem. Sveukupno, ova studija pridonosi rastućoj literaturi koja podupire citozaštitne učinke STS-a i drugih H2S donora protiv IRI organa, posebno poboljšavajući ishode presađivanja kod hladnog IRI bubrega izazvanog transplantacijom. Ove strategije mogle bi olakšati korištenje većeg broja transplantata izloženih produljenim hladnim ishemijskim vremenima, što bi moglo povećati skup organa za presađivanje.

Izjava o autorskom doprinosu CrediT-a

Svi autori pristali su na predaju ovog rukopisa. Nema sukoba interesa.

Reference

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford i sur., Usporedba mortaliteta kod svih pacijenata na dijalizi, pacijenata na dijalizi koji čekaju transplantaciju i primatelja prve kadaverične transplantacije, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll i sur., Sustavni pregled: transplantacija bubrega u usporedbi s dijalizom u klinički relevantnim ishodima, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte, et al., Isplativost transplantacije bubrega iz DCD-a u Italiji, Transplant. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Ischemia-reperfuzion injury, Eur. J. Trauma Emerg. Surg. 33 (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Očuvanje organa: trenutni koncepti i nove strategije za sljedeće desetljeće, Transfus. Med. Hemother. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Hladna ishemija i smanjeno dugoročno preživljavanje kadaveričnih bubrežnih alografta, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo, et al., Glavni učinci odgođene funkcije presatka i vremena hladne ishemije na preživljavanje bubrežnog alografta, Nephrol. Biraj. Presaditi. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Utjecaj vremena hladne ishemije na preživljavanje transplantata među primateljima presađene ECD: analiza uparenog bubrega, Am. J. Transplant. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Čimbenici rizika primatelja povezani s odgođenom funkcijom presatka: analiza uparenog bubrega, Transplantacija 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay, et al., Svaki dodatni sat vremena hladne ishemije značajno povećava rizik od zatajenja presatka i smrtnosti nakon transplantacije bubrega, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezić, I. Spasojević, V. Ležaić, M. Bajčetić, Mitochondria-targeted antioxidants: future perspectives in kidney ischemia-reperfuzion injury, Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Oksidativni stres uzrokovan mitohondrijskim preopterećenjem kalcijem, Ann. NY Acad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Uloga mitohondrija u ishemiji/reperfuzijskoj ozljedi, Transplantacija 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Emerging role of gasotransmitters in renal transplantation, Am. J. Transplant. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Hydrogen sulfide and cell signaling: team player or referee? Plant Physiol. Biochem. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, Vazorelaksirajući učinak H(2)S kao novog endogenog otvarača plinovitih K(ATP) kanala, EMBO J. 20 (21) (2001.) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter, et al., Liječenje vodikovim sulfidom ublažava ishemijsko-reperfuzijsku ozljedu bubrežnog alografta tijekom hladnog skladištenja i poboljšava ranu funkciju bubrega transplantata i preživljavanje nakon alogene transplantacije bubrega, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Dodatni hidrogen sulfid štiti funkciju presađenog bubrega i produljuje preživljenje primatelja nakon produljene ozljede hladnom ishemijom-reperfuzijom ublažavanjem apoptoze bubrežnog presatka i upale, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187-E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian, et al., Sumporovodik štiti bubrežne presatke od produljene ozljede hladnom ishemijom-reperfuzijom putem specifičnih mitohondrijskih djelovanja, Am. J. Transplant. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Natrijev tiosulfat za akutno trovanje cijanidom: studija na modelu štakora, Ann. Pharm. Fr. 63 (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri, et al., Natrijev tiosulfat štiti od oštećenja bubrega nakon hipertermijske intraperitonealne kemoterapije (HIPEC) s cisplatinom, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897–902.