Jasna slika i kvantifikacija bubrega u 3D
Feb 27, 2022
Desetljećima, mjerenja odbubregmikroanatomija koja koristi 2-dimenzionalne presjeke pružila nam je detaljno znanje o bubreg morfologija u fiziološkim i patološkim uvjetima. Međutim, brzi razvoj metoda čišćenja tkiva posljednjih godina, u kombinaciji s razvojem novih 3-modaliteta dimenzionalne slike, omogućili su nove uvide ububregstruktura i funkcija. Ovaj pregledni članak opisuje niz novih uvida ububregrazvoja i bolesti dobivenih nedavno korištenjem ovih novih metodoloških pristupa. Na primjer, u razvojububregovi su pristupi pružili nova razumijevanja morfogeneze grananja uretera, proliferacije i predanosti stanica preteče nefrona, interakcija između stanica vrha uretera i stanica preteći nefrona, te uspostavljanje segmentacije nefrona. U cijelom odraslom mišububrega, čišćenje tkiva u kombinaciji sa svjetlosnom mikroskopijom može prikazati i kvantificirati ukupan broj glomerula, što je veliki napredak u ovom području. Slični pristupi pružili su nove uvide u strukturu bubrežne vaskulature i inervacije, tubulointersticijskog preoblikovanja, gubitka i hipertrofije podocita, stvaranja cista, evolucije staničnih polumjeseca i strukture glomerularne filtracijske barijere. Još mnogo napretka u razumijevanjububregbiologije i patologije mogu se očekivati kako se razvijaju i usvajaju dodatne tehnike čišćenja i snimanja od strane više istraživača.
Ključne riječi:3D snimanje; glomerul; razvoj bubrega; nefropatologija; čišćenje tkiva; tubuli; bubrežni
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI FUNKCIJU BUBREGA/BUBREGA
Ukupan broj nefrona u svakog normalnog čovjekabubregkreće se od približno 200,000 do više od 2 milijuna, 1 u prosjeku približno 1 milijun. Ovi nefroni kao i druge komponentebubreguključujući sabirne kanale, krvne žile, međuprostor i živčana vlakna raspoređeni su s izuzetnom mikroanatomskom preciznošću. 2 Ovaj precizni uzorak podupire normalnorad bubregai zdravlje, koje može biti ozbiljno narušeno kada je arhitektura tkiva promijenjena zbog glomerularne ili tubularne hipertrofije ili skupljanja, gubitka nefrona, kongenitalnih abnormalnosti, razrjeđivanja žila i intersticijske fibroze. Niz pristupa slikanju pridonio je našem sveobuhvatnom razumijevanjububregmikroanatomije tijekom razvoja te u zdrave i bolesne odrasle osobebubreg. Uglavnom, ovo razumijevanje dolazi iz analize 2-dimenzionalnih (2D) presjeka bilo da se radi o svjetlosnim ili elektronskim mikroskopskim fizičkim presjecima ili konfokalnim optičkim presjecima. Kvantifikacija ove mikroanatomije uglavnom je ovisila o stereološkim analizama presjeka koje su dale procjene broja, duljina, površina i volumena glomerula, tubula, žila, intersticija i njihovih staničnih komponenti. 3,4 Donedavno je 3D vizualizacijabubregmikrostruktura je uglavnom bila ograničena na konfokalnu mikroskopiju, koja omogućuje optičko rezanje i 3D rekonstrukciju do dubine od 50 do 80 m m. Nažalost, svojstva loma proteinskih i lipidnih komponenti unutar tkiva raspršuju svjetlost i dramatično smanjuju kvalitetu slike kako se dubina povećava. Posljednjih godina razvijen je niz metoda čišćenja za uklanjanje sadržaja lipida i pigmenta u tkivu i usklađivanje svojstava loma tkiva i medija za postavljanje kako bi tkivo postalo prozirno. 5 Metode čišćenja variraju u složenosti od inkubacije tkiva u različitim otopinama tijekom razdoblja od nekoliko sati do produženih postupaka koji uključuju prilagođenu elektrokemijsku opremu. Čitatelje usmjeravamo na nedavne recenzije 5,6 za detaljan pregled trenutnih metoda i ovdje citirane radove za specifične metode i slučajeve uporabe.
Subcelularne strukture i cijele populacije stanica mogu se razlučiti unutar očišćenih cijelih organa ili debelih presjeka. Točne značajke snimanja unutar očišćenog tkiva zahtijevaju specijalizirane mikroskope i obradu slike za hvatanje i rekonstrukciju volumetrijskih podataka iz uzoraka čija veličina može varirati od stotina mikrona do centimetara. Konfokalni mikroskopi s točkastim skeniranjem i rotirajućim diskom učinkovito su korišteni za prikaz značajki unutar pročišćenog prostorabubregtkiva, ali pate od smanjene rezolucije u osi Z i progresivnog smanjenja intenziteta fluorescencije na dubini zbog jedne osi osvjetljenja i snimanja. Tehnike svjetlosne mikroskopije posebno su prikladne za snimanje očišćenih tkiva jer omogućuju brzo dobivanje velikih 3D volumena i mogu uključivati višekutno osvjetljenje i snimanje. Optička projekcijska tomografija još je jedan pristup koji uključuje višekutno snimanje i digitalnu rekonstrukciju za proizvodnju podataka u kojima su X, Y i Z osi svakog voksela iste rezolucije. Bez obzira na specifičan pristup, čišćenje tkiva i oslikavanje cijelog sloja pružaju novu priliku za istraživanje neistraženog staničnog mikrookruženja i strukture tkiva višeg reda. U ovom pregledu ističemo neke nove uvide ububregrazvoj, odraslibubregstrukture i patologije koje su nastale čišćenjem tkiva nakon čega slijedi 3D kvantitativna analiza.
Nova saznanja o razvoju bubregaDesetljeća profiliranja ekspresije gena i istraživanja nokauta dovela su do detaljnog razumijevanja tipova stanica, regulacijskih mreža gena i signalnih putova koji kontroliraju sisavcebubregrazvoj. Ovo je znanje informiralo o dijagnozi kongenitalne bolesti i omogućilo proizvodnjububregvrste stanica iz pluripotentnih matičnih stanica. 7 Međutim, veličina, neprozirnost i složenost razvojabubregpredstavlja značajnu prepreku za precizno mjerenje morfogeneze ovog organa i 3D distribucije stanica i proteina unutar njega. Primjena čišćenja tkiva i snimanja u više razmjera ububregomogućio je vizualizaciju i kvantitativnu analizu morfogeneze grananja uretera, populacija progenitorskih stanica i nadarenosti nefrona unutar intaktnih organa (Slika 1). 8 Ovi pristupi podupiru novi kapacitet za precizno fenotipiziranje i otvaraju puteve za analizu staničnih i molekularnih pokretačabubregrazvoja i urođene bolesti.
Snimanje i analiza morfogeneze grananja u 3D.Uspostava ureterskog stabla definirajuća je značajkabubregrazvoj i opsežno je proučavan korištenjem mišje genetike i spljoštenbubregeksplantacijske kulture. Međutim, razumijevanje kako pojedinačni geni doprinose rastu, obliku i uzorku ove razgranate epitelne strukture kanala in vivo zahtijevalo je sposobnost slikanja i analize ove složene mreže u širokom rasponu veličina uzoraka. Short i sur. 8 se pozabavio ovim problemima korištenjem cjelokupne imunofluorescencije, čišćenja na bazi otapala (benzil alkohol benzil benzoat) i snimanja cijelih organa pomoću optičke projekcijske tomografije. Upotrebom ovog pristupa za snimanje 3D snimaka od početka do sredinebubregrazvojem, tim je razvio prilagođeni softver za analizu kako bi dobio neviđene detalje o stablu uretera uključujući broj vrhova, kutove i duljinu grana, volumen grana i broj generacija grananja iz intaktnih stabala uretera (Slika 1c i d). 8 U početku korišten za karakterizaciju i identificiranje novih aspekata bubrežnog grananja, 9,10 tekući napori nastoje definirati principe i ključne regulatore koji upravljaju strukturom grananja in vivo. 1
Povezivanje dinamike progenitora s morfogenezom organa s prikazom u više razmjera.Molekularne interakcije između stanica vrha ureterika i stanica preteča nefrona igraju glavnu ulogu u uspostavljanju komplementa nefrona koji olakšavajurad bubregau odraslom životu. Neinducirani progenitori nefrona proizvode čimbenike koji potičububregrast kroz grananje uretera, dok prostorno ograničeni znakovi unutar vrha uretera održavaju stanje pretka nefrona i potiču diferencijaciju podskupa tih preteča u rani nefron. Ove interakcije pokreću ciklus grananja i indukcije nefrona koji prestaje oko rođenja, kada se preostali nefronski progenitori diferenciraju. Prije metoda čišćenja tkiva, naše razumijevanje dinamikebubregmorfogeneza i relativna brojnost populacija progenitorskih stanica tijekom vremena bila je ozbiljno ograničena. Ovo se promijenilo s razvojem pristupa slikanju u više razmjera koji koriste proširene protokole imunofluorescencije, čišćenje tkiva i pristupe slikanju za kvantificiranjebubregrazvoj na staničnoj (konfokalnoj) i razini cijelog organa (optička projekcijska tomografija, svjetlosni list). 9,10 Postalo je očito da su stopebubregrast dramatično varira s inicijalno brzim grananjem i stopama proliferacije koja opada u fazama koje koreliraju sa smanjenjem broja progenitorskih stanica unutar nefrogene niše. 10 Trodimenzionalna konfokalna slika očišćenog cijelog ljudskog fetusabubrega(11. tjedan) ili uzorci izbubregkorteksa (tjedni 11-23) potvrđuju da je ovo smanjenje veličine niše očuvano među vrstama. 12 Daljnja komparativna analiza ljudske i mišje nefrogene niše u očišćenom tkivu dovela je do novog vremenskog regrutacijskog modela formiranja nefrona, pri čemu se progenitorske stanice postupno dodaju ranom nefronu i usvajaju identitet segmenta prema redoslijedu kojim stižu. . 13 U drugoj studiji usmjerenoj na predanost progenitora nefrona, metoda čišćenja tkiva temeljena na hidrogelu (pasivni Clear Lipid-exchanged Acryl-amide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/In situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel [CLARITY] 14) korištena je za njegovu sposobnost zadržavanja fluorescencije endogenog tdTomato reportera. Analiza tdTomato-označavanja unutar očišćenog tkiva pokazala je da se stanice unutar nefrona ranog stvaranja mogu vratiti u stanje pretka, gdje su prethodni rezultati sugerirali da je predanje jednosmjerno. 15 Stoga je čišćenje tkiva poboljšalo naše razumijevanje dinamičkih razvojnih procesa u razmjerima i vrstama.
Precizna fenotipizacija. Napredak u čišćenju tkiva i kvantitativnoj analizi omogućio je novu sposobnost za preciznu fenotipizaciju. Statistički snažne promjene u grananju i broju nefrona identificirane su u mišjim modelima sa suptilnim fenotipovima kao što je Ret þ/? i Šest2 þ/? miševa (Slika 2), koji su prethodno bili klasificirani kao "normalni". 10,16 Konfokalna slika visoke rezolucije očišćenog Wnt11 ?/?bubregaidentificirali su novi stanični fenotip gdje se nefronski progenitori čine neorganiziranim zbog nemogućnosti stvaranja stabilnih staničnih veza s vrhom uretera i prerane diferencijacije. 17 Ove su metode također korištene za kvantificiranje utjecaja novih regulatora stanja stanica preteče nefrona kao što su DNA metiltransferaza 1, mikroRNA Lin28 i Let7 te TSC1bubregrazvijenost i broj nefrona. 18-20 Precizno fenotipiziranje vjerojatno će postati važan alat u našim nastojanjima da razumijemo aditivni učinak genetskih i okolišnih čimbenika koji doprinose niskom broju nefrona i sklonosti kroničnombolest bubrega.
Matematičko modeliranjebubregmorfogeneza. Podaci se proizvode iz očišćenog razvojabubregpotiču val matematičkog modeliranja temeljenog na slikama koje pokušava razlučiti kako makroskopski oblik i funkcija tkiva proizlaze iz molekularnih interakcija između populacija stanica preteča. 11,21–23 Daljnja primjena snimanja cijelog organa u očišćenom tkivu bit će ključna za razumijevanje molekularnih i staničnih pokretača 3D uzorka tkiva i može biti ključ za poboljšanje strukture i točnosti modela matičnih stanicabubreg.
3D morfologija i patologija bubrega odraslihZamršena morfologija odrasle jedinkebubregograničava upotrebu 2D morfoloških alata jer mogu prenijeti nepotpune ili pogrešne percepcije 3D strukture. Ovdje raspravljamo o nekim od važnih metodoloških napretka posljednjih godina koji sada omogućuju robusnu 3D analizu struktura kod odraslihbubreg, u rasponu od netaknutogbubregapa sve do komponenti barijere glomerularne filtracije (Slika 3). 2
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI ZATAJENJE BUBREGA/BUBREGA
Broj i veličina nefrona.Čovjekbubregpokazuje visoku razinu intra- i inter-subjektne varijabilnosti u broju i volumenu nefrona, što je opisano u obdukcijskim studijama subjekata bez očitogbolesti bubrega1,30,31 i povezuje se s razvojnim poremećajima. Desetljećima je zlatni standardni alat za kvantificiranje broja nefrona u eksperimentalnim i ljudskim uzorcima bila metoda disektora/frakcionara, stereološka metoda zasnovana na dizajnu. 3,4 Iako je ovaj pristup točan i precizan, također je praktičan, dugotrajan i zahtijeva značajnu obuku. Iz tog razloga, predloženi su alternativni pristupi za osmišljavanje učinkovitih metoda koje mogu pružiti visokokvalitetne krajnje točke: 32 na primjer, kombinacije metoda optičkog čišćenja, uključujući hidrofobne (prethodno poznate kao na bazi otapala), hidrofilne ili na bazi hidrogela, s naprednim svjetlosna mikroskopija (npr. konfokalna, višefotonska ili svjetlosna mikroskopija).
Prema našim saznanjima, prvo izvješće koje je kombiniralo optičko pročišćavanje i mikroskopiju svjetlosnog lista za analizu broja i veličine nefrona objavili su Klingberg i sur. 24 u značajnom dokumentu koji je sadržavao više važnih napredaka. Prvo, ovo je izvješće predstavilo etil cinamat, bezopasno otapalo koje bi moglo zamijeniti otrovne kemikalije kao što je benzil alkohol–benzil benzoat, koji se do tada redovito koristio u protokolima hidrofobnog čišćenja. Drugo, istraživači su izveli brojanje nefrona u netaknutom mišububrezi in agresivan i progresivan model imunološki posredovanogbolest bubrega, identificirajući gubitak nefrona tijekom tijeka bolesti. Osim toga, uvedeni su značajni koraci prema kompjuteriziranoj automatizaciji algoritama za segmentaciju slike, što je omogućilo put do značajnih poboljšanja učinkovitosti. Nedavno su Østergaard i sur. 25 predstavili su sličnu hidrofobnu metodu čišćenja u kombinaciji sa svjetlosnom mikroskopijom i automatiziranom segmentacijom slike koja daje i ukupni broj nefrona i pojedinačni glomerularni volumen u mišjem modelu dijabetičke nefropatije. Nadalje, ova je studija pokazala elegantno funkcionalno označavanje proksimalnih tubula putem in vivo injekcije albumina za vizualizaciju glomerularnotubularnog spoja i jednostavan protokol za korelativnu histopatologiju u istim optički očišćenim uzorcima. Ovo izvješće pokazuje fleksibilnost ovih protokola, koji postaju višeslojni cjevovodi za sveobuhvatno profiliranje tkiva.
Bubrežna vaskulatura i inervacija.Slijedeći tragove grananja vaskulature ili živčanih vlakana kod odraslihbubreggotovo je nemoguće u 2D konvencionalnoj histologiji budući da veličina organa i složenost strukturne raspodjele zahtijeva opsežno i stručno serijsko presjecanje. Nedavno su Huang i sur. 33 izvijestio je o kationskoj fluorescentnoj boji blizu infracrvenog zračenja (MHI148-PEI) za specifično označavanje krvnih žila, koja se može kombinirati s modificiranim i ubrzanim protokolom čišćenja koji se temelji na etil cinamatu kako bi se skratilo vrijeme obrade tkiva. Ovaj pristup otvara nove putove za vaskularna istraživanja ububreg,posebno kada je potrebna 3D slika visoke rezolucije. Slično, Hasegawa et al. 26 koristio je Clear Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) zajedno sa posebno izrađenim sustavom svjetlosne mikroskopije kako bi identificirao distribuciju simpatičke inervacije u intaktnom bubregu miša. Simpatički živci prvenstveno su raspoređeni oko arterija. Nakon 10 dana ishemije ili reperfuzijske ozljede, gustoća simpatičke inervacije bila je značajno smanjena, u korelaciji sa smanjenim razinama norepinefrina utkivo bubrega. Te su promjene djelomično postojale 28 dana nakon početne ozljede, što sugerira da se kontinuirane simpatičke promjene mogu pronaći tijekom progresije kroničnebolest bubrega.
Tubulointersticijska remodelacija.Sustav bubrežnih tubula posebno je teško analizirati u 3D. Zamršena i složena morfologija postavlja višestruke izazove za konvencionalne metode temeljene na serijskim rezovima i standardnoj svjetlosnoj mikroskopiji. Međutim, optičko pročišćavanje omogućuje analizu netaknutih tubula i njihovog okolnog mikrookruženja. Saritas i sur. 34 izveo je kombinaciju optičkog čišćenja na bazi hidrogela i hidrofobnog pročišćavanja nakon čega je uslijedila napredna svjetlosna mikroskopija i poluautomatska 3D analiza kako bi se okarakteriziralo distalno tubularno remodeliranje zbog nedostatka kalija u prehrani. Istraživači su kvantificirali tubularnu hiperplaziju i otkrili porast proliferirajućih stanica unutar tubulointersticija. Ova studija koristila je svestranost i optičkog čišćenja i
Slika 3| Trodimenzionalna (3D) morfometrija u bubregu odrasle osobe. (a) Brojanje nefrona u cijelim bubrezima korištenjem CD31 označavanja endotelnih stanica. Ploča prikazuje 3D rekonstrukciju (lijevo), optički presjek u dvodimenzionalnom (2D) prikazu (u sredini) i posebna područja koja prikazuju pojedinačne glomerule u usporedbi između svjetlosne mikroskopije (LSFM) i konfokalne i 2- fotonska (2P) mikroskopija. Prilagođeno uz dopuštenje American Society of Nephrology, iz Journal of the American Society of Nephrology, Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Caillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, et al. ., svezak 28, broj 2, 2017; dopuštenje preneseno putem Copyright Clearance Center, Inc. 24 (b) Određivanje veličine glomerula s prostornom registracijom—kodiranje bojama predstavlja veličinu glomerula, gdje je crvena najveći objekt, a ružičasta najmanji. Prilagođeno uz dopuštenje American Society of Nephrology, iz Kidney360, Automated Image Analyses of Glomerular Hypertrophy in Mouse Model of Diabetic Nephropathy, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et al., svezak 6, izdanje 6 , 2020.; dopuštenje prenijeto putem Copyright Clearance Center, Inc. 25 (c) Praćenje vaskulature i inervacije, s 3D rekonstrukcijom netaknutog bubrega s imunološkim označavanjem simpatičkih živaca (zeleno), vaskulature (magenta) i spojenih (lijevo). Prilagođeno iz Kidney International, svezak 96, izdanje 1, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T, et al., Sveobuhvatna trodimenzionalna analiza (CUBIC-bubreg) vizualizira abnormalne bubrežne simpatičke živce nakon ishemije/reperfuzijske ozljede, stranice 129-138, Autorska prava ª 2019, uz dopuštenje Međunarodnog nefrološkog društva. 26 (d) Morfometrija podocita u pojedinačnim glomerulima korištenjem imunološkog označavanja za marker specifičan za podocite p57 (zeleno) i DNK marker 4 0,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Ploče prikazuju (lijevo) 3D rekonstrukciju i (desno) renderirane površine. Prilagođeno uz dopuštenje American Society of Nephrology, iz Journal of the American Society of Nephrology, Validation of a Three-Dimensional Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., svezak 27, broj 10, 2016.; dopuštenje preneseno putem Copyright Clearance Center, Inc. 27 (e) Stanična dinamika pomoću praćenja loze, prikazuje podocite (krajnje lijevo), parijetalne epitelne stanice (PEC) koje tvore stanične polumjesece u 3D (sredina-lijevo), 2D prikaz PEC-ova koji napadaju glomerularna strana s vaskularnom ozljedom (sredina-desno) i 2D vizualizacija tubularnog izlaza (krajnje desno). Prilagođeno iz Kidney International, svezak 96, izdanje 2, Puelles VG, Fleck D, Ortz L, et al., Nova 3D analiza korištenjem optičkog čišćenja tkiva dokumentira evoluciju mišjeg brzo progresivnog glomerulonefritisa, stranice 505–516, Copyright ª 2019, International Društvo nefrologije, pod licencom CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Vizualizacija prorezane dijafragme pri sve većim povećanjima slijeva na desno. Prilagođeno iz Kidney International, svezak 99, izdanje 4, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M, et al., Brz i jednostavan protokol za čišćenje i oticanje za 3D in situ snimanje bubrega preko skala, stranice 1010–1020 , Copyright ª 2021, Međunarodno društvo nefrologije, pod licencom CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 Kako biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte internetsku verziju ovog članka nawww.kidney-international.org.
svjetlosnu mikroskopiju za izvođenje tubularne analize u intaktnim bubrezima korištenjem ugradnje hidrogela i mikroskopije svjetlosnim pločama, kao i kvantifikaciju pojedinačnih stanica u rezovima bubrega korištenjem hidrofobnog čišćenja i konfokalne mikroskopije, jer je svaka kombinacija bila prikladnija za specifično istraživačko pitanje. Kombinacije optičkog čišćenja i napredne svjetlosne mikroskopije koristili su Tahaei i sur. 35 koji su karakterizirali spolni dimorfizam u duljini distalnog uvijenog tubula, što može odrediti njegovu sposobnost prilagodbe fiziološkom stresu, i Schuh et al. 36 koji je otkrio aksijalne razlike u preuzimanju liganda proksimalnih tubula i endolizosomskoj funkciji, naglašavajući da je segment S1 visoko specijaliziran za reapsorpciju proteina putem endocitoze posredovane receptorima. U nedavnoj studiji, Blanc i sur. 2 analizirao je model nastanka ciste, pokazujući da su se ciste razvile samo u specifičnim segmentima nefrona, koji su odredili njihov oblik i nalazili su se u blizini normalnih nedilatiranih tubula. Sve u svemu, sada imamo više primjera izravne primjene optičkog čišćenja za sustavnu analizu tubulointersticijalnog odjeljka.
Gubitak i hipertrofija podocita.Glomerul pruža jedinstven primjer za analizu intaktnih funkcionalnih jedinica unutar organa. Konkretno, proučavanje deplecije podocita izravno je imalo koristi od ovih tehnoloških dostignuća jer metodologije zasnovane na zlatnom standardu dizajna zahtijevaju značajno ulaganje vremena i resursa. 37 Prvi alat za 3D morfometrijsku analizu podocita intaktnih mišjih glomerula kombinirano imunološko označavanjebubregkriške pomoću modificiranog protokola neizravne imunofluorescencije, hidrofobnog optičkog čišćenja i konfokalne mikroskopije, što je olakšalo kvantifikaciju ukupnog broja podocita u cijelim pojedinačnim glomerulima poznatog volumena. Vjerujemo da je ovaj pristup idealan za proučavanje procesa koji utječu na određeni podskup struktura (npr. gubitak podocita koji dovodi do žarišne i segmentalne glomeruloskleroze). 27 Ista tehnika kasnije je primijenjena za karakterizaciju uloge hipertrofije podocita kao kompenzacijskog odgovora nakon gubitka podocita, mehanizma koji je posredovan metom signalnog puta rapamicina kod sisavaca. 38 Dok su se ove dvije studije usredotočile na analizu glomerularnih podocita, ovaj sustav temeljen na konvencionalnom imunoobilježavanju može se koristiti za karakterizaciju morfoloških promjena bilo koje vrste stanica u visokoj prostornoj rezoluciji.
Evolucija staničnih polumjeseca.Još jedan važan alat koji je trebalo uspješno integrirati u okvir s alatima za 3Dbubregmorfometrija je praćenje genetske loze. Većina metoda optičkog čišćenja ima tendenciju induciranja određenog stupnja gašenja fluorescencije (koje varira od blagog do jakog). 6 Nedavno smo predstavili protokol koji kombinira praćenje loze, optičko čišćenje i multifotonsku mikroskopiju za sveobuhvatnu analizu gubitka podocita i aktivacije parijetalnih epitelnih stanica. 28 U ovoj studiji, gubitak podocita identificiran je kao značajka eksperimentalnog polumjesecastog nefritisa korištenjem metaboličkog označavanja podocita s pojačanim zelenim fluorescentnim proteinom. Evolucija staničnih polumjeseca vizualizirana je i kvantificirana na temelju proliferacije i migracije parijetalnih epitelnih stanica, koje su također obilježene pojačanim zelenim fluorescentnim proteinom i praćene tijekom eksperimentalnog modela polumjesečastog nefritisa. Analiza intaktnih glomerula omogućila je identifikaciju žarišnog gubitka podocita i stvaranje lezija, koje su napredovale do tubularnih okluzija od strane parijetalnih epitelnih stanica, što je dovelo do stvaranja atubularnih glomerula. Ova studija utire put budućim studijama složenih imunološko-epitelnih interakcija unutar intaktabubrega.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNU/BUBREŽNU DIJALIZU
Barijera glomerularne filtracije.Važan dijagnostički alat za rutinsku procjenu bolesti glomerula je ultrastrukturna analiza bubrežnih biopsija elektronskom mikroskopijom. Alternativa elektronskoj mikroskopiji može se pronaći u području ekspanzijske mikroskopije, koja po definiciji ima za cilj povećanje optičke rezolucije povećanjem dimenzija tkiva. Tijekom godina, Unnersjo-Jess et al. 39,40 osigurali su višestruke protokole za vizualizaciju struktura nanorazmjera ububreg.Nedavno su ovi istraživači izvijestili o brzom i jednostavnom postupku za 3D vizualizacijububregmorfologiju, kombinirajući koncepte optičkog čišćenja i ekspanzije tkiva za razlučivanje struktura nanoskala pomoću konvencionalne konfokalne mikroskopije. 29 Ovaj je protokol primijenjen za vizualizaciju i kvantificiranje višestrukih patoloških značajki kod miša i čovjekabubregbiopsije uključujući brisanje procesa na stopalu, promjene glomerularne bazalne membrane, duljinu prorezane dijafragme, naslage IgG i klasične patološke karakteristike (npr. glomeruloskleroza, tubulointersticijska fibroza i tubularna atrofija). Ukratko, ova metoda omogućuje vizualizaciju u više razmjera i kvantifikaciju bubrežne patologije pomoću jednostavne metode i pristupačnih alata za analizu slike. Skalabilnost i implementacija ovog pristupa u kliničkoj praksi vjerojatno će biti određena potrebom za naprednom opremom za svjetlosnu mikroskopiju i razvojem automatiziranih alata za analizu slike.
Zaključak
Trenutačni spektar metoda čišćenja tkiva uključuje jednostavne tehnike koje se mogu primijeniti u većini laboratorija za poboljšanje 3D slike na uobičajenim mikroskopima. Kako prilike koje pružaju ovi novi pristupi postaju očite, očekujemo širu primjenu specijaliziranih mikroskopskih sustava za učinkovitu sliku očišćenog tkiva u visokoj rezoluciji i razvoj prilagođenih istraživanja i kliničkih tokova rada za rješavanje specifičnih pitanja. Područje neuroznanosti poslužilo je kao poligon za ispitivanje jasnih metoda i primjena snimanja tkiva. Automatizirana analiza slike, novi pristupi proučavanju stanične povezanosti i projekti atlasa ekspresije gena i proteina u cijelom tkivu razvijeni su u ovom kontekstu. Vjerojatno će slični pristupi dati nove uvide u staničnu anatomiju i međuovisnost staničnih populacija u razvoju i odraslimbubreg.
Praktična ograničenja ovog napretka uključuju cijenu hardvera za snimanje i poteškoće u rukovanju, pohranjivanju i analizi velikih skupova podataka. Ostala ograničenja proizlaze iz nedostatka ponovljivosti bojenja s tkivima na koja različito utječu uvjeti fiksacije i označavanje antitijelima. Kao rezultat toga, postoji potreba za novim 3D analizama koje treba kritički ocijeniti i usporediti s utvrđenim metodama. Unatoč impresivnom napretku u ocjenjivanjububregrazvoj i odraslibubregstrukture i bolesti istaknutih u ovom pregledu, vjerujemo da najbolje od čišćenja tkiva i 3D snimanja tek dolazi i da će vjerojatno biti uzbudljivo područje rasta zabubregistraživanja u narednim desetljećima.
